色谱  2018, Vol. 36 Issue (5): 425-430   PDF    
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周 劭桓
梁 川
唐 阳
廖 艳华
林 文斯
超高效液相色谱-串联质谱法测定红薯叶中15种功效成分
周劭桓, 梁川, 唐阳, 廖艳华, 林文斯     
广西壮族自治区疾病预防控制中心, 广西 南宁 530028
收稿日期：2017-11-24
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（201605027）
通讯联系人：周劭桓. Tel: (0771)2518670, E-mail: shaohuanzh@163.com
摘要：建立了超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）快速测定红薯叶中15种功效成分的分析方法。样品用80%（v/v）甲醇水溶液提取后，采用C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）进行分离，以乙腈-0.15%（v/v）甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，在电喷雾电离（ESI）源、负离子扫描模式下，通过多反应监测（MRM）模式检测各物质分子的离子峰。在各自的范围内15种功效成分线性关系良好，相关系数（r）为0.9995~0.9998；在3个加标水平下，15种化合物的回收率为82.2%~131.4%，相对标准偏差为3.6%~8.3%；方法的检出限为0.13~0.64 μg/L。该方法前处理简单，灵敏度高，适用于红薯叶中功效组分的快速分析，定量分析结果显示咖啡奎宁酸类物质是红薯叶中的主要功效成分。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱    功效成分    红薯叶    
Determination of 15 functional components in sweet potato leaves by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
ZHOU Shaohuan, LIANG Chuan, TANG Yang, LIAO Yanhua, LIN Wensi     
GuangXi Center for Disease Prevention and Control, Nanning 530028, China
Foundation item: National Science Foundation for Young Scholars of China (No. 201605027)
Abstract: A method for the rapid determination of 15 functional components in sweet potato leaves by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) was established. The samples were extracted with 80% (v/v) methanol aqueous solution, and then separated on a C18 column (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) with gradient elution. The mobile phases were acetonitrile and 0.15% (v/v) formic acid aqueous solution. The multiple reaction monitoring (MRM) mode was used to detect the molecular ion peak of each component in electrospray ionization (ESI) source and negative ion scan mode. The results showed that the good linear relationships for the 15 components were obtained with correlation coefficients (r) ranging from 0.9995 to 0.9998. The recoveries of all the components ranged from 82.2% to 131.4% with relative standard deviations of 3.6%-8.3%. The method is simple, sensitive, and is suitable for the rapid analysis of the functional components in sweet potato leaves.
Key words: ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS)     functional components     sweet potato leaves    

红薯也叫甜薯(sweet potato)或甘薯, 在北纬40°和南纬32°间广泛种植。目前我国是世界上最大的红薯生产国, 年产量约占世界总产量的80%[1]。在2005~2014年间, 我国共鉴定红薯品种106种[2]。广西地处亚热带, 适合红薯生长, 每年红薯栽培面积约23.33万公顷[3]。红薯叶是红薯产业中主要的副产物, 在广西每年可收获四季, 如能加工利用, 对红薯产业的发展有重大意义。

红薯叶营养丰富包含蛋白质、粗纤维以及矿物质等[4], 同时还富含多种功效成分。已报道的功效成分包括单咖啡酰奎宁酸、双咖啡酰奎宁酸、三咖啡酰奎宁酸、咖啡酸(CA)、芥子酸(SA)、槲皮素类以及类胡萝卜素等[5-8]。许多研究表明, 这些功效成分具有广泛的生物活性[9, 10]。但是目前仍没有关于红薯叶功效成分系统的研究报道。

在农副产品的开发利用中, 分析不同品种中功效物质的含量是选择优势品种的关键环节。目前针对植物中功效物质的分析方法主要有高速逆流色谱法、超临界流体色谱法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法等[11-13], 其中液相色谱-串联质谱法由于定性、定量准确, 已成为研究植物功效组分的重要分析方法。

本研究建立了一种超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)分析红薯叶中15种功效成分的方法。该方法快速、准确、前处理简单, 可快速分析红薯叶中的功效成分。本研究发现了红薯叶中3种未被报道的组分, 并通过定性定量分析系统研究10种红薯叶中的主要功效成分, 发现可供开发的潜在优势品种, 为红薯产业深度利用开发、拓展红薯产业链提供基础研究依据。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

LC-30A超高效液相色谱仪(日本岛津公司); AB-4000 Q TRAP三重四极杆质谱仪(美国AB公司); KQ-800KDE超声波清洗机(昆山超声仪器有限公司); FDU-1200冷冻干燥机(日本Eyela公司); Milli-Q超纯水处理仪(美国Millipore公司); 3k-15离心机(德国西格玛公司)。

标准品:3-咖啡酰奎宁酸(绿原酸, 3-CQA)、咖啡酸、芥子酸、奎宁酸(QA)、1-咖啡酰奎宁酸(1-CQA)、4-咖啡酰奎宁酸(4-CQA)、5-咖啡酰奎宁酸(5-CQA)、3, 4-二咖啡酰奎宁酸(3, 4-DiCQA)、3, 5-二咖啡酰奎宁酸(3, 5-DiCQA)、4, 5-二咖啡酰奎宁酸(4, 5-DiCQA)、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷(quercetin 3-β-D-glucoside)、芦丁(rutin)、杨梅素(myricetin)和木樨草素(luteolin)均为HPLC级, 购自美国Sigma公司; 3, 4, 5-三咖啡酰奎宁酸(3, 4, 5-TrisCQA)购自成都曼思特生物科技有限公司。色谱纯甲醇、乙腈购自德国Merck公司, 其他分析纯试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

10个品种的红薯叶采摘自广西壮族自治区农业科学院, 采摘时间为2017年5~8月。10个品种编号、名称和颜色分别是:桂粉2号(S1, 绿色)、观赏紫秧(S2, 紫色)、桂紫薇薯1号(S3, 绿色)、心香(S4, 绿色)、万薯5号(S5, 绿色夹杂紫色)、安哥拉白心薯(S6, 绿色夹杂紫色)、桂经薯2号(S7, 绿色)、广薯87号(S8, 绿色)、越南黄心薯(S9, 绿色)和观赏黄秧(S10, 黄色)。取新鲜红薯叶, 洗净后, 于-18 ℃冷冻干燥24 h, 磨粉过40目筛, 密闭封口袋, 保存待用。

1.2 标准溶液的配制

准确称取各标准品, 用甲醇溶解并配制成500 mg/L的标准储备液。准确移取0.20 mL各标准储备液, 置于10 mL容量瓶中, 用50%(v/v)甲醇水溶液定容, 配制10 mg/L各标准中间液。分别取0.2 mL各标准中间液, 用50%(v/v)甲醇水溶液稀释, 定容至10 mL, 得到质量浓度为200 μg/L的各标准工作液。

分别取0.4 mL各标准中间液, 用50%(v/v)甲醇水溶液稀释, 配制400 μg/L的混合标准溶液; 用50%(v/v)甲醇水溶液逐级稀释, 配制成质量浓度为0.1~200 μg/L的系列混合标准溶液。

1.3 样品前处理

准确称量1 g红薯叶冻干粉末, 加入15 mL 80%(v/v)甲醇水溶液, 超声波提取20 min后, 以10 000 r/min离心10 min, 移取上清液, 重复提取3次, 汇集上清液, 用50%(v/v)甲醇水溶液定容至50 mL, 取适量上清液, 用50%(v/v)甲醇水溶液稀释适量倍数后, 过滤, 待测。

1.4 分析条件

色谱柱为Phenomenex C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm); 柱温为30 ℃; 流动相A为0.15%(v/v)甲酸水溶液; 流动相B为乙腈; 流速为0.3 mL/min。梯度洗脱程序:0~15 min, 10%B~40%B; 15~16 min, 40%B~80%B; 16~22 min, 80%B; 22.00~22.03 min, 80%B~10%B; 22.03~27.50 min, 10%B。进样体积5 μL。

离子源:ESI源, 负离子模式; 离子源温度:550 ℃; 多反应监测(MRM)模式; 电离电压:-4.5 kV; 雾化气压力:344 kPa; 碰撞气压力:344 kPa; 气帘气压力:241 kPa。预四极杆入口电压(EP): -10 V; 碰撞室出口电压(CXP): -13 V。15种功效成分的定性、定量离子对、解簇电压(DP)和碰撞电压(CE)见表 1。

表 1 15种化合物的质谱参数 Table 1 MS parameters of the 15 compounds
1.5 统计分析

数据处理采用美国AB公司分析软件Analyst 1.6.2, 所有样本均重复测定3次, 取平均值, 结果均表达为平均值±SD。

2 结果与讨论
2.1 质谱条件的优化

一般而言, 如果待测化合物含有氨基, 应优先考虑使用ESI+扫描模式; 如果待测物含有强负电性基团, 如-Cl、-OH等, 需优先考虑ESI-扫描模式; 当待测物酸碱性不明显时, 两种方式都要进行尝试。本次实验待测化合物大都带有一个或多个-OH基团, 具有一定酸性, 更适合ESI-模式, 但有些中性化合物如芦丁等, 在正离子模式下的响应值会优于负离子模式下的响应值。因此实验首先采用针泵进样, 测定不同化合物在正离子和负离子模式下的质谱信号。结果显示大多数待测化合物在ESI-模式下的响应值较强, 芦丁在ESI+与ESI-模式下的响应值相差不大, 但是红薯叶提取液在ESI+扫描模式下受干扰较大。因此最终本实验采用ESI-模式分析待测化合物。

在负离子模式下, 选择出各化合物的母离子, 对其进行碰撞解离以获得二级离子碎片, 并对二级碎片离子进行碰撞能量的优化, 选择两组干扰少、响应值高的离子对作为定性离子和定量离子对, 优化后的参数见表 1。

实验过程发现, 1-CQA、3-CQA、4-CQA和5-CQA均含有m/z为353.1、191.1、179.1和135.0的离子碎片; 3, 4-DiCQA、3, 5-DiCQA和4, 5-DiCQA均含有m/z为515.2、353.1、190.1和179.1的离子碎片。采用针泵进样在MRM模式下进行优化, 发现这两组同系物无法通过选择离子来区分, 还需进一步优化色谱条件以达到分离要求。

2.2 色谱条件的优化

考察了甲醇-水和乙腈-水两种不同流动相体系对待测物分离效果的影响, 结果显示, 大多数待测化合物在乙腈-水体系下峰形更为尖锐、清晰。实验还发现酚酸类物质在乙腈-水体系和甲醇-水体系下色谱峰均有拖尾现象, 尤其是双咖啡酰奎宁酸类和三咖啡酰奎宁酸, 拖尾较为严重。尝试在乙腈-水体系中加入体积分数分别为0.05%、0.1%、0.15%和0.2%的甲酸, 结果显示, 在乙腈-0.15%(v/v)甲酸水和乙腈-0.2%(v/v)甲酸水两种流动相条件下, 各化合物的峰形清晰, 基本无拖尾现象。考虑到在负离子模式下, 过高的酸性环境可能对化合物的电离产生抑制效应, 因此最终采用乙腈-0.15%(v/v)甲酸水溶液作为流动相。

在乙腈-0.15%(v/v)甲酸水流动相体系下对100 μg/L的混合标准溶液进行分析，其总离子流图色谱谱见图 1。由图 1可知, 在本研究的色谱分离体系下, 4种单咖啡酰奎宁酸同系物和3种双咖啡酰奎宁酸同系物均能得到良好分离。

图 1 混合标准溶液中15种功效成分(100 μg/L)的总离子流色谱图 Fig. 1 Total ion current chromatogram of the 15 functional components (100 μg/L) in the mixed standard solution Nos. 1-15 were the same as that in Table 1.
2.3 未知峰的分析

图 2为典型红薯叶样品(S9)的总离子流色谱图。与图 1对比可知, S9样品中含有11种已知的功效物质, 分别为QA、5-CQA、3-CQA、4-CQA、CA、芦丁、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷、3, 4-DiCQA、3, 5-DiCQA、4, 5-DiCQA和3, 4, 5-TrisCQA, 同时还含有未知化合物1(8.15 min)和未知化合物2(12.80 min)。

图 2 样品S9的总离子流色谱图 Fig. 2 Total ion current chromatogram of the sample S9 Nos. 1-15 were the same as that in Table 1.

针对这两个未知化合物, 进一步采用多反应监测-条件判断-增强离子扫描(MRM-IDA-EPI)模式扫描其二级子离子。MRM-IDA-EPI是三重四极杆质谱仪一种特有的扫描方式, 其实现方法为对某一组离子对在MRM模式下的响应值进行条件判断, 当采集强度超过预设值后, 将触发EPI模式, 从而获得二级扫描图谱。本实验对191.1/353.1和300.1/463.2两组离子对进行MRM-IDA-EPI扫描。在m/z 50~800的扫描范围内, 未知化合物1和未知化合物2的二级质谱图分别见图 3a和图 3b。

图 3 (a) 未知化合物1和(b)未知化合物2的二级质谱图 Fig. 3 MS/MS spectra of (a) unknown compound 1 and (b) unknown compound 2

未知化合物1母离子的m/z为353.1, 子离子的m/z分别为135.1、179.1和191.1, 均为单咖啡酰奎宁酸的典型分子离子, 由于该化合物与4种单咖啡酰奎宁酸的出峰时间均不相同, 推断其可能为单咖啡酰奎宁酸的同分异构体。

未知化合物2的质谱图与槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷类似, 母离子的m/z为463.2, 子离子具有槲皮素典型分子离子碎片(m/z为300.1和179.0), 而且该物质与槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷出峰时间十分接近。实验中尝试通过改变流动相体系及流动相比例来分离这两种物质, 结果发现不论如何改变均无法分离这两个物质(见图 4)。因此推测未知化合物2为槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷的异构体, 可能为槲皮素-3-α-D-葡萄糖苷。

图 4 未知化合物2和槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷在不同流动相条件下的色谱图 Fig. 4 Chromatograms of the unknown compound 2 and quercetin 3-β-D-glucoside using different mobile phases Conditions: a. acetonitrile-0.15% (v/v) formic acid aqueous solution; b. acetonitrile-5mmol/L ammonium acetate; c. acetonitrile-5 mmol/L ammonium acetate-0.15% (v/v) formic acid aqueous solution. Peaks: 1. unknown 2; 2. quercetin 3-β-D-glucoside
2.4 方法学考察

采用1.4节的分析条件, 考察15种功效成分的线性关系、检出限、回收率以及相对标准偏差(见表 2)。由表 2可知, 15种功效成分在各自的范围内线性关系良好, 相关系数(r)为0.999 5~0.999 8, 方法的检出限为0.13~0.64 μg/L。

表 2 15种功效成分的线性范围、线性方程、相关系数(r)、检出限、回收率和相对标准偏差 Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs), recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 15 functional components

以S9样品为研究对象, 针对可检测出的组分, 根据计算值, 分别加入测定含量50%、80%、100%水平的化合物; 对未检测出的组分, 按空白加标方法加入不同水平的标准物质, 使其质量浓度分别为5、10和20 μg/L。按1.3节和1.4节方法操作, 测定平均回收率和精密度, 结果见表 2。可以看出, 除咖啡酸的回收率明显偏高(131.4%)外, 其余各化合物的回收率(82.2%~104.2%)均在合理范围内。

2.5 实际样品分析

利用本方法测定10个品种红薯叶(S1~S10)中的功效成分, 测定结果见表 3。由表 3可知, 不同品种红薯叶中各组分含量差异巨大, 15种功效成分中, 1-咖啡酰奎宁酸、杨梅素、木樨草素和芥子酸在所有样品中均未检出, 芦丁在部分样品中有检出。咖啡酰奎宁类物质是红薯叶中的主要成分, 占所测功效成分的35.1%~84.2%，其中3, 5-二咖啡酰奎宁酸在不同红薯叶品种中含量最高，为122.1~1 080.3 mg/100g。相比咖啡酰奎宁类物质, 黄酮类物质在红薯叶中含量不高, 仅占所测功效成分的0.4%~6.9%。

表 3 红薯叶样品中15种功能成分的测定结果(n=3) Table 3 Detected results of the 15 functional components in sweet potato leaf samples (n=3)
3 结论

本文建立了一种快速、高效分析红薯叶功效物质的超高效液相色谱-串联质谱分析方法。应用本方法分析10个不同品种的红薯叶, 确定了红薯叶富含的多酚类物质, 其中咖啡奎宁酸类物质是红薯叶中的主要功效成分。对大多数品种而言, 3, 5-二咖啡酰奎宁酸和奎宁酸是红薯叶中含量最高的两种酚类物质。本方法的建立为红薯叶的开发利用及深度研究提供了技术支撑。

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