拉曼光谱成像技术具有灵敏度高、多元信号识别能力强等优势, 近年来在分子检测、疾病诊断等领域受到了广泛关注[1]。研发拉曼信号强、光学性质稳定的表面增强拉曼散射(SERS)探针是实现拉曼成像的前提和基础。传统的SERS探针主要由金(Au)、银(Ag)等贵金属纳米粒子和其表面结合的拉曼报告分子两部分组成。贵金属纳米粒子为拉曼信号增强基底, 报告分子则赋予SERS探针特征散射谱峰, 二者的光学性质对SERS探针的信号强度具有决定性影响[2, 3]。
内标化SERS探针是最近发展起来的一类新型纳米光学探针[4, 5], 其报告分子镶嵌于SERS探针结构内部[6, 7], 有别于传统SERS探针中报告分子吸附于贵金属纳米基底外层的结构。内标化SERS探针一般以金纳米球(AuNPs)或金纳米棒(AuNRs)为核心, 在其表面修饰报告分子, 进一步在复合物表面生长Au或Ag壳层, 形成AuNP@Au[8-10]、AuNR@Ag[11-13]等核壳纳米结构。该设计不仅能显著提高信号强度, 也可以提高探针在生物基质中的稳定性, 避免报告分子解离和内源物质干扰所造成的信号变化[14]。此外, 壳层贵金属的外表面裸露, 可进一步吸附待测分子生成SERS信号, 实现后续免标记传感[15-17]。
内标化探针的壳层种类对探针的性质具有重要影响。基于Au壳的内标化SERS探针生物相容性好[18], 但其壳层厚度不易精确控制, 灵敏度也较低; 基于Ag壳的内标化探针虽然生物相容性较差, 但其合成方法简单, 壳层厚度可以精确调控[19]。而且Ag的拉曼增强能力优于Au, 其信号灵敏度较Au壳包裹的探针高数十倍, 在活体深层次检测中展示了更大的优势[20]。因此, 基于银纳米材料探针的研发仍然是近年来的热点方向, 值得注意的是, 银层包覆内标化SERS探针一般在十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)体系中合成, 形成的探针表面会吸附CTAB，其细胞毒性较大[21], 导致探针难以直接用于生物标记。此外, Ag壳层的化学性质较Au更为活泼, 其氧化和溶解现象容易引起SERS探针的结构和信号变化[22-24]。
为了克服Ag壳内标化SERS探针的上述缺陷, 发挥其高灵敏度的成像优势, 本研究在合成以4-硝基苯硫酚(NT)为报告分子的Au@NT@Ag内标化SERS探针的基础上, 进一步以牛血清白蛋白(BSA)置换探针表面的CTAB, 发展了Au@NT@Ag@BSA内标化SERS探针。实验发现, Au@NT@Ag@BSA探针既保留了原探针的单分散性和高灵敏度, 又显著提高了探针的信号稳定性和生物相容性。进一步将Au@NT@Ag@BSA探针和SMMC7721肺癌细胞共孵育, 实现了细胞的探针标记和激光共聚焦显微拉曼光谱成像。研究表明, Au@NT@Ag@BSA内标化SERS探针在活体生物成像等方面展示了良好的应用潜力。
s-4800扫描电子显微镜(日本Hitachi公司), RFS 100DXR激光共聚焦显微拉曼光谱仪、FT/IR-4100傅里叶变换红外光谱仪、2000/2000C紫外-可见分光光度计、FORMA STERI-CYCLE培养箱(美国Thermo Fisher公司), Nano-ZS90马尔文电位-粒度分析仪(英国Malvern公司), InfiniteM200全功能酶标仪(帝肯上海贸易有限公司), H1650-W台式微量高速离心机(湘仪仪器有限公司), KQ-250TDB超声波清洗机(昆山超声仪器有限公司)。
氯金酸(HAuCl4·3H2O)、硝酸银(AgNO3)、硼氢化钠(NaBH4)、氢氧化钠(NaOH)和抗坏血酸(AA)均购自国药集团化学试剂有限公司, CTAB、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、NT、柠檬酸钠、二甲亚砜(DMSO)和氮蓝四唑盐(MTT)均购自阿拉丁试剂有限公司, BSA购自北京索莱宝科技有限公司, SMMC7721肺癌细胞购自中科院上海细胞库，DMEM培养基购自美国Hyclone公司, 胎牛血清(灭活)购自美国Gibco公司, 胰酶消化液、磷酸盐缓冲液(PBS)购自赛尔斯(中国)生物科技有限公司。
实验所用玻璃仪器均用新配制的王水HCl-HNO3(3:1, v/v)清洗; 实验所用的水均为二次纯化后的超纯水(18.2 MΩ·cm)。
根据文献报道[25]采用种子生长法合成16 nm AuNPs。
种子的合成：将5 mL HAuCl4(0.5 mmol/L)和5 mL CTAB(200 mmol/L)混合搅拌均匀, 向其中加入600 μL冰水配制的NaBH4溶液(10 mmol/L), 搅拌, 待溶液颜色由亮黄色变为棕色后停止搅拌, 静置3 h。
金纳米球的合成:向2 mL CTAC(200 mmol/L)与1.5 mL AA(100 mmol/L)的混合溶液中加入20 μL种子, 再加入2 mL HAuCl4溶液(0.5 mmol/L), 于27 ℃搅拌15 min, 得到16 nm AuNPs。
取1 mL 16 nm AuNPs离心水洗2次(13 000 r/min, 15 min), 弃去上清液, 重新分散在1 mL去离子水中。向上述溶液中加入50 μL 1 mmol/L NT溶液, 使NT报告分子的终浓度为0.05 mmol/L, 超声15 min。然后取1 mL所得溶液加入200 μL CTAB溶液(200 mmol/L), 以13 000 r/min离心15 min, 弃去上清液, 并用1 mL CTAB溶液(200 mmol/L)重新分散。所得溶液以13 000 r/min离心15 min, 采用CTAB溶液(200 mmol/L)分散, 重复此操作3次, 最后分散在1 mL去离子水中, 既得NT结合的金纳米球(Au@NT)。
进一步在Au@NT粒子表面包覆银层, 借鉴文献[26]方法, 分次加入不同体积的生长液。取1 mL Au@NT溶液, 加入1 mL CTAB溶液(200 mmol/L), 搅拌均匀, 依次加入30 μL AA溶液(100 mmol/L)和50 μL AgNO3溶液(10 mmol/L), 然后用NaOH溶液(100 mmol/L)将反应体系的pH值调节至10, 反应5 min，得到Au@NT@50Ag SERS探针。
另取一份Au@NT溶液采用上述相同的方法制得Au@NT@50Ag后, 继续向其中依次加入20 μL AA溶液(100 mmol/L)和50 μL AgNO3溶液(10 mmol/L), 再用NaOH溶液调节反应体系的pH值至10, 搅拌5 min后得到Au@NT@100Ag SERS探针。重复此操作, 直至AgNO3溶液加入的体积达到300、500、700和1 000 μL, 得到Au@NT@300Ag、Au@NT@500Ag、Au@NT@700Ag和Au@NT@1000Ag SERS探针。
取1 mL 16 nm AuNPs离心水洗2次(13 000 r/min, 15 min), 弃去上清液, 重新分散于1 mL去离子水中, 向其中加入1mL CTAB(200 mmol/L)溶液, 搅拌均匀, 依次加入30 μL AA溶液(100 mmol/L)和50 μL AgNO3溶液(10 mmol/L), 然后用NaOH溶液(100 mmol/L)将反应体系的pH值调节至10, 反应5 min，得到Au@50Ag纳米粒子。按照1.3节方法继续生长Ag层, 得到Au@300Ag纳米粒子。离心水洗之后分散于950 μL去离子水中, 加入50 μL 1 mmol/L的NT溶液, 使NT报告分子的终浓度为0.05 mmol/L, 超声15 min, 然后加入200 μL CTAB(200 mmol/L)溶液, 离心, 弃去上清液, 加入1 mL去离子水分散, 备用。
称取0.5 g BSA, 溶于50 mL去离子水中, 使BSA的终浓度为0.147 mmol/L, 加入0.01 g柠檬酸钠, 用NaOH溶液调节体系的pH值至7, 备用。另外称取0.05 g BSA, 溶于50 mL去离子水中, 使BSA的终浓度为0.014 7 mmol/L, 加入0.01 g柠檬酸钠, 用NaOH溶液调节体系的pH值至12, 备用。
取1.3节制备的Au@NT@700Ag SRES探针溶液1 mL, 离心(5 800 r/min, 8 min), 弃去上清液, 分散于1 mL pH 7的去离子水中, 将所得溶液逐滴加入3 mL pH 7的BSA溶液中, 搅拌均匀, 超声30 min, 然后离心(5 800 r/min, 8 min), 分散于1 mL pH 12的BSA溶液中, 静置2 h, 最后离心(5 800 r/min, 8 min), 用pH 12的去离子水洗一次, 分散于去离子水中并浓缩至500 mg/L。Au@NT@Ag@BSA SERS探针的合成过程见图 1。
培养肺癌SMMC7721细胞至对数期, 胰蛋白酶将其消化制成单细胞悬浮液, 显微镜下计数, 接种于96孔板, 调节细胞含量为7×103个/孔, 每孔加入200 μL细胞培养基, 置于含5%(体积分数)CO2的细胞培养箱内, 于37 ℃下培养24 h, 使其贴壁。
培养24 h后, 观察细胞生长状态。设置调零组、空白对照组和加样组, 调零组不添加任何试剂, 空白组加入20 μL灭菌水, 加样组分别加入20 μL系列质量浓度(5、10、100和300 mg/L)的两种SERS探针(Au@NT@Ag与Au@NT@Ag@BSA)溶液, 每个质量浓度设5个复孔, 置于细胞培养箱内, 于37 ℃培养24 h。
培养24 h后, 每孔加入20 μL质量浓度为5 g/L的MTT溶液, 放入培养箱中继续孵育4 h, 弃去上清液, 每孔加入200 μL DMSO, 置于摇床上振摇10 min, 直至结晶完全溶解, 用酶标仪测定570 nm处的吸光度A570, 5个复孔取平均值。细胞存活率=A实验组/A对照组×100%。
培养SMMC7721细胞至对数期, 胰蛋白酶消化制成单细胞悬液, 稀释后于显微镜下观察计数, 于24孔板中调节细胞含量为1.2×104个/孔, 每孔加入500 μL细胞培养基, 于37 ℃细胞培养箱内培养12 h。培养12 h后, 前12个孔分别加入100 μL Au@NT@Ag探针, 后12个孔分别加入100 μL Au@NT@Ag@BSA SERS探针, 使二者的质量浓度均为50 mg/L, 共培养3 h后, 用PBS清洗细胞两遍, 置于玻璃片上密封, 在拉曼显微镜下观察细胞形态, 记录细胞不同区域的拉曼信号。
对Au@NT@Ag SERS探针进行了理化性质和光学性质表征。采用冷场发射扫描电子显微镜测定, 得到的结果显示, AuNPs的粒径约为16 nm, 且分布均匀(见图 2a)。Au@NT@Ag的冷场发射扫描电子显微镜结果显示, Au@NT@Ag近球形, 且结构均匀, 粒径大小约为60 nm(见图 2b)。马尔文电位-粒度仪测试SERS探针结果显示, 探针的水合粒径约为79 nm, 平均Zeta电位为28.9 mV, 表明探针表面吸附了阳离子表面活性剂CTAB。
采用紫外-可见分光光度计和激光共聚焦显微拉曼光谱仪对Ag层的生长过程进行监测。结果显示, 随着AgNO3加入体积的增加, 银层逐渐变厚, 内标化SERS探针的紫外吸收峰显示了先蓝移后红移的过程, 紫外吸收峰强度从0.18增加到1.17(见图 3a)。图 3b为加入不同AgNO3体积后制备的探针的激光共聚焦显微拉曼光谱图, 可以看出报告分子NT在1 568、1 328和1 078 cm-1等处有特征峰。当AgNO3的加入体积从50 μL增加到700 μL时, SERS探针的拉曼信号逐渐增强, 并在700 μL时达到最大。这是由于相较于Au纳米粒子, Ag层包裹后具有更好的拉曼增强效应[27]。当AgNO3的加入体积进一步增加到1 000 μL时拉曼信号出现降低趋势, 可能是因为形成的Ag层过厚, 对激发光的遮挡效应大于报告分子信号的增强效应, 因此拉曼信号出现降低趋势[28]。因此选择Au@NT@700Ag作为SERS探针进行下一步研究。
实验比较了内标化Au@NT@Ag和外标化Au@Ag@NT两种探针的信号强度。以AgNO3加入体积300 μL为例, 外标化Au@Ag@NT探针在1 328 cm-1特征峰处信号强度约为220, 内标化Au@NT@Ag探针的信号强度约为1 100, 较前者显著提高。内标化探针的高灵敏度性质为后续成像应用奠定了基础。
BSA生物相容性良好, 并且分子结构中有二硫键和丰富的氨基、羧基等活性基团作为多价配体, 具有比单价配体CTAB更强的金属结合力[29-32], 因此尝试用其置换内标化Au@NT@Ag SERS探针表面的CTAB。首先将探针离心, 用pH 7去离子水分散, 使粒子表面CTAB浓度降至临界胶束浓度以下。然后采用pH 7和pH 12的BSA溶液各进行一次置换后, 再用pH 12的去离子水清洗并浓缩至原浓度。
第一次置换过程中选择高浓度BSA是十分必要的, 整个过程中高BSA-CTAB浓度比率有利于平衡向着BSA包覆纳米粒子的方向转移[33]。实验中将浓度为0.147 mmol/L的BSA与探针溶液按体积比1:1和2:1混合, 探针会发生不同程度的团聚, 探针粒子Zeta电位依然表现为CTAB的正电荷(35.5 mV和11.4 mV)。将二者体积比提高至3:1, 混合体系中粒子分散性良好, Zeta电位下降至BSA的负电位(-25.7 mV), 表明粒子表面CTAB被BSA大量置换。第二次置换过程将BSA溶液的pH调节至12, 主要原因是BSA等电点为4.8, 在pH 12时呈现明显负电荷(约-35 mV)[30], 有利于提高置换后粒子的单分散性。此外, 游离态BSA易与带正电的CTAB通过静电结合作用形成复合物, 便于在后续离心过程中将CTAB去除。
通过多种手段对置换过程进行验证。冷场发射扫描电子显微镜结果显示, BSA均匀包覆于Au@NT@Ag SERS探针表面且未造成纳米粒子团聚(见图 4a)。水合粒径及电位分布测定结果显示, BSA置换使探针粒子的水合粒径由79 nm增大到88 nm, 电位由28.9 mV转变为-25.7 mV。傅里叶变换红外光谱表明, BSA包覆的Au@NT@Ag粒子出现了1 450、1 392和1 245 cm-1等BSA的红外特征吸收峰(见图 4b)。以上结果均表明BSA被成功包覆于内标化Au@NT@Ag SERS探针表面。
进一步对BSA包覆的内标化SERS探针进行光谱性质表征。图 5a显示, BSA包覆前后二者的紫外-可见吸收光谱的峰强度没有发生明显变化, 包覆BSA探针的紫外峰形略微变宽且红移, 这可能是由于纳米粒子界面折射系数发生了改变[34, 35]。激光共聚焦显微拉曼光谱测定结果显示, BSA包覆过程未对探针的拉曼光谱强度及特征峰位造成明显改变(见图 5b)。
CTAB体系是Au@NT@Ag粒子中Ag层生长的必要条件, Au@NT@Ag粒子生成后表面包覆CTAB双层结构。在近中性条件下, Ag+/Ag、AgBr/Ag和O2/H2O的条件氧化还原电势分别为0.80、0.13和0.82 V, 理论上讲, Br-的存在会促进溶解氧将银纳米粒子氧化溶解并最终形成AgBr。而BSA修饰的体系中, 氧气和银层的接触概率较低, 氧的条件氧化还原电位可能会低于0.80 V(Ag+/Ag)。溶解氧很难将银单质氧化溶解。
为了验证这一假设采用激光共聚焦显微拉曼光谱仪监测了Au@NT@Ag@BSA SERS探针30 d内1 328 cm-1处特征峰的信号强度, 并以CTAB稳定的样品作对照。如图 6所示, CTAB稳定的Au@NT@Ag探针拉曼信号持续下降, 直至难以测出。由于BSA对Ag层的稳定和保护作用, Au@NT@Ag@BSA探针在30 d内显示了良好的稳定性。
进一步考察置换前后探针的细胞毒性。如图 7所示, CTAB稳定的SERS探针Au@NT@Ag具有明显的毒性, 细胞存活率随探针质量浓度的增加而迅速下降, 在Au@NT@Ag探针的质量浓度为300 mg/L时细胞存活率已低于20%。BSA包覆后的SERS探针的细胞毒性明显降低, 当Au@NT@Ag@BSA探针的质量浓度增加到300 mg/L时, 细胞存活率仍维持在75%以上。上述结果表明, BSA置换可以有效消除Au@NT@Ag探针的急性毒性效应, 但Ag壳的慢性毒性由于银离子缓释等原因难以避免。MTT比色法实验结果显示, 在满足成像的Au@NT@Ag@BSA探针使用剂量下(50 mg/L), 细胞保持了80%以上的存活率, 结果令人满意。一定程度上解决了以往Au@Ag内标化SERS探针生物相容性差这一瓶颈问题, 为后续活细胞成像应用提供了前提。
分别将Au@NT@Ag和Au@NT@Ag@BSA SERS探针与SMMC7721细胞共培养3 h, 采用激光共聚焦显微拉曼光谱仪50倍显微镜下观察细胞的生长状态及SERS探针分布情况, 检测SERS探针的拉曼信号强度。观察结果表明, 3 h后纳米粒子经吞噬作用进入细胞, 如图 8a显示, 与Au@NT@Ag@BSA探针共同孵育的细胞状态良好, 细胞内能够清晰地观察到大量的纳米粒子分布。比较而言, 由于CTAB的细胞毒性效应, 与Au@NT@Ag探针共培养后, 细胞数目明显下降, 且细胞内部探针颗粒较少(见图 8b), 表明该探针标记细胞的能力较弱。以上结果初步验证了Au@NT@Ag@BSA探针在成像分析中的适用性。
本研究通过反射光斑的大小, 粗略估计细胞不同位置处粒子的数目差别, 进一步将其和该处的拉曼信号强度进行比较, 通过拉曼强度验证粒子分布的可行性和准确性。因此, 进一步测定了单个细胞中不同位点的拉曼信号强度。如图 9a所示, Au@NT@Ag@BSA SERS探针信号集中在细胞质区域, 与明场照片(见图 9a内插图)中颗粒出现部位呈现明显的对应; Au@NT@Ag探针在细胞中也显示相同的结果, 但整体拉曼强度降低近一个数量级(见图 9b)。与细胞共培养后采用激光共聚焦显微拉曼仪对3个细胞进行成像结果显示, Au@NT@Ag@BSA探针的摄取没有影响细胞的形貌和生长状态(见图 9c), 通过基于1 328 cm-1特征信号强度的拉曼成像图(见图 9d)可知, BSA包覆的探针对细胞具有良好的整体成像效果。
本研究设计合成了BSA包覆的内标化SERS探针Au@NT@Ag@BSA, 该探针具有良好的信号稳定性和生物相容性。研究借助激光共聚焦显微拉曼光谱仪的采集和成像功能, 实现了探针对SMMC7721肺癌细胞的定位和标记。研究结果表明, 内标化Au@NT@Ag@BSA SERS探针在活体生物成像等方面展示了良好的应用潜力。
2018,
Vol. 36 Issue (3): 317-324
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2018,
Vol. 36 Issue (3): 317-324
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