色谱  2018, Vol. 36 Issue (7): 678-684   PDF    
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韦 俊芳
姜 磊
楼 超艳
朱 岩
超临界流体色谱同时测定运动饮料中的8种邻苯二甲酸酯类增塑剂
韦俊芳1, 姜磊2, 楼超艳3, 朱岩3     
1. 浙江大学公共体育与艺术部, 浙江 杭州 310000;
2. 浙江省纺织测试研究院, 浙江 杭州 310013;
3. 浙江大学化学系, 浙江 杭州 310000
收稿日期：2018-01-09
通讯联系人：楼超艳, E-mail:11437039@zju.edu.cn; 朱岩, E-mail:zhuyan@zju.edu.cn
摘要：建立了同时快速测定运动饮料中邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二戊酯、邻苯二甲酸丁基苄基酯、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯、邻苯二甲酸二辛酯8种邻苯二甲酸酯（PAEs）类增塑剂的超临界流体色谱-紫外检测分析方法。实际样品经液相萃取后，用超临界流体色谱分析，以超临界态二氧化碳-3%（体积分数）甲醇作为色谱流动相进行等度洗脱，检测波长为225 nm，6 min即可实现分离。8种PAE类增塑剂在0.05~25 mg/L范围内均具有良好的线性关系，相关系数为0.9991~0.9997，方法检出限为7.5~15 μg/L。8种PAE类增塑剂在运动饮料样品中的加标回收率为91.7%~100.2%，相对标准偏差均不大于6.5%（n=3）。应用该方法对多种市售运动饮料中的8种PAE类增塑剂进行检测，结果表明，该方法环保、快速、灵敏、选择性高、结果准确，能满足运动饮料中增塑剂含量检测的要求。
关键词：超临界流体色谱    液相萃取    邻苯二甲酸酯    增塑剂    运动饮料    
Simultaneous determination of eight phthalate ester plasticizers in sports beverages using supercritical fluid chromatography
WEI Junfang1, JIANG Lei2, LOU Chaoyan3, ZHU Yan3     
1. Department of Public Physical Art Education, Zhejiang University, Hangzhou 310000, China;
2. Zhejiang Textile Testing Research Institute, Hangzhou 310013, China;
3. Department of Chemistry, Zhejiang University, Hangzhou 310000, China
Abstract: Phthalate esters (PAEs) are a group of serious environmental pollutants that are carcinogenic or tumorigenic to humans. In this work, a green, rapid, and effective analytical method based on supercritical fluid chromatography (SFC) has been proposed for the simultaneous determination of the eight PAE plasticizers in sports beverage samples. They are dimethyl phthalate (DMP), diethyl phthalate (DEP), dipropyl phthalate (DPRP), dibutyl phthalate (DBP), dipentyl phthalate (DPP), benzyl butyl phthalate (BBP), di-2-ethylhexyl phthalate (DEHP), and di-n-octyl phthalate (DNOP). Liquid phase extraction (LPE) was employed to extract the PAE plasticizers before testing using SFC with ultraviolet (UV) detection. SFC parameters, including stationary phase screening, modifier composition and volume percentage, column temperature, flow rate, and backpressure, were optimized. Under the optimum conditions, all the eight PAE plasticizers could be determined simultaneously by SFC within 6 min at 225 nm. The optimized eluent was supercritical CO2 with 3% (v/v) methanol. The performance of the developed method was also evaluated. The eight PAE plasticizers exhibited satisfactory linearities with correlation coefficients (r) of 0.9991-0.9997 in the range of 0.05-25 mg/L. The limits of detection ranged from 7.5 to 15 μg/L (S/N=3, n=3). Recoveries of all the PAE plasticizers for the spiked samples ranged from 91.7%-100.2% with relative standard deviations of no more than 6.5% (n=3). This method is green, time-saving, simple, selective, robust, and convenient for the analysis of the eight PAE plasticizers in real sports beverage samples.
Key words: supercritical fluid chromatography(SFC)     liquid phase extraction(LPE)     phthalate esters(PAEs)     plasticizer     sports beverages    

增塑剂是一类可以在一定程度上与聚合物混溶的低挥发性有机物, 增塑剂通过削弱聚合物分子链间的引力使聚合物体系的可塑性和柔韧性增强, 是食品包装、儿童玩具、医疗器械所用聚合物高分子材料中不可或缺的助剂[1, 2]。邻苯二甲酸酯(phthalate esters, PAEs)类化合物, 又称酞酸酯, 是目前广泛使用的一类增塑剂, 在塑料制品中的添加量达20%~50%[3, 4]。此类化合物在环境中难以降解, 已成为全球最普遍的环境污染物之一。研究[4-7]表明, PAE类增塑剂是一类环境雌激素, 具有雌激素的特征, 使人体产生抗雄激素效应, 影响激素分泌, 进而对内分泌系统产生干扰, 临床上表现为发育异常及生殖能力下降等, 在人体内长期积累会导致畸形、癌变和突变。国外研究小组[8]通过动物试验还发现, 受PAE类增塑剂污染的小鼠存活率降低, 体重减轻, 肝肾功能下降, 血中正常红细胞数量减少。PAE类增塑剂会导致动物仔胎在发育过程中出现腭裂、脊柱畸形、心脏变形、眼睛缺陷、指或趾畸形、肢变形等严重后果[8]。日常生活中的很多用品为塑料制品, 而PAE类增塑剂与塑料制品之间仅仅靠氢键或范德华力结合, 易迁移到外环境中, 再通过饮水、进食、皮肤接触和呼吸等途径进入人体, 存在极大的安全隐患[9]。食品是人体摄入增塑剂的一大来源, 以运动饮料为例, 目前绝大多数市售运动饮料瓶的包装材料都是塑料, 包装材料中的增塑剂与饮料接触时很容易通过扩散、浸出等方式迁移到饮料中, 危害人体健康。因此建立准确、快速、环保、灵敏的分析方法对运动饮料中PAE类增塑剂的含量监测十分必要。

目前文献中有关PAE类增塑剂的测定方法主要有高效液相色谱法[10, 11]、气相色谱法[1, 12]、超高效液相色谱法[13]、气相色谱-串联质谱法[14, 15]和液相色谱-串联质谱法[16, 17]等。上述分析方法中, 超高效液相色谱检测技术尚未普及; 气相色谱法精密度相对较差, 实验结果误差较大, 气相色谱的气源在燃烧时也存在潜在的危险性; 液相色谱在分析过程中需要大量有机溶剂作为流动相, 对分析人员和环境都会造成毒害。超临界流体色谱(SFC)[18-20]一般以超临界态二氧化碳作为流动相, 无毒性, 在对PAE类化合物进行分离时只需加入少量的改性试剂, 通过优化色谱分离条件可实现对这类增塑剂的高效快速分离, 对食品中PAE类增塑剂的检测分析具有重要作用和意义。

本文针对运动饮料中的PAE类增塑剂建立了同时测定邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丙酯(DPRP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二戊酯(DPP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二辛酯(DNOP)共8种PAE类增塑剂的SFC-UV检测分析方法。该方法快速、高效、选择性高, 适用于实际检测工作中各类饮料样品里多种增塑剂的同时检测分析。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Shimadzu Nexera UC超临界流体色谱仪, 配置紫外检测器(日本岛津公司); SBL-5DTS超声波恒温清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司); Millipore simplicity超纯水机(美国Millipore公司)。色谱柱:Ultimate C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm, 美国Welch公司); Wonda Cract ODS-2(250 mm×4.6 mm, 5 μm, 日本岛津公司); Zorbax SB C8(250 mm×4.6 mm, 5 μm, 美国Agilent公司)。

甲醇、乙腈均为HPLC级, 购自阿拉丁试剂公司; DMP、DEP、DPRP、DBP、DPP、BBP、DEHP和DNOP共8种PAE类增塑剂标准化合物(相关信息见表 1和图 1)购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。实验室用水为18.2 MΩ·cm去离子水(Millipore Simplicity)。实验过程中严格清洗容器, 避免塑料器皿的使用, 以防干扰实验结果。

表 1 8种邻苯二甲酸酯(PAE)类增塑剂的CAS号、分子式、相对分子质量和纯度 Table 1 CAS numbers, formulas, relative molecular masses and purities of the eight phthalate ester (PAE) plasticizers

图 1 8种PAE类增塑剂的化学结构式 Fig. 1 Chemical structures of the eight PAE plasticizers
1.2 溶液配制

PAE类增塑剂混合标准储备液的配制:准确称取20.0 mg的各标准化合物, 用甲醇溶解, 转移至同一100 mL玻璃容量瓶中, 用甲醇定容, 配制成200 mg/L的混合标准储备液, 超声后置于-4 ℃储存备用。

PAE类增塑剂标准工作液的配制:用甲醇逐级稀释混合标准储备液, 配制成混合标准工作液, 置于-4 ℃保存, 现配现用。

1.3 样品前处理

取3份同一品牌同一种类未拆封的运动饮料样品, 混合均匀, 准确称取5.0 g(若实际运动样品中含有二氧化碳则先除去二氧化碳), 转移至洁净的25 mL具塞磨口玻璃试管中。加入固体氯化钠至饱和, 加入5.0 mL甲醇, 振荡至溶液充分混合均匀, 超声30 min。待样品溶液完全分散后以5 000 r/min的速度离心10 min, 收集上清液(甲醇层), 供SFC分析。

1.4 SFC分析条件

色谱柱为Ultimate C18色谱柱; 流速为1.6 mL/min; 进样量为5.0 μL; 柱温为38 ℃; 流动相为超临界态二氧化碳(纯度≥99.999%)-3%(体积分数, 下同)甲醇, 等度洗脱; 背压为10 MPa; 检测波长为225 nm。

2 结果与讨论
2.1 色谱柱的筛选

取3种商品化色谱柱:Ultimate C18、Wonda Cract ODS-2和Zorbax SB C8(尺寸皆为250 mm×4.6 mm, 5 μm)。以超临界态二氧化碳-3%甲醇为流动相, 在1.6 mL/min的流速下测定3种色谱柱对8种PAE类增塑剂的分离效果。由图 2可知, Ultimate C18色谱柱对8种PAE类增塑剂的分离效果最佳, 在6 min内可实现基线分离。Wonda Cract ODS-2和Zorbax SB C8色谱柱对目标化合物的选择性较低, 色谱峰数较少, 目标化合物在这两种色谱柱上出现拖尾现象, Zorbax SB C8色谱柱的拖尾现象尤为严重。综上所述, 选择Ultimate C18色谱柱进行后续实验。

图 2 3种不同色谱柱对8种PAE类增塑剂分离效果的影响 Fig. 2 Effects of the three different columns on the separation efficiencies of the eight PAE plasticizers
2.2 SFC条件优化
2.2.1 改性剂

PAE类增塑剂是弱极性化合物, 在SFC中使用的超临界态二氧化碳流体是非极性溶剂, 对极性化合物的溶解性能和洗脱能力较弱, 为增强流动相对PAE类增塑剂的溶解性能和洗脱能力, 达到更好的分离效果, 往往需要在超临界态二氧化碳流体中加入少量的极性有机溶剂(改性剂)。不同有机溶剂的选择性和洗脱能力各不相同, 能有效改变目标化合物的峰形和保留时间, 以获得最佳的分离效果。如图 3所示, 本试验考察了3种不同的极性改性剂(甲醇、乙醇和乙腈)对SFC分离PAE类增塑剂的影响分离效果。用乙醇作改性剂时, 峰形和分离度较差, 而且由于乙醇的黏度相对较高, 导致系统压力升高, 长期使用可能会影响色谱柱的使用寿命; 用乙腈作改性剂时, 出峰不完全, 有拖尾, 分离效果差; 用甲醇作改性剂时, 峰形尖窄对称, 分离效果得到很大的提高, 能同时分离8种PAE类增塑剂。因此, 最终选择甲醇作为改性剂来分离8种PAE类增塑剂。

图 3 使用(a)3种改性剂(甲醇、乙醇和乙腈)及(b)添加不同体积分数甲醇时8种PAE类增塑剂的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of the eight PAE plasticizers using (a) three different modifiers (methanol, ethanol and acetonitrile) and (b) methanol with different volume percentages

选择甲醇作为改性剂后, 探究了甲醇在流动相中的比例对分离效果的影响。较高的改性剂浓度可以缩短待测组分的分析时间, 但同时也会降低相邻组分的分离选择性。如图 3b所示, 改性剂在流动相中的比例对分离的影响十分明显, 随着甲醇的体积分数从1%升到10%, 8种PAE类增塑剂的保留时间明显变短, 但当甲醇体积分数达到8%及以上时, DMP和DEP不能有效分离。当甲醇体积分数为5%时, DMP和DEP的分离度低于1.3, 无法达到定量要求。因此, 综合考虑样品中目标组分的分离效果和定量要求, 最终选择在流动相中添加体积分数为3%的甲醇。

2.2.2 温度、流速和背压

温度、流速和背压是影响SFC分离效果的主要因素。在本试验中, 以混合标准溶液为样品, 采用超临界态二氧化碳-3%甲醇等度洗脱, 在Ultimate C18色谱柱上分别考察了温度、流速和背压对分离效果的影响。

一般情况下, 在液相色谱中, 随着温度的升高, 目标化合物在固定相上的吸附/脱附会加快, 从而加速样品的分离, 缩短保留时间; 而在SFC中, 由于超临界态流动相的密度受温度影响变化明显, 温度的升高会使流动相的密度降低, 从而减慢目标化合物在固定相上的吸附/脱附过程, 使保留时间延长。在本试验中, 保持其他条件一致, 研究不同温度(34、36、38、40和42 ℃)下8种PAE类增塑剂的分离效果。如图 4a所示, 随着温度的升高, 8种PAE类增塑剂的保留时间延长。在34和36 ℃下, 峰1和峰2的分离度有待提高。因此选择38 ℃作为最佳温度条件。在此温度下, 8种PAE类增塑剂可在6 min内实现完全分离。

图 4 (a) 温度、(b)流速和(c)背压对8种PAE类增塑剂分离的影响 Fig. 4 Effects of (a) temperature, (b) flow rates and (c) backpressure on the separation of the eight PAE plasticizers

保持其他条件一致, 研究不同流速(1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 mL/min)对分离8种PAE类增塑剂的影响, 结果见图 4b。随着流速的增大, 目标化合物的保留时间缩短, 但当流速超过1.6 mL/min时, DMP和DEP的分离度低于1.3, 8种PAE类增塑剂不能完全分离, 不利于进行定量分析, 因此综合考虑分离度和分析时间, 选择1.6 mL/min作为最佳流速。

系统背压的变化会改变流动相的密度, 从而影响对目标化合物的洗脱能力和选择性。背压升高, 超临界流体的密度增大, 对分析物的溶解和洗脱能力增强。保持其他条件一致, 研究了不同的系统背压(10、11、12、13和14 MPa)对PAE类增塑剂分离的影响。图 4c表明, 随着背压的增大, 8种PAE类增塑剂的保留均减弱。虽然背压的增大可以有效缩短分析时间, 但考虑到背压太大会使分离度降低(DMP和DEP的分离度低于1.3), 最终选择背压为10 MPa对8种PAE类增塑剂进行分离。在此色谱条件下, 8种PAE类增塑剂可以完全分离, 峰形对称。

经过以上优化, 最终选择Ultimate C18色谱柱作为色谱柱, 流动相组成为超临界态二氧化碳-3%甲醇, 在温度为38 ℃、流速为1.6 mL/min和背压为10 MPa的最佳条件下, 8种PAE类增塑剂能在6 min内实现完全分离。

2.3 线性范围及检出限

将8种PAE类增塑剂的混合标准溶液用甲醇稀释成系列标准工作液, 在超临界流体色谱最佳条件下进样分析。8种PAE类增塑剂的线性方程、线性范围、相关系数及检出限见表 2。8种PAE类增塑剂在线性范围(0.05~25 mg/L)内均具有良好的线性关系, 相关系数均大于0.999, 检出限为7.5~15 μg/L。

表 2 8种PAE类增塑剂的线性方程、线性范围、相关系数(r)及检出限(n=3) Table 2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients (r) and LODs of the eight PAE plasticizers (n=3)
2.4 回收率及精密度

将实际样品分成3份, 分别添加0.1、0.2和0.4 mg/L混合标准溶液, 按照1.3节样品前处理方法进行处理, 按1.4节的色谱条件进行检测, 回收率及精密度数据见表 3。结果表明, 8种PAE类增塑剂的加标回收率为91.7%~100.2%, 相对标准偏差均不大于6.5%。

表 3 实际运动饮料样品中8种PAE类增塑剂的回收率及相对标准偏差(n=3) Table 3 Recoveries and RSDs of the eight PAE plasticizers in real sports beverage samples (n=3)
2.5 样品分析

抽取8种不同品牌不同种类的运动饮料, 按1.3节样品前处理方法进行处理, 按1.4节色谱条件进行检测。其中7种运动饮料样品中均未检出PAE类增塑剂。样品3中检出3种增塑剂, 分别为:DEP(0.338 mg/L)、DPRP(0.320 mg/L)和DBP(0.387 mg/L), 色谱图见图 5。

图 5 (a) 空白样品、(b)实际运动饮料样品及(c)实际加标(2 mg/L)运动饮料样品的色谱图 Fig. 5 Chromatograms of (a) the blank sample, (b) real sports beverage sample and (c) real sports beverage sample spiked with 2 mg/L PAEs
2.6 方法对比

如表 4所示, 通过本方法和文献方法的对比发现, 本方法不仅具有良好的线性、精密度和稳定性, 而且可以用于更多种类的PAE类增塑剂的同时分离分析, 分析时间比其他方法短(只需6 min), 在实验过程中也避免了大量使用有毒有害有机溶剂, 有效减少了对工作人员和环境的危害。

表 4 本方法与文献方法的对比 Table 4 Comparison of the method used in this study and others used in literature
3 结论

本文采用SFC法同时检测运动饮料中的DMP、DEP、DPRP、DBP、DPP、BBP、DEHP和DNOP 8种PAE类增塑剂。该方法绿色环保、简单快速、灵敏性强、选择性高、结果准确, 在6 min内即可完成样品的分析, 在实际样品的批量检测中有巨大的优势。

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