基于微流控芯片的72重单核苷酸多态性族群推断系统的构建


扩展功能
	加入收藏夹

	复制引文信息

	加入引用管理器

	Email Alert

	RSS
本文作者相关文章
	任苹

	刘京

	蔺日胜

	刘杨

	黄美莎

	胡胜

	徐友春

	李彩霞

任苹^1,2,3, 刘京², 蔺日胜⁴, 刘杨¹, 黄美莎¹, 胡胜², 徐友春³, 李彩霞^1,2

1. 山西医科大学, 山西太原 036000;
2. 公安部物证鉴定中心, 北京市现场物证检验工程技术研究中心, 现场物证溯源技术国家工程实验室, 北京 100038;
3. 清华大学生物医学工程系, 北京 100084;
4. 内蒙古锡林郭勒盟公安局刑警支队, 内蒙古锡林浩特 026000

收稿日期：2018-01-03

基金项目：国家重点研发计划（2017YFC0803501）；国家自然科学基金项目（81772027）；基本科研业务费专项资金项目（2016JB039）；公安部物证鉴定中心协同创新工作项目（2017XTCX01）；公安科技成果推广引导计划（2016TGYDGAES14）

通讯联系人：徐友春, E-mail:xyc2012@tsinghua.edu.cn; 李彩霞, E-mail:licaixia@tsinghua.org.cn

摘要：建立了常染色体单核苷酸多态性（SNPs）复合检测芯片体系，用于未知个体的族群来源推断。基于前期筛选的74-SNPs组合，采用竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应（PCR）的原理构建SNPs的扩增体系，在微流控芯片的每个反应孔内完成一个SNP的检测，通过高通量PCR微流控芯片实现了其中72个SNPs的同步检测。芯片的扩增由平板PCR仪完成，反应孔的荧光信号通过激光共聚焦扫描仪检测，最终通过提取的荧光值进行结果分析。使用该芯片检测获得52份样本的SNPs分型，分型结果的准确率为100%。以57个人群的3628个样本为参考人群数据库，进行20份样本的族群来源推断，推断结果与样本的实际来源一致。本研究建立的常染色体72个SNPs微流控芯片体系可以有效地进行SNP多态性分析检测，基于参考数据库，20份检测样本族群推断的准确性为100%。

关键词：族群推断单核苷酸多态性复合体系微流控芯片

Construction of a microfluidic chip-based 72 plex single nucleotide polymorphisms ancestry inference system

REN Ping^1,2,3, LIU Jing², LIN Risheng⁴, LIU Yang¹, HUANG Meisha¹, HU Sheng², XU Youchun³, LI Caixia^1,2

1. Shanxi Medical University, Taiyuan 036000, China;
2. Beijing Engineering Research Center of Crime Scene Evidence Examination, National Engineering Laboratory for Forensic Science, Institute of Forensic Science, Beijing 100038, China;
3. Department of Biomedical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China;
4. Inner Mongolia Xilingol League Public Security Bureau Criminal Police Detachment, Xilinhot 026000, China

Foundation item: National Key Plan (No. 2017YFC0803501); National Natural Science Foundation of China (No. 81772027); Fundamental Research Funds (No. 2016JB039); Collaborative Innovation Project for Institute of Forensic Science (No. 2017XTCX01); Public Security Science and Technology Promotion Guide Plan (No.2016TGYDGAES14)

Abstract: The aim was to develop an autosomal single nucleotide polymorphism (SNP) multiplex detection chip system for the inference of the ancestry of unknown individuals. On the basis of the 74-ancestry informative SNP (AISNP) panel screened by our group, a multiplex SNP amplification and detection system, based on a microfluidic chip of competitive allele-specific polymerase chain reaction (PCR), was constructed. The allele-specific primers of each SNP were positioned into a single well on the microfluidic chip and each chip included 112 wells. For detection of SNPs, the chip was placed on the plate thermocycler to perform PCR. The fluorescence signal of the reaction in each well was detected by a confocal laser scanning instrument to evaluate the SNP genotypes of each sample. Fifty-two samples were used for SNP typing. The accuracy of typing results was 100%. Taking 3628 samples of 57 populations as the reference population database, the ancestry of 20 samples was inferred. The results were consistent with the actual sources of the samples. The autosomal 72-SNP microfluidic chip system established can accurately detect SNPs. The ancestry of tested individuals can be accurately inferred from the reference database.

Key words: ancestry inference single nucleotide polymorphism complex system microfluidic chip

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)是单个核苷酸变异引起的多态性^[1]。近年来, SNP被广泛应用于族群地域推断、表型特征刻画等研究, 研究人员报道了大量基于SNP的祖先信息位点(ancestry informative markers, AIMs)用于人群地域来源的推断及洲际大人群区分^[2-8]。如:Frudakis等^[2]的56-SNPs、Phillips等^[3]的34-SNPs、本项目组^{[4, 5]}的27-SNPs等用于非洲、东亚和欧洲3大人群的推断。Kosoy等^{[6, 7]}的128-SNPs和Kidd等^[8]的55-SNPs在人群区分度方面有所改进, 实现了非洲、欧洲、南亚、东亚、大洋洲、美洲人群区分, 但没有实现东亚亚人群的进一步区分。现有的商业化试剂^{[9, 10]}主要采用文献报道的位点, 在亚人群的区分度上并无明显改变。本项目组^[11]在2016年研究报道了74个SNP的位点组合, 可以实现东亚南北方人群的区分。但是由于尚未构建一体化的检测体系, 限制了其在法医案件检材中的应用。

本文采用我国自主研发的微流控SNP芯片(iMAP)系统进行74个SNP位点复合检测体系的构建。首先, 将74种用于SNP检测的引物预固定到微流控芯片的反应孔中。在进行SNP检测时, 将待检样本注入芯片再离心分配、隔离反应孔, 然后即可以通过平板PCR进行扩增分型, 最后基于荧光扫描来获得检测信号并完成检测分型。最终优化出72个SNPs的扩增体系, 并成功地将其应用于族群推断。与其他方法相比, 该方法只需2.5 h即可完成SNP的检测和分型, 每个反应孔所需反应预混液体积约1 μL。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

热封仪(北京博奥晶典); 平板PCR仪(北京博奥晶典); LuxScan-D激光共聚焦扫描仪(北京博奥晶典); MassArray^® DNA质谱阵列基因分析系统(美国Agena公司); QIAamp DNA Blood Midi Kit(静脉血基因组DNA提取试剂盒, 德国Qiagen公司); NanoDrop2000c分光光度计(美国Thermo公司); MagAttract M48 DNA Manual Kit(组织/细胞基因组DNA提取试剂盒, 德国Qiagen公司); 7500实时荧光定量PCR仪(美国Thermo公司); 复合引物(上海生工生物工程有限公司); KASP V4.0 2X Master mix(竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应体系预混液, 英国LGC公司); SNP Typer软件(北京博奥晶典); DNA Ancetry Analyzer V1.0(族群来源分析系统, 北京公安部物证鉴定中心)。

1.2 研究对象

参考数据库中57个群体的3328份样本来源于文献^[11]。107份无关个体的静脉血DNA来源于国家科技资源共享服务平台计划项目(编号:YCZYPT[2017]01-3和2017JB025), 所有样本对象均签署知情同意书, 这些样本用于本课题的复合体系构建, 其中52份样本用于准确性验证, 20份有明确族群来源信息的样本用于验证族群推断的准确性(见表 1)。

表 1 20个测试个体的样本信息 Table 1 Sample information of 20 test individuals

1.3 SNPs位点的选取

本课题选取了来源于文献^[11]的74个SNP位点和文献^[12]的1个SNP位点rs174592共计75个SNP位点, 通过实验的筛选, 剔除扩增性能不稳定的3个位点如表 2, 最终保留文献^[11]的71个SNP位点和文献^[12]的1个SNP位点共计72个位点。见表 2。

表 2 75个SNPs位点的信息 Table 2 Information of the 75 single nucleotide polymorphisms (SNPs)

No.	SNP rs#	Length	Allele
1	rs1229984	94	C/T
2	rs1572018	103	C/T
3	rs1800414	91	C/T
4	rs1876482	90	A/G
5	rs1950993	102	G/T
6	rs2125345	102	C/T
7	rs2241894	89	C/T
8	rs2814778	86	C/T
9	rs310644	107	C/T
10	rs3737576	93	C/T
11	rs3827760	90	A/G
12	rs385194	100	A/G
13	rs734873	92	A/G
14	rs870347	98	A/C
15	rs2033111	94	A/G
16	rs2899826	97	A/G
17^*	rs3814134	90	A/G
18	rs3811801	95	A/G
19	rs1040404	109	A/G
20	rs174570	91	C/T
21	rs2006996	97	C/T
22	rs316598	104	C/T
23	rs10516441	95	A/G
24	rs174574	91	A/C
25	rs17822931	91	C/T
26	rs6054605	96	A/G
27	rs7745461	102	A/G
28	rs8003942	83	A/G
29	rs10108270	96	A/C
30	rs10496971	96	G/T
31	rs10512572	99	A/G
32	rs10513300	106	C/T
33	rs11652805	104	C/T
34	rs12913832	94	A/G
35	rs13400937	130	G/T
36	rs1426654	92	A/G
37	rs16891982	97	C/G
38	rs17028973	103	C/T
39	rs1871428	100	A/G
40	rs2024566	111	A/G
41	rs2166624	97	A/G
42	rs2238151	91	C/T
43	rs2242480	91	C/T
44	rs2986742	85	C/T
45	rs3118378	105	A/G
46	rs459920	107	C/T
47	rs4670767	101	G/T
48	rs4833103	93	A/C
49^*	rs4908343	91	A/G
50	rs6451722	106	A/G
51	rs647325	86	A/G
52	rs671	87	A/G
53	rs6754311	92	C/T
54	rs6990312	93	G/T
55	rs7226659	102	G/T
56	rs735480	92	C/T
57	rs7554936	100	C/T
57	rs7997709	99	C/T
58	rs7722456	94	C/T
59	rs798443	106	A/G
61	rs8021730	108	G/T
62	rs8035124	96	A/C
63	rs8113143	97	A/C
64	rs818386	109	C/T
65	rs917115	124	C/T
66	rs9319336	88	C/T
67^*	rs9522149	98	C/T
68	rs10236187	93	A/C
69	rs10511828	95	C/T
70	rs1513056	88	A/G
71	rs192655	95	A/G
72	rs2702414	112	A/G
73	rs37369	90	C/T
74	rs7238445	101	A/G
75	rs174592	100	A/G
* Unsuccessful SNPs for optimization.

表 2 75个SNPs位点的信息 Table 2 Information of the 75 single nucleotide polymorphisms (SNPs)

1.4 DNA提取和引物合成

本实验的检测对象为静脉血提取的基因组DNA, 采用QIAamp DNA Blood Midi Kit提取, 使用NanoDrop2000c分光光度计定量, 放置在4 ℃冰箱中备用; 血斑、血卡、口腔拭子、接触性检材以及同一样本来源人的心、肝、肾、脾、肺、皮肤、肌肉、软骨、大脑各组织, 采用MagAttract M48 DNA Manual Kit提取DNA, 血斑剪取的大小约为20 cm², 血卡剪取大小约为8 cm², 剪取擦拭口腔棉签的整个表面以及剪取擦拭鼠标棉签的整个表面, 同一样本来源人的心、肝、肾、脾、肺、皮肤、肌肉、软骨、大脑各组织、血斑、血卡使用NanoDrop2000c分光光度计定量, 口腔拭子、接触性检材使用7500实时荧光定量PCR仪定量。

使用软件Primer Premier 5.0设计SNP位点的引物。所有引物在生工生物工程有限公司进行合成。位点名称、扩增产物片段长度及等位基因信息见表 2。

1.5 芯片的检测流程

芯片在使用前每孔固定0.2 μL复合引物。使用时, 配制含有模板的扩增体系150 μL, 其中包含75 μL KASP V4.0 2X Master mix、20 μL模板DNA(7.5 ng/μL)和55 μL超净水; 将扩增体系注入芯片后以4000 r/min的转速离心2 min完成样本到反应孔中的分配; 之后用热封仪隔离芯片的各个反应孔; 完成隔离的芯片放置在平板PCR仪上进行PCR温度循环(参数为95 ℃15 min; 95 ℃ 20 s, 61~55 ℃ 1 min, 10个循环, 每个循环降0.6 ℃; 95 ℃ 20 s, 55 ℃ 1 min, 29个循环; 4 ℃保持); 完成扩增后, 芯片通过激光共聚焦扫描仪扫描并获取各个反应孔的荧光信号, 使用在线软件http://snptyper.capitalbiotech.online/进行基因分型获得各个位点的分型结果用于后续族群推断。

微流控SNP芯片通过激光共聚焦扫描仪扫描获得52份样品的3900个基因型, 扫描参数设置为Cyanine 5: power51, PMT515; Cyanine 3: power50, PMT500。使用SNP Typer软件判别SNP位点的分型, 具体如下:提取FAM(红色)通道S-B_Median-635和HEX(绿色)通道的S-B_Median-532的荧光值(S-B_Median是荧光值减去背景值的中位值)、Ratio_Medians-(635/532)值(Ratio_Medians-(635/532)=S-B_Median-635/S-B_Median-532), 判别标准如下^[13-15]。

判断阳性的标准有两个:(1)信噪比:S-B_Median与阴性对照(不加引物)的比值应该大于2, 该标准是为了排除假阳性信号; (2)S-B_Median大于4000。同时满足这两个条件后, 该位点的信号才可以算作阳性。

分型标准:(1)杂合子:如果两个等位基因都满足阳性标准, 且Ratio_Medians-(635/532)在0.5~2之间则为杂合子。(2)纯合子:如果某个突变位点, 只有一个等位基因满足阳性标准, 则为纯合子; 或者两个等位基因都满足阳性标准且Ratio_Medians-(635/532)＞2或＜0.5，则分别为FAM通道的纯合子或者是HEX通道的纯合子。

1.6 芯片性能的验证

1.6.1 准确性验证

随机抽取52份样本用微流控芯片检测72个位点的分型, 检测结果与MassArray^[16]所测的结果进行比对; 将芯片检测结果与MassArray分型不一致的样本用第一代基因测序(又名sanger法测序和双脱氧末端终止法测序, 毛细管电泳法)验证。

1.6.2 灵敏度验证

随机抽取5份样本, 做DNA梯度浓度稀释, 150 μL的体系中DNA模板最终的量分别为1500、750、300、150、75 ng, 每个浓度重复检验3次, 验证芯片对每个DNA梯度浓度的检测能力。

1.6.3 稳定性验证

随机抽取3份样本, 每份样本做3次重复用于验证芯片分型结果的稳定性。如果3次独立重复实验之间结果相同, 且荧光值的平均标准差小于4000, 则这3次实验结果的重复率为100%。

1.6.4 法医检材适应性验证

为了验证芯片是否适合各种案件检材, 采用实验室的一名志愿者(编号:HMS)的样本, 分别模拟血斑、血卡、口腔拭子、接触性检材等现场检材, 所有检材在晾干两周后提取DNA, 用芯片检测。其中血斑的载体是医用纱布, 接触性检材的制备方法是:用医用棉签蘸少量超净水轻轻擦拭HMS的常用鼠标, 采用MagAttract M48 DNA Manual Kit提取DNA。

1.6.5 芯片组织同一性验证

使用芯片检测同一样本来源人的心、肝、肾、脾、肺、皮肤、肌肉、软骨、大脑各组织的DNA, 验证芯片检测结果的一致性。

1.7 芯片检测样本的族群来源分析

使用芯片检测20份有明确族群来源信息的样本的SNPs分型, 用族群推断软件DNA Ancetry Analyzer V1.0计算群体的匹配概率(population assignment match probability, MP)和似然比(likelihood ratio, LR)^{[5, 17]}。当LR＞100时, MP值排在第一位的人群为未知个体的来源人群; 当LR＜100时, 应综合样本的祖先成分比例去分析, 祖先成分比例排在第一位的人群为未知个体的来源人群^[11]。用Structure V2.3.4软件^{[17, 18]}计算样本的祖先成分比例, K=5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 其中K是运行的次数, 参数设置10000 burn-ins, 10000 MCMC, 10 interaction。

2 结果与讨论

2.1 微流控芯片检测SNPs的结果

芯片检测结果如图 1a所示, 扩增完的芯片各反应孔里的体系饱满, 说明没发生泄露挥发等问题, 两种颜色分别代表FAM和HEX通道的荧光值, 两种颜色分别对应一个SNP位点的两种等位基因, 其中NC是不加引物时的阴性结果。图 1b是SNP位点rs9319336在98份样本中的分型散点图, 说明该位点的基因分型在98份样本中全部检出, SNP位点编号对应rs号见表 2。

图 1 微流控芯片检测SNP rs9319336位点的结果图 Fig. 1 Detection results of SNP rs9319336 by microfluidic chip a. chip scanning diagram; b. scatter plot.

本课题将竞争性等位基因特异性PCR(KASP)方法与微流控SNP检测技术进行结合, 应用于法医族群推断的研究。在微流控芯片的每个反应孔中放置一个位点的引物, 可以防止不同位点引物间的相关干扰; 芯片是一次性使用, 可以有效防止样本间污染, 提高芯片检测基因型的准确性。目前已有的大量SNP检测技术主要包括基于PCR的等位基因特异性扩增法、TaqMan探针法、单碱基引物延伸法、基于质谱的MassArray系统、芯片法、下一代测序法等, 其中芯片法、下一代测序法的优势在于高通量SNP位点检测。然而下一代测序技术目前主要以国外平台为主, 价格昂贵, 而且检测时间较长。为此, 我们选择了自主研发的微流控芯片技术进行体系构建, 整个检测和分型过程在2.5 h左右即可完成, 与MassArray系统、单碱基引物延伸法以及下一代测序等技术比较, 检测时间显著缩短。

2.2 芯片检测的功能性验证

2.2.1 芯片检测的准确性

使用构建成功的微流控芯片复合体系对52份样本的72个位点进行检测, 检出率为100%。比对微流控SNP芯片(iMAP)与MassArray这两个平台对52个样本的72个位点的检测结果, 有71个位点在所有样本中两个平台的检测结果一致, 而1个位点在部分样本中两个平台检测不一致, 位点检测的一致率为98.6%。对于这些有1个位点检测不一致的样本, 我们用一代测序进行最终确认, 发现一代测序的检测结果与芯片检测结果一致。

通过与MassArray检测结果进行比对, 出现不一致的结果时使用第一代基因测序进行验证, 发现检测结果正确率达到100%。

2.2.2 芯片检测的灵敏度

结果显示5份样本的DNA模板量在150 ng时仍然能够正确检测72个位点, 但是DNA量在75 ng时, 出现3个位点信号丢失, 说明目前微流控SNP平台检测人DNA模板量最低限是150 ng, 每个反应孔需要DNA 1.28 ng。以9号样本为例, 随着DNA量的逐渐降低, 每个位点所对应的荧光值变化不大, 9号样本在75 ng时60、66、71号这3个位点的信号值开始丢失(见图 2)。

图 2 2150 ng、75 ng的9号样本每个位点3次重复所对应FAM通道与HEX通道的荧光平均值及标准差 Fig. 2 Average of three replicate fluorescence and standard deviation of FAM channel and HEX channel corresponding to each SNP of 150 ng and 75 ng of sample No. 9 a. 150 ng DNA; b. 75 ng DNA.

芯片的检出限是150 ng, 针对此不足之处, 未来拟通过预扩增等方法提升芯片检测的灵敏度。

2.2.3 芯片检测的稳定性

将同一个样本(4号样本)进行3次重复实验, 根据之前设定的阈值, 3次重复实验检测的基因型结果相同，荧光信号值的平均标准差小于4000, 证明重复率达到100%。这3次实验结果的重复率为100%, 说明芯片的稳定性、重复性良好(见图 3)。

图 3 4号样本3次重复实验的芯片图及每个位点所对应FAM通道与HEX通道荧光值的平均值及标准差 Fig. 3 Three repetition chip scanning diagrams of No. 4 sample with average fluorescence values and standard deviations of FAM channel and HEX channel corresponding to each SNP a, b, c. chip scanning diagrams; d. the extracted fluorescent intensity for each SNP site.

2.2.4 法医检材适应性验证

除了对血液样本提取的基因组DNA进行SNP检测之外, 还对不同法医检材样本提取的基因组DNA进行了SNP检测, 包括血斑、血卡、口腔拭子和接触性检材。其中血斑、血卡提取的基因组DNA定量后的质量浓度分别为25.2 ng/μL和11.3 ng/μL, 分别取体积6 μL和13.3 μL, 基因组DNA的总量分别为151.2 ng和150.3 ng, 达到了150 ng的检测阈值。口腔拭子、接触性检材定量的浓度分别为7.51 ng/μL和0.036 ng/μL, 分别取体积20 μL, 总量分别为150.2 ng和0.72 ng, 口腔拭子的DNA总量达到了150 ng的检测阈值, 接触性检材的DNA总量低于芯片的检出限150 ng, 所以无法满足微流控芯片平台检测的需要。对于血斑、血卡、口腔拭子, 用芯片所测72个位点结果与MassArray检测结果一致(见图 4)。

图 4 HMS号样本的FAM通道与HEX通道中每个位点所对应荧光值 Fig. 4 Fluorescence values of each SNP of sample HMS in FAM and HEX channels a. blood stain; b. blood card; c. buccal swab.

该芯片体系可适合多种法医检材的检测需要, 如静脉血、血斑、血卡、口腔拭子等样本, 但是一些提取DNA含量在150 ng以下的检材, 比如接触性检材, 无法满足微流控芯片平台检测的需要。

2.2.5 芯片组织同一性验证结果

9份组织(心、肝、肾、皮肤、软骨、大脑、肌肉、脾、肺)DNA的72位点的检出率是100%, 所有SNP位点分型在9份组织样本中都一致(见图 5)。

图 5 9份组织DNA FAM通道与HEX通道中每个位点所对应荧光的平均值及标准差 Fig. 5 Average fluorescence values and standard deviations for each SNP of nine tissue DNA in FAM and HEX channels

组织同一性验证表明芯片检测同一人份的不同组织样本获得的SNP分型一致。

2.3 芯片检测样本的族群推断结果

2.3.1 祖先成分计算结果

分析用Structure得到的20份样本的祖先成分, 在K=10时20个样本在东亚的祖先成分相比其他族群所占的比例是最高的(见表 3), 初步推断20个样本全部来自于东亚。

表 3 20份样本的祖先成分(Structure, K=10) Table 3 Ancestry components of 20 samples (Structure, K=10)

No.	Ancestry components of ten intercontinental populations
No.	NA	AME	EA	PAC	N-AFR	SA	S-AFR	EUR	SWA	SEA
1	0.004	0.006	0.963	0.002	0.005	0.001	0.002	0.002	0.002	0.014
2	0.023	0.009	0.791	0.003	0.128	0.004	0.003	0.014	0.011	0.014
3	0.014	0.008	0.814	0.003	0.106	0.006	0.008	0.025	0.011	0.004
4	0.003	0.005	0.825	0.006	0.096	0.003	0.003	0.002	0.004	0.052
5	0.005	0.004	0.956	0.002	0.013	0.003	0.004	0.002	0.002	0.009
6	0.032	0.004	0.742	0.006	0.052	0.044	0.006	0.018	0.018	0.077
7	0.039	0.069	0.667	0.009	0.152	0.017	0.011	0.009	0.018	0.008
8	0.007	0.007	0.943	0.002	0.023	0.003	0.001	0.003	0.004	0.009
9	0.014	0.005	0.935	0.002	0.007	0.002	0.001	0.022	0.007	0.005
10	0.002	0.005	0.97	0.002	0.013	0.002	0.001	0.001	0.001	0.003
11	0.004	0.007	0.855	0.006	0.041	0.059	0.003	0.009	0.01	0.006
12	0.001	0.001	0.976	0.002	0.01	0.002	0.002	0.001	0.001	0.005
13	0.005	0.003	0.969	0.004	0.005	0.003	0.002	0.002	0.002	0.006
14	0.002	0.003	0.966	0.002	0.017	0.001	0.003	0.001	0.001	0.003
15	0.009	0.005	0.886	0.004	0.005	0.054	0.005	0.008	0.02	0.004
16	0.002	0.002	0.979	0.001	0.005	0.002	0.001	0.002	0.001	0.004
17	0.003	0.049	0.53	0.002	0.397	0.008	0.003	0.003	0.003	0.003
18	0.003	0.002	0.969	0.003	0.007	0.004	0.002	0.002	0.004	0.004
19	0.003	0.003	0.633	0.003	0.329	0.009	0.002	0.006	0.004	0.007
20	0.016	0.012	0.779	0.006	0.126	0.008	0.003	0.002	0.005	0.042
*NA, AME, EA, PAC, N-AFR, SA, S-AFR, EUR, SWA, SEA are the abbreviations of North Asia, America, East Asia, Oceania, North Africa, South Asia, South Africa, Europe, Southwest Asia, Southeast Asia, respectively.

表 3 20份样本的祖先成分(Structure, K=10) Table 3 Ancestry components of 20 samples (Structure, K=10)

2.3.2 群体匹配概率和似然比

根据数据库中72个SNPs等位基因频率, 用DNA Ancetry Analyzer V1.0计算出20份样本的群体匹配概率和似然比(见表 4), 似然比不是指数值, 而是指排在第一位的群体匹配概率与第二位群体匹配概率的比值, 群体匹配概率和似然比的意义是推断待测样本的祖先来源, 表 4中列出20份样本群体匹配概率排在前5的洲际, 从数据可以看出, 20个样本似然比最大是东亚, 群体匹配概率最高的是东亚, 初步推断20份样本全部来自于东亚。按照表 4的结果, 样本5、6、20似然比均小于100, 不能排除其来自东亚或东南亚; 综合样本5、6、20的祖先成分去判断, 样本5、6、20排在第一位的祖先成分都是东亚, 所以最终判断20份样本全部来自于东亚。

表 4 20份样本的似然比和群体匹配概率 Table 4 Population likelihood ratio (LR) and population assignment match probability (MP) of 20 samples

No.	LRs				Population MPs
No.	EA/SEA	EA/NA	EA/PAC	EA/SA	EA	SEA	NA	PAC	SA
1	2.16×10²	2.52×10⁹	4.51×10¹⁷	3.09×10⁵³	6.19×10^-25	2.87×10^-27	2.45×10^-34	1.37×10^-42	2.01×10^-78
2	1.16×10⁴	9.14×10⁷	3.63×10²⁷	3.00×10⁴⁵	8.14×10^-25	7.01×10^-29	8.90×10^-33	2.24×10^-52	2.71×10^-70
3	1.06×10¹⁵	7.31×10⁷	1.49×10³⁹	6.63×10⁴²	2.30×10^-26	2.18×10^-41	3.15×10^-34	1.55×10^-65	3.47×10^-69
4	2.15×10²	5.26×10⁹	4.34×10²⁶	1.58×10⁴⁶	8.53×10^-21	3.97×10^-23	1.62×10^-30	1.97×10^-47	5.40×10^-67
5	4.85×10¹	1.77×10⁷	8.95×10²⁷	9.03×10³⁰	8.86×10^-26	1.83×10^-27	5.01×10^-33	9.90×10^-54	9.81×10^-57
6	1.32×10⁰	5.04×10⁴	1.19×10¹⁰	1.80×10²⁶	6.96×10^-25	5.27×10^-25	1.38×10^-29	5.84×10^-35	3.86×10^-51
7	1.03×10⁴	2.71×10⁵	7.24×10⁹	1.81×10²⁹	4.74×10^-27	4.59×10^-31	1.75×10^-32	6.55×10^-37	2.62×10^-56
8	1.70×10³	2.70×10⁷	1.12×10²⁹	1.10×10⁴⁵	2.73×10^-23	1.60×10^-26	1.01×10^-30	2.44×10^-52	2.49×10^-68
9	1.66×10¹⁵	9.81×10⁷	6.66×10²⁹	1.62×10⁴⁹	4.34×10^-24	2.62×10^-39	4.42×10^-32	6.51×10^-54	2.67×10^-73
10	4.42×10⁴	1.22×10¹⁰	2.22×10¹⁷	2.42×10³⁷	7.29×10^-23	1.65×10^-27	5.99×10^-33	3.28×10^-40	3.01×10^-60
11	1.32×10²	2.21×10⁶	4.05×10²⁵	4.06×10³⁸	1.91×10^-28	1.45×10^-30	8.65×10^-35	4.73×10^-54	4.71×10^-67
12	2.52×10³	5.09×10¹⁵	4.34×10¹⁹	3.11×10⁵¹	5.64×10^-21	2.24×10^-24	1.11×10^-36	1.30×10^-40	1.81×10^-72
13	1.44×10³	1.77×10⁸	6.63×10¹³	2.05×10⁴⁷	6.77×10^-23	4.69×10^-26	3.83×10^-31	1.02×10^-36	3.30×10^-70
14	1.22×10⁵	3.64×10¹⁰	2.30×10¹⁶	7.75×10³⁶	2.12×10^-23	1.73×10^-28	5.83×10^-34	9.22×10^-40	2.73×10^-60
15	1.32×10²	4.10×10³	4.23×10²¹	1.47×10¹⁹	4.40×10^-25	3.33×10^-27	1.07×10^-28	1.04×10^-46	2.99×10^-44
16	8.64×10³	1.20×10¹⁰	1.99×10¹⁷	1.43×10⁴⁵	9.12×10^-25	1.06×10^-28	7.63×10^-35	4.57×10^-42	6.37×10^-70
17	6.87×10⁵	1.07×10¹¹	2.64×10³²	3.67×10³⁰	1.63×10^-26	2.37×10^-32	1.53×10^-37	6.18×10^-59	4.44×10^-57
18	9.94×10²	1.33×10⁶	3.24×10¹⁴	4.10×10³⁰	2.30×10^-24	2.32×10^-27	1.73×10^-30	7.11×10^-39	5.62×10^-55
19	6.31×10³	1.65×10¹³	7.66×10³⁰	1.19×10⁵⁰	1.44×10^-23	2.28×10^-27	8.73×10^-37	1.88×10^-54	1.21×10^-73
20	5.83×10¹	2.03×10⁵	1.60×10⁸	1.98×10¹⁴	7.74×10^-24	1.33×10^-25	3.81×10^-29	4.82×10^-32	3.91×10^-38

表 4 20份样本的似然比和群体匹配概率 Table 4 Population likelihood ratio (LR) and population assignment match probability (MP) of 20 samples

使用20份样本的分型结果进行族群推断, 祖先成分及似然比结果显示20份样本来源于东亚, 与样本的实际来源一致。

3 结论

微流控芯片主要应用于临床诊断等领域^[19], 本研究建立了72-plex-SNPs的微流控芯片族群推断系统, 该芯片体系具有如下优势:(1)芯片耗材、检测仪器均为国产, 检测成本较低; (2)芯片检测速度快, 2.5 h可以完成72个SNP位点的检测分型; (3)每个SNP位点分布在不同的反应孔中, 相互隔离, 减少了不同位点引物之间的相关干扰, 复合体系构建难度降低。(4)检测流程简单, 便于基于此芯片构建“样本进-结果出”的一体化微流控检测装备。本研究初步尝试成功构建了72个SNP位点的芯片体系, 各项指标显示可以用于法医DNA检验, 非常容易在国内法医DNA实验室推广应用。但是目前的芯片对DNA的需求量还较大, 不适合于微量样本的检测, 未来还需要在提高灵敏度方面进行进一步的改进; 另外, 还需在芯片点样自动化、集成化一体化检测仪器研究方面进行努力^{[20, 21]}。

参考文献

[1]	Jia J. [PhD Dissertation]. Chongqing: Chongqing Medical University, 2014 贾竟. [博士学位论文]. 重庆: 重庆医科大学, 2014
[2]	Frudakis T, Venkateswarlu K, Thomas M J, et al. J Forensic Sci, 2003, 48(4): 771.
[3]	Phillips C, Salas A, Sanchez J J, et al. Forensic Sci Int Genet, 2007, 1(3/4): 273.
[4]	Jia J, Wei Y L, Qin C J, et al. Forensic Sci Int Genet, 2014, 8(1): 187. doi: 10.1016/j.fsigen.2013.09.004
[5]	Wei Y L, Wei L, Zhao L, et al. Int J Legal Med, 2016, 130(1): 27. doi: 10.1007/s00414-015-1183-5
[6]	Kidd J R, Friedlaender F R, Speed W C, et al. Investig Genet, 2011, 2(1): 1. doi: 10.1186/2041-2223-2-1
[7]	Kosoy R, Nassir R, Tian C, et al. Hum Mutat, 2009, 30(1): 69. doi: 10.1002/humu.v30:1
[8]	Kidd K K, Speed W C, Pakstis A J, et al. Forensic Sci Int Genet, 2014, 10: 23. doi: 10.1016/j.fsigen.2014.01.002
[9]	Churchill J D, Schmedes S E, King J L, et al. Forensic Sci Int Genet, 2016, 20: 20. doi: 10.1016/j.fsigen.2015.09.009
[10]	Keating B, Bansal A T, Walsh S, et al. Int J Legal Med, 2013, 127(3): 559. doi: 10.1007/s00414-012-0788-1
[11]	Li C X, Pakstis A J, Jiang L, et al. Forensic Sci Int Genet, 2016, 23: 101. doi: 10.1016/j.fsigen.2016.04.002
[12]	Kim J J, Verdu P, Pakstis A J, et al. Hum Genet, 2005, 117(6): 511. doi: 10.1007/s00439-005-1334-8
[13]	Bayer R J, Mabberley D J, Morton C, et al. Am J Bot, 2009, 96(3): 668. doi: 10.3732/ajb.0800341
[14]	Nei M. Proc Nati Acad Sci U S A, 1973, 70(12): 3321. doi: 10.1073/pnas.70.12.3321
[15]	Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. Mol Biol Evol, 2007, 24(8): 1596. doi: 10.1093/molbev/msm092
[16]	Li L, Li C T, Li R Y, et al. Forensic Sci Int, 2006, 162(1/3): 74.
[17]	Hubisz M J, Falush D, Stephens M, et al. Mol Ecol Resour, 2009, 9(5): 1322. doi: 10.1111/men.2009.9.issue-5
[18]	Jiang L, Sun Q F, Ma Q, et al. Hereditas (Beijing), 2017, 39(2): 166. 江丽, 孙启凡, 马泉, 等. 遗传, 2017, 39(2): 166.
[19]	Schumacher S, Nestler J, Otto T, et al. Lab Chip, 2012, 12(3): 464. doi: 10.1039/C1LC20693A
[20]	Krishnadasan S, Brown R J, de Mello A J, et al. Lab Chip, 2007, 7(11): 1434. doi: 10.1039/b711412e
[21]	Liu Z M, Yang Y, Du Y, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2017, 45(2): 282. 刘赵淼, 杨洋, 杜宇, 等. 分析化学, 2017, 45(2): 282. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.160498