蛋白质的磷酸化是一种重要的可逆性翻译后修饰, 参与诸多生理调控过程^[1]。一般采用电喷雾质谱(ESI-MS)或基质辅助激光解吸质谱(MALDI-MS)对磷酸化蛋白的酶解产物进行检测, 用于研究磷酸化的丰度、位点等。但是, 由于磷酸化多肽在体内含量低, 且所处基质复杂, 难以直接进行质谱分析检测。因此, 在质谱分析前, 需对其进行纯化和富集^{[2, 3]}。目前应用最广泛的磷酸化多肽的富集方法主要是固载金属亲和色谱法^[4-9]和金属氧化物亲和色谱法^[10-15]。其中, 金属氧化物亲和色谱法中已有多种金属氧化物(如TiO₂、ZrO₂、Al₂O₃等)被开发应用于磷酸化多肽的富集, 但是由于金属氧化物表面性质的差异, 它们对磷酸化多肽的选择性存在较大的差别^{[16, 17]}, 如ZrO₂和TiO₂, Zr和Ti在晶体中的配位数不同会导致它们对磷酸化多肽不一样的结合能力; 不仅如此, 采用不同方法制备得到的不同晶型的同种类型金属氧化物对磷酸化多肽也会有不同的选择性^[18]。因此, 磷酸化多肽预富集新方法及富集材料的开发一直是磷酸化蛋白质组研究的重要课题, 具有重要意义。

液相沉积法(liquid phase deposition, 简称LPD)是湿化学法中发展起来的一种全新的成膜方法^{[19, 20]}, 该方法为向金属氟代络离子([MF_n]^m-n, m为金属M离子的价态, n为F原子个数)中添加反应物水, 其基本原理可用以下反应式表示:

同时加入它们的反应产物HF的消耗剂硼酸(H₃BO₃)或金属铝使金属氧化物薄膜沉积在基质表面。该方法操作简单、不受基底形状限制、制备过程中不需要热处理, 并且不需要昂贵的设备, 它是专为制备氧化物薄膜而发展起来的, 因此被广泛应用于催化材料或电极材料等材料中功能性氧化物薄膜的制备。

基于LPD的特点, 本课题组将该方法应用于分离介质材料的制备中^{[11, 14, 20-23]}, 目前我们已采用LPD分别在毛细管和硅胶基质上沉积了纳米氧化钛、纳米氧化硅及纳米氧化镍等多种纳米氧化物涂层材料, 目前还未见采用LPD制备的纳米氧化锆涂层应用于分离科学领域中的报道。

棉花作为一种丰富的天然生物材料, 具有廉价、生物相容性好、稳定性好等特点, 近年来被引入到分离科学领域, 本课题组将进行功能化修饰后的棉花应用于一种微型化的SPE装置, 即将功能化的棉花填装于注射器内或者移液枪的吸头中, 从而对待分析物进行快速萃取^[24-29]。因棉花的表面含有大量的羟基, 可以作为液相沉积的基底。本工作采用液相沉积法制备了纳米氧化锆沉积棉花纤维(ZrO₂-CF)材料, 对材料进行了表征, 并将其应用于磷酸化多肽的选择性富集。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

冷冻离心浓缩仪(美国Labconco公司), 扫描电镜(Quanta 200，荷兰FEI公司)及其附带的能量色散型光谱仪(EDAX GENSIS, 美国Ametek公司)。Axima TOF型MALDI-TOF MS仪(日本Shimadzu公司)。

磷酸(H₃PO₄)、三氟乙酸(TFA)、2, 5-二羟基苯甲酸(2, 5-DHB)、β-酪蛋白(β-casein)、牛血清白蛋白(BSA)、碘乙酰胺(IAA)、二硫苏糖醇(DTT)、胰蛋白酶等购自美国Sigma-Aldrich公司。氟锆酸(H₂ZrF₆)购自阿拉丁公司。铝片购自国材科技有限公司。分析纯氨水、乙酸购自国药集团有限公司。脱脂棉花购买于徐州卫材有限公司。纯水使用Millipore公司的Milli-Q装置(Bedford, 美国)制备得到。脱脂牛奶购于武汉大学自强超市。血清是来自武汉大学校总医院健康人的血清, 存放在-80 ℃冰箱中, 备用。

1.2 二氧化锆涂覆脱脂棉花(ZrO₂-CF)的制备

在装有75 mL二次水的100 mL的塑料烧杯中装入约2 g棉花, 1片16 cm²的铝片, 然后加入2 mL的H₂ZrF₆(45%, 质量分数), 磁力搅拌沉积3天, 让纳米氧化锆均匀地沉积在棉花的表面, 接着将棉花取出, 在砂芯漏斗中抽滤、二次水润洗5~6次, 放入烘箱中100 ℃烘干6 h。用LPD法制备得到ZrO₂的过程如反应式(1)和(2)所示:

(1)

(2)

1.3 样品的制备

β-酪蛋白酶解物:采用100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)缓冲溶液稀释β-酪蛋白配制1 g/L的β-酪蛋白溶液, 然后按照酶与β-酪蛋白质量比为1:50的比例在上述溶液中加入胰蛋白酶, 将加入了酶的β-酪蛋白溶液在37 ℃下反应16 h, β-酪蛋白溶液经酶解后得到的产物在真空离心浓缩仪中旋干, 存放在-80 ℃冰箱中备用。

BSA酶解物:首先配制含8 mol/L尿素的100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)缓冲溶液, 然后将1 mg BSA加入到100 μL上述缓冲溶液中, 待BSA溶解后, 再加入DTT(DTT终浓度为10 mmol/L), 放于37 ℃烘箱中反应30 min, 然后在上述溶液体系中继续加入IAA(IAA终浓度为20 mmol/L), 避光室温反应30 min; 之后, 再加入300 μL 100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)稀释, 按照酶与蛋白质质量比为1:50的比例加入胰蛋白酶, 置于37 ℃烘箱中反应16 h。酶解后的产物经真空离心浓缩仪旋干后存放于-80 ℃冰箱中备用。

脱脂牛奶酶解物:将100 μL脱脂牛奶放在真空离心浓缩仪中旋干, 然后加入100 μL含8 mol/L尿素的100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)缓冲溶液复溶牛奶。剩余的步骤与BSA的酶解步骤相同。

1.4 磷酸化多肽的富集过程

称取3 mg的ZrO₂-CF装填在200-μL吸头前端, 控制材料填装的高度在4 mm左右, 将装填了ZrO₂-CF的吸头装在移液枪上, 通过移液枪的多次吸/推使用。

1.4.1 多肽溶液的富集

先将移液枪吸/推20次50 μL 3% (体积分数, 下文中若无特殊说明, 均为体积分数)TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)对材料平衡处理, 然后将50 μL加入了多肽的3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)上样液进行上样, 为使磷酸化多肽充分吸附在ZrO₂-CF材料上, 吸/推移液枪40次上样液, 然后用50 μL 3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)清洗两次, 每次吸/推移液枪30次, 之后采用50 μL 5%的氨水进行解吸两次, 两次各吸/推移液枪30次。将两次所得的解吸液合并, 真空离心浓缩仪旋干。最后, 用2 μL的基质溶液(20 g/L 2, 5-DHB于50%乙腈、1% H₃PO₄的水溶液中)对旋干的解吸液进行复溶, 取1 μL的复溶液点在质谱仪靶上进行MALDI-TOF² MS分析。

1.4.2 血清中磷酸化多肽的富集

与1.4.1节方法基本一致, 先将2 μL血清样品用3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)稀释至50 μL, 再作为上样液进行上样, 其他操作同1.4.1节。

1.4.3 脱脂牛奶酶解物中磷酸化多肽的富集

将2 μL脱脂牛奶酶解物用3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)稀释500倍, 取50 μL的稀释液作为上样液, 其他操作同1.4.1节。

1.5 仪器分析条件

MALDI-TOF² MS分析时采用波长为337 nm的氮气激光器, 其脉冲宽度为3 ns; 采用20 kV的加速电压, 在正离子反射模式下进行检测。质荷比(m/z)扫描范围为1 000~3 500, 每张谱图是500次激光扫描的平均结果。

2 结果与讨论

2.1 ZrO₂-CF的表征

我们利用扫描电子显微镜(SEM)对棉花和ZrO₂-CF的表面形貌进行了表征。结果如图 1所示, 相比于棉花(图 1a), ZrO₂-CF的表面出现了一层致密的纳米二氧化锆颗粒(图 1b)。同时采用能量色散型光谱仪表征了棉花和ZrO₂-CF表面元素的差异(图 1c, 1d), 证明了ZrO₂-CF表面ZrO₂的存在。结果表明, ZrO₂-CF中Zr的含量为5.59%(图 1d)。

图 1

Fig. 1

图 1 棉花(CF)及纳米氧化锆沉积棉花(ZrO2-CF)的(a, b)扫描电镜图及(c, d)能量色散光谱表征图 Fig. 1 (a, b) Scanning electron microscopy (SEM) and (c, d) energy-dispersive spectroscopy (EDS) characterization images of CF and ZrO2-CF a. CF; b. ZrO2-CF; c. CF; d. ZrO2-CF.

2.2 ZrO₂-CF对磷酸化多肽的富集性能考察

2.2.1 萃取条件的优化

多肽混合物中除含有磷酸化多肽外, 还含有大量的非磷酸化多肽, 在一定的酸度条件下, 含有羧酸根等基团的非磷酸化多肽也会与氧化锆产生路易斯酸碱作用, 从而干扰磷酸化多肽的富集, 因而需对上样溶液的酸度进行优化。我们将ZrO₂-CF用于β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物(物质的量比为1:10)混合样品的磷酸化多肽的富集分析研究。上样液中有机相为50%乙腈时, 考察水相中不同体积分数的TFA对多肽混合物萃取效果的影响。当上样液的水相中TFA的体积分数为5%时, 非磷酸化多肽的信号较1%TFA和3%TFA时的弱, 但信噪比较低; 上样液的水相中TFA含量为1%时, 磷酸化多肽的信噪比较高, 但是由于溶液的酸度较低, 所以羧酸根等离子也被电离, 也与纳米氧化锆产生路易斯酸碱作用, 因而非磷酸化多肽的信号也较高, 综合比较, 最后选择3%TFA水溶液作为上样液的酸度条件。

仍然将β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物(物质的量比为1:10)混合样品作为考察对象, 固定上样液的酸度为3%TFA, 考察上样液中乙腈含量对萃取效果的影响。如图 2所示, 上样液中含有20%乙腈或者80%乙腈的时候, 解吸液谱图中都含有大量的非磷酸化多肽(图 2a, 2c), 而上样液中乙腈的含量为50%时, 解吸液谱图中的非磷酸化多肽比较少, 磷酸化多肽的峰较为明显(图 2b)。图中标有数字的峰为磷酸化多肽信号峰, 所标的数字为对应磷酸化多肽的质荷比(m/z)。这可能与磷酸化多肽与大部分非磷酸化多肽的疏水性不同有关。故选择50%乙腈作为上样液的有机相。

图 2

Fig. 2

图 2 β-酪蛋白和BSA酶解混合物经ZrO2-CF富集后的MALDI-TOF2谱图 Fig. 2 MALDI-TOF2 mass spectra of the tryptic digest mixtures of β-casein and BSA after the ZrO2-CF enrichment Sampling solution: a. 3%(v/v) TFA aqueous solution-ACN (80:20, v/v); b. 3%(v/v) TFA aqueous solution-ACN (50:50, v/v); c. 3%(v/v) TFA aqueous solution-ACN (20:80, v/v). Molar ratio of β-casein to BSA is 1:10. Phosphopeptides are labeled with their observed m/z.

综上, 选择3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)作为上样液。采用填装了3 mg ZrO₂-CF材料的吸头对3 pmol溶解于3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)的β-酪蛋白酶解物中磷酸化多肽进行萃取, 将萃取后的萃余液用MALDI-TOF² MS进行分析, 发现萃余液中无磷酸化多肽信号, 表明ZrO₂-CF对3 pmol β-酪蛋白酶解物中磷酸化多肽萃取没达到吸附饱和, 满足少量生物样品分析。

2.2.2 萃取性能的考察

分别采用ZrO₂-CF和未修饰的棉花纤维CF对β-酪蛋白酶解物(3 pmol)进行萃取分析, 考察它们对磷酸化多肽的富集能力。如图 3a所示, 当β-酪蛋白酶解物未经材料富集直接进行MALDI-TOF² MS检测分析时, 虽然可以检测到4个磷酸化多肽的信号峰, 但是谱图中还有大量非磷酸化多肽的信号峰, 并且检测到的磷酸化多肽的信号都较弱。而经ZrO₂-CF富集后, 萃余液(图 3b)中几乎看不到磷酸化多肽的峰, 表明ZrO₂-CF材料对磷酸化多肽具有较强的作用, 解吸液(图 3c)中可以看到9个磷酸化多肽的峰, 几乎看不到非磷酸化多肽的峰, 说明在用ZrO₂-CF处理后能有效地去除大部分的非磷酸化多肽, 表明材料对磷酸化多肽有较好的萃取选择性。然而用未修饰的棉花富集β-酪蛋白酶解物后的解吸液中只能检测到1个磷酸化多肽(图 3d), 表明CF表面沉积的纳米ZrO₂颗粒对磷酸化多肽具有较好的选择性作用。

图 3

Fig. 3

图 3 β-酪蛋白的酶解物萃取前后的MALDI-TOF2的质谱图 Fig. 3 MALDI-TOF2 mass spectra of tryptic digest of β-casein a. direct analysis; b. analysis after enrichment with ZrO2-CF; c. analysis of sampling eluate; d. analysis after enrichment with cotton fiber. Phosphopeptides are labeled with their observed m/z.

为了进一步考察ZrO₂-CF对磷酸化多肽的萃取选择性, 将它用于β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物不同比例混合后的磷酸化多肽的富集。如图 4所示, 酶解物混合后未经富集直接进行质谱分析时, 谱图中无法观察到磷酸化多肽的信号(图 4a, 4b, 4c), 基本上都是非磷酸化多肽的信号峰, 说明非磷酸化多肽严重干扰了磷酸化多肽的质谱分析, 因此质谱检测磷酸化多肽前需将其选择性地从复杂样品中萃取出来。图 4d、4e和4f分别为1:1、1:10、1:100(物质的量比)的β-酪蛋白和BSA酶解物的混合物经ZrO₂-CF富集后质谱检测的谱图, 可以看出, 当β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物的比例为1:1时, 经材料处理后能观察到5个磷酸化多肽的信号峰; 当其混合比例提高到1:10, ZrO₂-CF富集后的溶液能仍观察到5个磷酸化多肽的信号峰; 而当其比例达到1:100后, ZrO₂-CF富集后的溶液依然能观察到4个磷酸化多肽的信号峰, 且3个比例的酶解混合物经ZrO₂-CF富集后的质谱图中基本上看不到非磷酸化多肽的峰。以上结果表明, ZrO₂-CF可以有效地从多肽混合物中选择性地萃取磷酸化多肽。

图 4

Fig. 4

图 4 不同比例的β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物的混合物经ZrO2-CF富集前后的质谱图 Fig. 4 MALDI-TOF2 mass spectra obtained by direct analysis and after ZrO2-CF enrichment of the tryptic digest mixtures of β-casein and BSA Molar ratio of β-casein and BSA are 1:1 (a, d), 1:10 (b, e), and 1:100 (c, f). The concentration of β-casein was 6.0×10-8 mol/L. a, b, c is obtained by direct analysis; d, e, f is obtained after enrichment with ZrO2-CF.

为考察方法的灵敏度, 将ZrO₂-CF用于β-酪蛋白酶解物中磷酸化多肽的萃取, 当β-酪蛋白的浓度低至10 fmol时, 其酶解物经过ZrO₂-CF富集后仍然可以检测到m/z 3 122的信号, 这说明方法灵敏度高。

2.3 ZrO₂-CF材料对血清和牛奶中磷酸化多肽的富集应用

由于磷酸化多肽与人类疾病有着密切关系, 人血清中内源性磷酸化多肽的测定受到越来越多的关注。由于血清样品含有大量蛋白质、多肽等复杂成分, 对其中的磷酸化多肽进行分析仍是一项挑战性的工作。将血清样品稀释后, 未经材料富集直接进行质谱分析时, 如图 5a所示, 谱图中没有磷酸化多肽的信号; 而在经ZrO₂-CF富集后, 如图 5b所示, 解吸液的质谱图中可看到4个磷酸化多肽的信号峰, 它们的序列信息分别为DSGEGDFLAEGGGV(m/z 1 389.5)、ADSGEGDFLAEGGGV(m/z 1 460.5)、DSGEGDFLAEGGGVR(m/z 1 545.5)和ADSGEGDFLAEGGGVR(m/z 1 616.5)。

图 5

Fig. 5

图 5 血清酶解物和脱脂牛奶酶解物直接进样和经ZrO2-CF富集后的MALDI-TOF2质谱图 Fig. 5 MALDI-TOF2 mass spectra of tryptic digest of human serum and non-fat milk obtained by direct analysis or after enrichment with the ZrO2-CF a, b: tryptic digest of human serum obtained by (a) direct analysis and (b) after enrichment with the ZrO2-CF; c, d: tryptic digest of non-fat milk obtained by (c) direct analysis and (d) after enrichment with the ZrO2-CF.

为了进一步证明ZrO₂-CF对复杂样品中磷酸化多肽的萃取能力, 将脱脂牛奶的酶解产物作实际样品, 继续考察ZrO₂-CF从实际样品中捕获磷酸化肽段的选择性。牛奶中含有大量的蛋白质和碳水化合物, 基质非常复杂, 当将脱脂牛奶酶解物直接经MALDI-TOF²质谱分析时, 如图 5c所示, 仅有6个标示的谱峰为磷酸化多肽的信号峰, 且信号较弱, 谱图中大多数是非磷酸化多肽的信号峰; 然而经过ZrO₂-CF富集后, 如图 5d所示, 非磷酸化多肽被有效去除, 有9个磷酸化多肽被检测到且信号得到极大的提高, 这9个被检测到的磷酸化肽段分别为β1(FQSEEQQQTEDELQDK, m/z 2 061.5)、β2(FQSEEQQQTEDELQDKIHPF, m/z 2 556.8)、β3(RELEELNVPGEIVESLSSSEESITR, m/z 3 122.1)、α1 (TVDMESTEVFTK, m/z 1 466.3)、α2(TVDM-ESTEVFTKK, m/z 1 594.4)、α3 (VPQLEIVPNSAEER, m/z 1 660.4)、α4(YLGEYLIVPNSAEER, m/z 1 832.6)、α5(DIGSESTEDQAMEDIK, m/z 1 927.4)、α6(YKVPQLEIVPNSAEER, m/z 1 951.7)和α7(FPQYLQYLYQGPIVLNPWDQVKR, m/z 3 024.9)。

以上实验结果表明, ZrO₂-CF可以从复杂的实际样品中高选择性地萃取磷酸化多肽, 与文献报道的萃取材料相比(见表 1), ZrO₂-CF与其他材料对磷酸化多肽的富集灵敏度基本相当, 但是材料的制备方法及萃取方式更简单, 适用于少量样品的磷酸化多肽的快速萃取分析。

表 1 (Table 1)

表 1 ZrO2-CF与文献报道的磷酸化富集材料的比较 Table 1 Comparison of ZrO2-CF with the reported different materials for phosphopeptide enrichment No. Material Preparation of materials Sensitivity (α/β-casein)/fmol Sample Extractionmode Ref. 1 TiO2@DOTA-Zr4+ TiO2@DOTA-Zr was prepared by coating 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane N, N′, N″, N″′-tetra-acetic acid (DOTA) on the surface of TiO2 nanomaterials and then functionalized with Zr4+. 10 β-casein/BSA (1:10), milk, human serum MDE [5] 2 Fe3O4@silica@GMA@IDA nanoparticles immobilized by Ti4+ Magnetite Fe3O4 nanoparticles were first prepared, then covered by a silica shell (Fe3O4@silica nanoparticles) and modified to expose at the surface bromine containing groups. Glycidyl methacrylate (GMA) was subsequently polymerized to Fe3O4@silica. The Fe3O4@silica@GMA nanoparticles were reacted with iminodiacetic acid (IDA). Ti4+ was immobilized on the Fe3O4@silica@GMA@IDA magnetic nanoparticles. - β-casein/BSA (1:100), yeast protein MSPE [6] 3 Fe3O4@SiO2-PLP-Ti4+ Pyridoxal-5-phosphate (PLP) were grafted on the amine functioned substrates (3-aminopropyl-triethoxysilane, APTES), followed by Schiff base reaction between aldehyde and amine groups. Finally, Fe3O4@SiO2-PLP was immobilized by Ti4+. 10 β-casein/BSA (1:1000), human serum, milk and rat brain proteins MSPE [7] 4 Fe3O4@PDA-Mn+ Fe3O4 microspheres were synthesized via the solvothermal reaction, followed by self-polymerization of dopamine (PDA) on the surface. Eight metal ions were then adhered to the surface of Fe3O4@PDA. 2-200 β-casein/BSA (1:100 and 1:50), milk MSPE [8] 5 CF-NH2-AZO-p(VPA-x)-Ti4+ CF-NH2-AZO was obtained by modifying cotton fiber (CF) with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTAD) and then reacted with 4, 4′-azobis (4-cyanopentanoic acid chloride) (ACVC). CF-NH2-AZO-p(VPA-x) was synthesized by a “grafting from” radical polymerization approach using vinyl phosphonic acid (VPA) as monomer. Subsequently, titanium ions was immobilized to CF-NH2-AZO-p(VPA-x). 10 β-casein/BSA (1:100 and 1:10), rat brain lysate lab-in-syringe SPE [27] 6 Magnetic yolk-shell MSP@ZrO2 Magnetic supraparticles (MSPs) were prepared through a modified solvothermal reaction. MSPs was then modified with γ-methacryloxypropyltrimethoxysilane (MPS). Poly(methylacrylic acid) (PMAA) layer was coated onto MSP@MPS by reflux-precipitation polymerization of methylacrylic acid (MAA), with N, N′-methylenebis(acrylamide) (MBA) as the cross-linker and azobisisobutyronitrile (AIBN) as the initiator. 5 β-casein/BSA (1:100), human saliva MSPE [10] 7 ZrO2(12, 24)/MCF Zirconia layer coated mesoporous silica microspheres with mesostructured cellular foams (MCFs) were prepared by NH3/water vapor-induced internal hydrolysis method. - β-casein/BSA (1:40), human serum SPE [15] 8 ZrO2-CF ZrO2-CF was prepared by liquid-phase deposition of zirconia nanoparticles on the surface of cotton fiber. 10 β-casein/BSA (1:10, 1:100), milk, human serum pipettingup anddown This work MDE: matrix dispersion extraction; MSPE: magnetic solid-phase extraction; SPE: solid-phase extraction.

表 1 ZrO2-CF与文献报道的磷酸化富集材料的比较 Table 1 Comparison of ZrO2-CF with the reported different materials for phosphopeptide enrichment

3 结论

本文采用液相沉积法成功制备了纳米氧化锆沉积棉花纤维ZrO₂-CF材料, 并将其填装于移液枪的吸头内, 应用于磷酸化多肽的简单、快速富集萃取。不论对简单的磷酸化蛋白质的酶解物样品还是混有大量非磷酸化蛋白的酶解物样品, ZrO₂-CF材料对磷酸化多肽均表现出较高的萃取选择性。将ZrO₂-CF材料应用于人血清和脱脂牛奶酶解物中磷酸化多肽的富集萃取, 也表现出了较好的选择性。材料制备简单、成本低, 且生物相容性好, 对磷酸化多肽具有较好的萃取选择性; 将材料装填到移液枪后的抽吸萃取方法简单、快速、具有较好的应用前景。

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