非对称场流分离技术(asymmetrical flow field-flow fractionation, AF4)是目前可信赖的纳米颗粒分离和表征方法, 尤其适合表征多分散的颗粒尺寸分布, 且条件温和无损[1]。AF4和多种检测器联用, 例如多角度激光散射检测器、紫外/可见分光光度计、荧光检测器等, 可以在线监测物质尺寸和浓度信息。
AF4技术全过程最重要的一步是分析物在通道中的分离。分离在一个薄的领带形的通道中进行, 见图 1。进入通道的载液流分成两部分, 一部分沿着通道自入口向出口方向移动(inflow), 另一部分垂直于主体载液的液流, 叫作交叉流(cross flow)。交叉流穿过通道底部一定截留分子量的可渗透超滤膜, 并产生力场使分析物向膜方向移动[2, 3]。在非对称流场流分离系统中, 松弛过程也叫作聚焦-松弛(focusing-relaxation)过程, 从入口处和出口处进入通道的载液会在通道入口附近进行聚焦-松弛, 这一位置也叫作聚焦点(focusing point), 在此期间, 样品停止迁移; 样品受到扩散作用(diffusion effect)和交叉流流场两种作用力影响并在通道横截面上某个位置达到平衡。颗粒距离积累壁的距离取决于颗粒的扩散系数和自身的尺寸大小。尺寸较大的颗粒, 扩散系数较小, 距离积累壁的距离较近, 保留时间较长。
在AF4的应用过程中, 经常遇到的问题是被分析蛋白质的膜吸附和聚集作用。膜吸附作用使蛋白质在通道中产生质量损失, 浪费了珍贵的样品, 不利于定量。蛋白质的聚集作用使不同蛋白质之间的分离变得困难, 不利于蛋白质产品的质量控制。
本实验系统地研究了不同pH、阴离子和阳离子的载液组成对目标蛋白质卵白蛋白在AF4分离过程中膜吸附和聚集行为的影响; 分析蛋白质在不同溶液环境下表面电荷、尺寸大小等因素的改变, 比较不同载液条件下蛋白质的行为。希望通过本实验可以找到AF4分析蛋白质的最佳载液组成条件, 最大限度地减少膜吸附和聚集行为, 避免蛋白质在通道中的损失。
非对称流场流分离仪购自美国怀亚特(Wyatt)公司, 型号为Eclipse AF4, 和安捷伦1200系列四元泵、脱气装置和自动进样器连接, 在线联用Agilent 1200 UV/Vis检测器(美国安捷伦公司)。Zetasizer Nano仪器来自英国马尔文公司, 超纯水系统来自美国Millipore公司。
卵白蛋白冻干粉购自德国Sigma-Aldrich公司, 除非特别说明, 蛋白质样品均溶解于超纯水(18.2 MΩ·cm)中。NaCl、MgCl2、KCl、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、HCl、NaOH、磷酸均为分析纯, 来自于美国Fisher Scientific公司。100 mmol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffer, PB)的制备方法为:约29 g Na2HPO4·12H2O和3 g NaH2PO4·2H2O溶解于1 L超纯水中, 用磷酸调节pH至7.4, 经0.2 μm滤膜过滤备用。不同种类和浓度的盐中加入10 mmol/L磷酸盐缓冲液调节离子强度, 按照相应配方使用超纯水配制后, 经0.2 μm滤膜过滤备用。
AF4实验中设定紫外检测器检测波长为215 nm。通道的几何参数为:长度153 mm, 最大宽度为22 mm; 使用350 μm垫片作为通道厚度, 截止分子质量30 kD再生纤维素膜作为积累壁膜。所有的样品, 除非特别指明, 均使用表 1的流速条件进行洗脱。
所有载液在使用前经过0.2 μm膜过滤, 当天配制。载液组成变化如表 2所示。选用10 mmol/L磷酸缓冲液作为空白对照, 加入不同种类和浓度的盐, 考察载液组成的影响。在进样前, 载液先冲洗、平衡通道至少30 min, 确保通道的洁净和实验重复性。仪器操作和数据处理均使用安捷伦Openlab软件。
样品溶液的进样量为20 μL, 卵白蛋白水溶液的质量浓度均为2 mg/mL, 新鲜配制使用, 并在4 ℃保存。
卵白蛋白冻干粉溶解于相应的缓冲液中, 质量浓度为2 mg/mL。每次测定结果都是50次重复测试的平均值。
样品与通道中膜的相互作用使样品保留在通道膜上, 造成质量损失。为了研究AF4分离过程中蛋白质的膜吸附现象, 改变载液的组成。实验结果表明, 随着膜使用时间的延长, 膜老化加剧, 相应的样品回收率逐渐下降。所以日间结果之间直接比较是不科学的。因此, 每天先以10 mmol/L磷酸盐缓冲液为载液进行对照实验, 紫外信号的峰面积定义为A*。同一天时间内, 蛋白质在其余的载液条件下进样, 所得到的峰面积为A。以两者的百分比计算相对回收率:
其中, 峰面积A、A*为3次连续进样所得峰面积的平均值。相对回收率避免了由于膜老化造成的日间回收率差异。
如图 2所示, 在高离子强度的条件下, 紫外图谱中双峰的特征更加明显。多聚体所占的比值由多聚体的峰面积占总峰面积的比值表示:
其中P1是单体峰面积, P2是聚合物峰面积。
因为生物蛋白质的生理最佳pH条件为7.4, 为了保持蛋白质的活性, 在总离子浓度为10 mmol/L的PB中, 于pH 7.4左右小范围内取两个pH值6.2和8.2, 研究pH对卵白蛋白AF4通道中行为的影响(见图 3)。在3种pH条件下, AF4的流出图中蛋白质的保留时间没有明显变化, 说明卵白蛋白的尺寸和分子大小在3种pH条件下没有太大改变。从相对回收率来看, 载液pH为6.2时的卵白蛋白相对回收率明显低于pH为7.4和8.2时的相对回收率。3种条件下均有聚集行为发生, 多聚物占总蛋白质的比例都高于35%。其中, pH 6.2时, 多聚物比例最高, 接近45%。通过动态光散射检测到3种pH下蛋白质的zeta电位都在-5 mV左右, zeta电位随pH变化不大。
不同浓度的PB对通道中蛋白质行为的影响见图 4。10、20、50 mmol/L的PB中离子强度依次升高, 得到的蛋白质RR依次降低, 其中从10到20 mmol/L下降幅度最大, 从100%直接降至约50%。计算得到的P与磷酸根离子强度成正比关系, 从折线图斜率来看, 与相对回收率结果相似, 浓度从10到20 mmol/L的增加导致多聚物占比大幅度增高。zeta电位绝对值的减小和离子强度的增加呈近似线性关系。
Cl-及其浓度对卵白蛋白行为的影响见图 5。NaCl浓度从0上升到10 mmol/L的过程中, 卵白蛋白的RR和P的绝对值变化最大; 而从50到100 mmol/L过程里, RR和P值几乎不变。由动态光散射测得不同浓度下的卵白蛋白zeta电位均在-6 mV左右, 变化不大(变化幅度小于4 mV), 电位绝对值整体呈下降趋势。
不同类型阴离子(H2PO4--HPO42-和Cl-)的离子强度对蛋白质在通道中保留行为的影响见图 6。最初尝试使用4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)和NaCl的混合溶液作为载液, 因为10 mmol/L HEPES的离子强度仅为0.003 mol/L, 对Cl-的离子强度影响不大[4]。但是, 发现HEPES和25、50、100 mmol/L NaCl条件下蛋白质的回收率结果普遍非常低, 到100 mmol/L Cl-时甚至没有峰出现。因此, 认为磷酸根缓冲体系对于卵白蛋白的稳定是必不可少的。所以, 选用50、100 mmol/L NaCl溶于10 mmol/L PB(pH 7.4)中, 研究Cl-对保留行为的影响。从图 6可看出, Cl-对P的影响明显高于磷酸根体系, 相同的离子强度下, 含Cl-的体系聚集行为更加明显。磷酸根体系下zeta电位的绝对值普遍低于含Cl-的缓冲液, 但是都在-5 mV左右, 绝对值相差不大。卵白蛋白的相对回收率受阴离子种类的影响不大。
10 mmol/L的PB中加入一价的Na+、K+, 浓度分别为1、5、10 mmol/L, 调节pH到7.4。由图 7中看出, RR的总体趋势为:K+＜Na+; 在含有二价阳离子Mg2+的PB中, Mg2+能够使蛋白质的RR大幅度下降到约50%, 而在1 mmol/L Na+、K+载液条件下, RR相较于对照(10 mmol/L PB)没有太大变化。P随阳离子浓度变化的总体趋势为K+＞Na+。Na+、K+的RR和P曲线均接近, 这点在zeta电位图中也得到证明。相同浓度下Na+和K+的zeta电位相差不大, 说明对于同一价态的阳离子溶液, 离子强度是最主要的影响因素。在含Mg2+的磷酸缓冲液中, 蛋白质zeta电位(-4.02 mV)的绝对值小于一价阳离子(Na+、K+)溶液。
在非对称流场流分离中, 垂直于通道方向的交叉流把蛋白质带到靠近再生纤维素(regenerated cellulose, RC)膜的积累壁区域。蛋白质分子的布朗运动引发颗粒之间和颗粒、膜之间的碰撞反应, 增加了蛋白质吸附在膜上的可能性[5]。
蛋白质和膜的相互作用主要受到两种力的影响:范德华力和静电作用[6]。范德华力FvdW与R3/l2(2R+l)2呈正比, 其中R是颗粒的半径, l是颗粒表面到膜的距离[7]。依据文献[8], RC膜因为羧基的存在, 其pKa约为3.5。卵白蛋白的pI值为5.19, Mw为42 881。所以在本研究中使用载液pH 6.2、7.4、8.2的条件下, 再生纤维素膜和卵白蛋白都带负电, 两者之间存在着静电排斥力Fel[9]:
其中k是波尔兹曼常数, R和l与范德华力公式中的意义相同, T为温度, ρ是介质的密度, zi为离子价态, e为单个电子的电位, δ为双电子层的厚度, ζ为物质的zeta电位。
载液的离子强度是影响蛋白质膜吸附的最主要原因之一。无论是阴离子HPO42-H2PO4-、Cl-, 还是金属阳离子溶液, 离子强度的增大总是伴随着RR的降低。通常来讲, 载液离子强度增大, 造成zeta电位绝对值下降(见图 6)和蛋白质分子双层电子层厚度降低, 导致蛋白质和膜之间的静电排斥力减小, 蛋白质更易吸附。另外, 从RR和P的结果看出, RR和P通常呈负相关, 即多聚物的比例越大, 相对回收率越低, 吸附越严重。卵白蛋白多聚物的相对分子质量更大, 尺寸更大。根据AF4的分离原理[10], 尺寸大的颗粒扩散系数更小, 离积累壁的距离更近; 因此, 保留时间更久, 和通道碰撞的时间和概率增加, 更容易吸附在膜上。根据文献[7]可知, 再生纤维素的膜表面zeta电位随着溶液离子强度的增加而降低, 同样会导致膜和分子间的排斥力减弱, 吸附增加。
pH的大小对膜表面zeta电位也有着重要影响, pH为6.8时, 膜的zeta电位最低[7], 膜与物质之间的排斥力变小, 更易吸附, RR最低。
金属阳离子的价态和形态大小影响蛋白质分子的zeta电位和双电子层的厚度, 从而影响蛋白质和膜之间的相互作用。一价阳离子Na+、K+的载液中, 蛋白质分子的zeta电位变化不大, 蛋白质吸附作用在K+载液条件下更明显。在溶液中, 金属阳离子的水合半径应该Na+＞K+, 水合阳离子导致蛋白质分子表面双电子层的Stern层厚度增加, 结合公式(3), Fel增大, 排斥力增大; 同时增加的分子外围电子层厚度使蛋白质相对远离积累壁表面, 范德华吸引力减少, 因此吸附现象减弱。二价阳离子Mg2+条件下, 更高的化学价对分子的扩散双电层产生更大的压迫力。另外, Mg2+溶液引起的蛋白质分子表面zeta电位的下降明显[11], 因此Fel变大, 蛋白质和膜的吸附作用增强; 此外, 从蛋白质结构来看, Mg2+与蛋白质中的羧基易结合形成沉淀, 导致膜吸附加剧。
蛋白质在溶液中的吸附行为是一个相当复杂的过程, 取决于蛋白质三维空间结构、结构硬性、稳定性等诸多因素。所以, 下一步应该对蛋白质在不同条件下的三维空间结构及其稳定性进行测试研究, 对吸附行为进行更深入的解释。
溶液对蛋白质聚集行为的影响较一般纳米颗粒更加复杂, 涉及蛋白质的分子大小、构象、稳定性和功能等各个方面[12, 13]。如2.1节所述, 在实验中的载液条件下, 所有蛋白质表面携带负电荷。由动态光散射(dynamic light scattering, DLS)测量结果显示, 所有条件下, 蛋白质的zeta电位均大于-30 mV, 理论上溶液体系不稳定, 易形成聚集体。当离子强度增加时, 蛋白质表面绝对zeta电位降低, 蛋白质之间的静电排斥力减少, 倾向于形成聚集物。由DLS测得在1、5、10、50、100 mmol/L NaCl条件下, 卵白蛋白的蛋白质样品分布系数(polydispersity index, PDI)从0.658增加到0.849, 证明样品在高离子强度下有着更广的聚集物尺寸分布, 对应的AF4流出图里的峰更宽。必须指出的是, 在动态光散射中蛋白质的聚集度检测环境和AF4通道中溶液环境相比要温和许多; 在一次典型的AF4洗脱过程中, 分析物的浓度会经历大幅度的改变, 最终出口端浓度稀释了2至4倍[14], 在场流分离过程中分析物还会受到载液流剪切力的影响, 因此动态光散射得到的PDI的结果还不能完全反映AF4过程中蛋白质的聚集行为, 但可以提供一个参考的变化趋势。
盐离子与蛋白质中的带电氨基酸的特殊作用是导致蛋白质结构构象变化的原因之一。例如, 有文献[15]报道二价金属离子Ca2+可以与卵白蛋白的特异位点结合。本实验中, 含Mg2+溶液条件下得到的P(接近70%)高于含10 mmol/L Na+、K+载液条件下的P。在蛋白质聚集行为研究中, 二价Mg2+对蛋白质的聚集有显著的影响, 为了得到均一单体的卵白蛋白, 需要避免二价离子的加入; 当希望研究两个或多个蛋白质在AF4中的结合行为时, 二价Mg2+创造了极佳的溶液环境。
蛋白质在非对称流场流分离系统中的膜吸附和聚集行为极大地限制了AF4的应用和发展。本实验以卵白蛋白作为特征分析物, 研究了不同载液条件对AF4分离过程中蛋白质的膜吸附和聚集行为的影响; 引入RR和P作为分析参数, 研究如何避免场流分离中不必要的蛋白质样品损失。
实验结果表明, 载液的离子强度对卵白蛋白的吸附和聚集行为影响最大; 载液的pH主要通过改变再生纤维素膜表面的zeta电位来影响膜与分子之间的静电排斥力; 二价阳离子Mg2+由于自身的金属离子特性, 极大地提高了聚集物比例。蛋白质在溶液中的吸附和聚集行为是一个相当复杂的过程, 取决于蛋白质的分子大小、构象、稳定性和功能等各个方面。后续实验可以从蛋白质空间结构的角度，借助计算机模拟技术更全面地理解蛋白质在AF4通道中的行为。
2018,
Vol. 36 Issue (5): 480-486
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