蛋白质组(proteome)由澳大利亚科学家Marc Wilkins和Keith Williams[1]于1994年提出, 1995年报道于Electrophoresis杂志。蛋白质组是一个基因组或一个细胞、组织表达的所有蛋白质, 会随着环境、时间、地点等因素的改变而改变。蛋白质组的提出标志着蛋白质组学(proteomics)的诞生, 蛋白质组学研究特定条件下蛋白质整体水平的存在状态及活动规律[2], 从蛋白质水平上对蛋白质的作用模式、功能机理、调节控制以及蛋白质间的相互作用进行探索。
根据研究目的不同, 蛋白质组学的研究内容主要包括:鉴定特定细胞、组织或器官的蛋白质种类(定性蛋白质组学)、探究特定条件下蛋白质表达量变化(定量蛋白质组学)、揭示蛋白质间的复杂相互作用机制(互作蛋白质组学)、明确蛋白质在生命活动中执行的功能(功能蛋白质组学)、描绘蛋白质的二维、三维或四维结构(结构蛋白质组学)以及蛋白质翻译后的修饰(修饰蛋白质组学)[3]。
目前, 蛋白质组学研究方法主要有两种, 即基于凝胶(gel-based)的方法和基于质谱(MS-based)的方法。双向凝胶电泳(2-DE)是较早发展起来的一项分离技术, 可以追溯至20世纪70年代, 其原理是:第一向基于蛋白质等电点不同进行等电聚焦分离, 第二向依据蛋白质相对分子质量差异, 利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将其在二维平面上分开。该方法是经典的蛋白质研究技术, 广泛应用于食品安全领域的研究。尽管如此, 凝胶法存在较多缺点, 如对低丰度蛋白质、疏水性蛋白质、极酸或极碱蛋白质的分离和检测效果较差, 且难以实现规模化和自动化。质谱技术的出现解决了这一问题。质谱具有快速、灵敏、准确的优点, 可应用于蛋白质的识别鉴定(定性和定量)、翻译后修饰、表达差异分析、功能及互作分析等[3]。目前有多种质谱技术应用于蛋白质组学研究, 如基质辅助激光解吸电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)等。质谱法是进行高通量蛋白质鉴定和定量分析的最常用方法, 可以同时检测千余种蛋白质, 其与同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)等技术及生物信息学的结合应用促进了蛋白质组学的快速发展。凝胶法和质谱法在很多方面可互补不足, 研究中多将两者结合应用。
蛋白质组学自兴起以来发展迅速, 应用对象涉及微生物[1, 4]、动物[5-7]和植物[8-11], 应用领域包括药物开发[12]、病理研究[13-17]等, 在食品品种、产地、生产加工及果实成熟度、外源处理等方面的研究也屡见不鲜[6-10, 18]。此外, 蛋白质组学可应用于研究潜在的蛋白质或多肽标志物, 加快了食品真伪鉴别的发展。
根据质谱分析水平是基于完整蛋白质还是多肽碎片, 蛋白质组学研究流程分为Bottom-up型和Top-down型(见图 1)。在Bottom-up型研究流程中, 蛋白质经胰蛋白酶等酶水解, 所得肽段用于质谱分析[3], 这种方法也称为肽蛋白质组学。Bottom-up型可根据蛋白质是否进行分离而分为两类, 第一类流程中利用凝胶电泳分离获得目标蛋白质, 并对其进行酶解; 另一类方法是“鸟枪法”(shotgun), 对未经分离的蛋白质混合物进行酶解, 肽段混合物经色谱及质谱进行分析, 在这个过程中需根据肽段混合物的复杂度而选择恰当的色谱分离体系, 如液相色谱、多维色谱等。Bottom-up型应用广泛, 可对蛋白质进行定性及定量分析。在Top-down型研究流程中, 蛋白质不经酶解, 直接被质谱解离为碎片而进行分析, 该方法受限于仪器设备, 目前应用相对较少。
蛋白质组学研究流程包括样品制备、蛋白质分离、蛋白质鉴定或定量以及生物信息学分析等主要步骤(见图 1), 其中蛋白质的分离、定性或定量及结构、功能等生物信息学分析是蛋白质组学研究的核心和关键。
样品在进入质谱前, 需在蛋白质或多肽水平上进行分离, 往往要求分辨率高、可重复性好, 以保证蛋白质较好地分离和数据的可靠。蛋白质组分离多采用凝胶电泳和液相色谱的方法。
凝胶电泳包括一维凝胶电泳(1-DE)和2-DE等。1-DE通过高选择性的亲和力将蛋白质分离, 能将蛋白质溶解于十二烷基硫酸钠中, 所覆盖的蛋白质范围较广(相对分子质量为1×104~3×105 Da), 极酸性和极碱性的蛋白质易被分离[3]。利用2-DE分离蛋白质需要两步, 第一步为等电聚焦电泳, 根据等电点将蛋白质分离; 第二步为SDS-PAGE, 根据蛋白质相对分子质量的差异将其分离。根据凝胶的大小和pH梯度, 通常情况下2-DE可分离2000种蛋白质, 甚至能分离多达5000种蛋白质[19]。
常用液相色谱技术包括反相液相色谱(RPLC)以及二维或多维液相色谱。RPLC的原理是其固定相可与被分离的蛋白质发生作用, 初始洗脱液中有机相浓度较低, 蛋白质与固定相作用强于流动相与固定相作用而被固定相吸附; 当洗脱液中有机相浓度增加到一定程度, 流动相与固定相间作用较强, 致使蛋白质与固定相脱离, 蛋白质疏水性越弱, 其保留时间越短。二维或多维液相色谱根据蛋白质在不同相态的差异性分布, 利用多通阀、切换阀、色谱柱等设备, 在两个或多个色谱体系中将蛋白质分离, 常用技术有多维高效液相色谱、多维高效液相色谱-毛细管电泳联用等。液相色谱技术具有灵敏度高、分析速度快、易于自动化、可与质谱检测技术联用等优点, 可对复杂蛋白质样品进行分离[20]。
蛋白质的定性和定量研究作为蛋白质组学的两个研究方向, 是表达差异分析、相关性分析、品质比较等工作开展的基础与前提。
蛋白质定性研究是确定蛋白质本质属性的研究, 基于质谱的蛋白质定性研究技术主要以肽质量指纹图谱(PMF)和“鸟枪法”为主。
PMF的原理是:蛋白质的氨基酸序列不同, 当蛋白质被分解为肽段后, 产生的肽段质量数也不同, 这些肽段的质量即为指纹图谱。PMF核心技术是2-DE和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。2-DE将蛋白质分离, 选择蛋白质胶点并水解为多肽片段, 经MALDI-TOF-MS检测获得相对分子质量, 通过PMF数据库分析以鉴定蛋白质(见图 1)。MALDI利用脉冲激光束照射样品与基质形成的晶体结构, 基质吸收激光能量传递给样品分子使其电离, 离子在电场作用下通过飞行管道, 检测器依据离子质荷比和飞行时间进行检测[21]。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高、分辨率高等优点, 是研究高分子化合物的有力工具。
“鸟枪法”是指样品经酶水解为肽段混合物, 利用串联质谱(MS/MS)检测, 计算机预测每个肽段在蛋白质中的位置, 得到蛋白质序列并进行数据库搜索, 实现蛋白质的鉴定[22]。“鸟枪法”的关键步骤是实现肽段混合物的高度分离, 液相色谱-毛细管电泳联用(LC-CE)、强阳离子交换柱-反相液相色谱联用(SCX-RPLC)等分离效果较好的二维色谱技术在“鸟枪法”中应用广泛。
蛋白质定性还可通过其他技术实现, 如de novo测序和肽段碎片离子鉴定法(PFI)等。de novo测序即从头测序, 指在不需要任何参考序列的情况下, 利用串联质谱或MALDI-TOF-MS等技术对肽段测序, 将所得序列进行拼接、组装, 绘制蛋白质序列图谱。目前de novo测序在生命研究中有一定的应用[23], 在食品真伪鉴别及品质识别方面应用前景仍旧广阔。
常用蛋白质定量技术包括iTRAQ、串联质谱标记(TMT)、多反应监测(MRM)、连续窗口采集技术(SWATH)、细胞培养条件下稳定同位素标记(SILAC)、非标记(Label-free)等。
iTRAQ技术是研究蛋白质表达差异、发现生物标志物的常用技术, 是应用最广泛的体外标记技术。该技术利用多种同位素标记蛋白质多肽N末端或赖氨酸侧链基团, 经质谱分析可同时比较4个或8个样品之间的蛋白质表达量。iTRAQ试剂包括3个化学基团, 分别是报告基团、平衡基团和反应基团, 反应基团通过与肽段特异性结合连接到肽段上[24]。报告基团和平衡基团的总质量数不变[24, 25], 因此被标记的不同样品同一蛋白质的同一肽段在一级质谱中表现为一个峰; 平衡基团在质谱仪碰撞室内丢失, 报告基团产生相应的报告离子, 代表相应蛋白质或肽段, 进而定量。iTRAQ定量技术操作简单, 可与分离技术及质谱技术结合应用。
TMT技术是多肽体外标记定量技术, 利用等压定量标记试剂在单一实验中可以分析多达10个样本。TMT定量原理类似于iTRAQ技术, 2重、6重及10重TMT技术分别通过加入1个13C、5个13C或15N及8个13C或15N的稳定同位素对样品进行定量[26, 27]。TMT技术在食品真伪鉴别及品质识别的应用不如iTRAQ广泛, 有待进一步发展。
MRM技术是基于三重四极杆质谱仪的串联质谱法, 多用于小分子定量检测[28]。质谱仪通过MRM模式进行扫描, 监测样品的多肽母离子和子离子信息, 若出现符合规则的母离子/子离子对, 仪器将切换至串联质谱模式, 符合规则的母离子进入碰撞室发生碰撞, 符合规则的子离子信号被记录, 进行分子鉴定分析。MRM通过对母离子和子离子的两次筛选, 减小了化学背景, 降低了化学干扰, 提高了灵敏度[29]。此外, MRM技术具有通量高、重复性好、准确度高的特点[30], 与其他技术结合使用, 可使复杂目标物的定性、定量更加可靠。
SWATH技术是新型蛋白质全景定量技术, 具有灵敏度高、分辨率高、扫描速度快、线性动态范围广、外标校正准确度高等特点[31, 32]。SWATH工作流程大体分为数据采集、蛋白质鉴定、质谱峰提取及数据分析。在设置的扫描范围内Q1以25 Da的间隔连续将母离子传输到Q2内解离, 碎片离子经飞行管道被检测器捕获, 获得不同肽段的质谱图谱。SWATH技术可用于定量分析及鉴定蛋白质复合体、蛋白质翻译后修饰, 发展前景广阔。
Label-free技术常用于分析大量蛋白质的质谱数据, 利用蛋白质相应肽段的质谱峰强度或蛋白质的二级谱图数定量蛋白质[33]。Label-free技术无需同位素标签作内标, 耗费较低。SILAC技术是一种体内标记技术, 利用同位素标记培养基中的必需氨基酸, 同位素标记随着氨基酸进入细胞, 进而对细胞进行定量分析[34]。SILAC法只适用于体外培养的细胞标记, 成本较高。
20世纪90年代, 人类基因组计划的实施引发了生物信息学(bioinformatics)的发展, 使蛋白质分析发生了革命性的变化, 为高通量蛋白质组学的发展铺平了道路。生物信息学以生物数据为研究材料, 以计算机为研究工具, 利用统计学、应用信息学等方法研究生物学问题, 更加直观地阐述实验结果及结论。生物信息学是生命科学和信息科学等学科相结合的交叉学科, 涉及数据库搜索、数据处理及软件处理等。
通过蛋白质数据库, 利用鉴定工具对蛋白质进行鉴定是蛋白质组学研究的重要内容。一些常见蛋白质数据库见表 1。
蛋白质数据库涵盖了蛋白质的诸多信息, 包括名称、序列、空间结构、功能、分类、转录后修饰、互作位点及代谢途径等, 可分为综合性数据库、序列数据库、结构数据库、通路分析数据库、互作数据库以及蛋白质鉴定数据库(见表 1)。综合性数据库涵盖较全面。UniProt是目前信息最丰富、资源最广的蛋白质数据库之一, 由UniProtKB(含SWISS-Prot及TrEMBL)、UniRef、UniParc及Proteomes 4大模块组合而成, 其蛋白质序列主要来源于基因组测序[35, 36]。ExPASy也是常用的综合性数据库, 由瑞士生物信息学研究所创建, 涉及了基因组、蛋白质组、转录组等领域, 涵盖了SWISS-PROT、PROSITE和TrEMBL等数据库, 提供了AACompIdent、TagIdent和ProtParam等多个鉴定工具[37]。
SWISS-PROT和PIR是两大蛋白质序列数据库。SWISS-PROT由日内瓦大学医学生物化学系和欧洲生物信息学研究所共同维护, 每个蛋白质条目包含序列、引用文献、分类、功能、转录后修饰、特殊位点和区域及分子结构等信息[38]。PIR是一个全面经注释的非冗余序列数据库, 由蛋白质序列数据库PIR-PSD、蛋白质分类数据库iProClass及非冗余的蛋白质参考资料数据库PIR-NREF组成, 交叉的数据库达90多个, 提供了全面、及时的蛋白质信息[39]。
蛋白质结构数据库PDB发展速度迅速, 贮存着由X射线、核磁共振等方法获得的蛋白质三维结构信息[40]。
通路分析数据库多用于检索蛋白质参与的代谢途径以及可能发挥的功能, KEGG是常用数据库之一, 由日本京都大学生物信息学中心于1995年建立, 是提供分子水平信息的实用数据库[41, 42]。
STRING是搜寻已知蛋白质和未知蛋白质间相互作用的数据库, 包括物理作用和功能作用。STRING包含实验数据、实验结果及预测结果等, 利用打分机制对预测结果赋予权重, 计算分值[43]。
随着蛋白质组学的发展, 利用蛋白质鉴定数据库可以确定蛋白质种类、名称、功能等信息, 成为蛋白质研究中的常用手段。MASCOT是目前使用最广泛的蛋白质鉴定数据库之一, 是基于质谱数据的蛋白质鉴定系统, 可输入肽质量指纹图谱、肽段序列、氨基酸组成、串联质谱原始数据等内容进行检索[44]。BLAST和FASTA是常用的对比程序, 可在数据库中搜索相似的序列, 其中FASTA比BLAST敏感度高、耗时长。此外, TagIdent、PepMapper和Pep-tideSearch等均是常用的蛋白质鉴定数据库(见表 1)。
蛋白质组学质谱数据具有关系复杂、数据量大、查询方式多等特点, 在研究蛋白质组学质谱数据时需要进行大数据处理及软件分析。常用的蛋白质组学生物数据处理包括质控、筛选、同源映射、功能分析、选择方向和模型构建等, 分别由不同软件完成。
质控指为达到规范或规定对数据质量要求采取的技术和措施, 可用于验证生物学重复或实验重复数据的可靠性。MeV等软件进行的聚类分析、SIMCA软件进行的主成分分析等无监督分析及偏最小二乘法判别分析、正交偏最小二乘法判别分析等有监督分析均属于质控分析。蛋白质原始数据的筛选分为可信蛋白质的筛选和差异蛋白质的筛选, 可信蛋白质的筛选常用分析标准有FDR标准、Unused标准和肽段标准, 差异蛋白质的筛选常用分析标准有倍数标准、P值标准和双标准。
利用同源映射分析方法, 未知蛋白质通过与近缘模式物种的已知蛋白质氨基酸序列进行对比可确定其分类, 目前NCBI在线BLAST是最常用的方法之一。蛋白质功能分析包括基因本体(gene ontology, GO)分析、途径分析和蛋白-蛋白互作分析。基因本体涉及细胞组分、分子功能、生物过程, 利用DAVID等软件通过基因本体分析可对蛋白质进行生物学分类。类似的, 蛋白质经途径分析、蛋白-蛋白互作分析可分别确定其参与的生物体代谢途径及蛋白质互作成员和方式, 常用工具有KEGG和STRING。
实验中所得的差异蛋白质数据往往多且散, 需依据功能分析结果及研究目的进行重点分析, 如利用Powerpoint、VennDiagrams或Winvenn等软件绘制文氏图, 选择组内特有蛋白质或者组间共有蛋白质进行重点分析, 又如根据MeV、cluster、R语言等软件绘制热图, 选择具有相同或特有表达模式的蛋白质进行重点分析。利用Pathway builder、Cytoscape等工具对选择的重点内容进行模型构建, 可直观描述机理机制。
随着食品产业规模扩张以及食品供应链发展, 以经济利益为驱动的食品掺假现象屡见不鲜, 正成为一个全球性话题。食品掺假手段从最初的缺斤少两、稀释勾兑等简单手段发展为利用现代食品科学技术“弃真存伪”等形式, 包括原料品质以次充好、掺入劣质品或违禁成分、冒充或虚标原产地、假冒物种或品种等[18, 45]。食品掺假现象不仅影响消费者权益, 影响食品产业信誉, 还关系着安全问题。未标识的食品成分往往会成为潜在的安全隐患, 如过敏原及有毒成分会影响消费者的健康, 错误的标签也可能会违背特定群体的饮食习惯。因此, 急需准确有效的检测技术对食品的真实属性进行有效鉴定。
目前, 食品真伪鉴别技术主要包括理化分析技术、分子生物技术、蛋白质技术、人工智能、形态学分析和感官分析等6大类[46]。其中, 蛋白质组学技术近几年得以迅速发展, 高分辨质谱以及现代生物信息学技术的发展使蛋白质组学在食品真伪鉴别及品质识别研究中具有重要地位[18]。
目前, 蛋白质组学已在物种鉴别、产地溯源、品质识别、掺假鉴定等多个领域得以应用, 涉及肉制品、水产品、乳制品、果蔬制品、谷物及其制品、高附加值食品及保健食品等多类食品[5, 18, 47-51](见表 2)。研究中常利用2-DE、SDS-PAGE等凝胶电泳技术或液相色谱等分离技术, 及MALDI-TOF-MS、LC-ESI-MS/MS等质谱技术, 或进一步结合iTRAQ、免疫印迹等定性/定量技术, 对研究对象的特定蛋白质或蛋白质组进行分离、鉴定或/和定量, 达到真伪鉴别或品质识别的目的[9, 52-54](见表 2)。
利用蛋白质组学可对农作物、营养品、肉类等进行物种鉴别。
利用2-DE分离技术及质谱检测技术, 发现高蛋白大豆及高油大豆间存在40个表达差异的蛋白质, 且储存相关蛋白质、碳氮代谢相关蛋白质及氧化应激蛋白质在高蛋白大豆中表达较强[47]。
Yu等[48]发现意大利工蜂和东方蜜蜂蜂王浆蛋白质组均以蜂王浆主蛋白(MRJPs)为主, 意大利工蜂蜂王浆MRJPs表达丰度较高, 且专一性表达过氧化物还原酶2540、谷胱甘肽巯基转移酶S1及蜂王浆主蛋白5(MRJP5), 表明意大利工蜂蜂王浆营养价值较高。Liu等[52]利用MALDI-TOF-TOF/MS对15种燕窝样品进行分析, 发现主要差异蛋白质是酸性几丁质酶的同源物, 为生物标志物的筛选提供了基础。
肉类加工食品组分多样且不均一, 鉴定较难。Montowska等[49]首次应用常压解吸附电喷雾电离质谱(DESI-MS)和液萃取表面分析质谱(LESA-MS)鉴定了牛肉、猪肉、马肉等5种肉类的骨骼肌蛋白质, 发现5种肉类具有各自特有的蛋白质, 表明蛋白质组在不同肉类间存在差异。此外, 调控蛋白、代谢酶、肌纤维蛋白、血清白蛋白、热激蛋白27(HSP27)、ATP合成酶等蛋白质可能成为肉类标志物, 仍需进一步研究[71]。蛋白质组学在海鲜产品物种鉴定中也得到广泛应用。利用“鸟枪法”及RP-HPLC结合选择性串联质谱离子监测(SMIM)技术, 通过检测物种专一性肽段, 可区分7种小虾米[5]。Nessen等[7]通过LC-MS/MS进行非靶标数据采集及谱库匹配数据分析, 成功区分欧鲽、石斑鱼等5种比目鱼样品, 并证明此体系具有较强的实用性, 可在比目鱼亲缘关系识别中推广应用。
蛋白质组学还可应用于过敏原的鉴定或检测。Pedreschi等[53]将“鸟枪法”和靶标蛋白质组学相结合, 利用Nano-ESI-Q-TOF-MS/MS检测肽段AHVQVVDSNGNR和SPDIYNPQAGSLK, 判定花生存在于饼干样品中, 此方法灵敏度高, 可检测的花生含量达微量级别(≥10 μg/g)。利用2-DE及质谱等技术, 在燕窝中发现了一种大小为66 kDa的丝氨酸蛋白酶抑制剂同源体过敏原, 为食品安全检测提供了依据[72]。
食品地源分布会影响其品质和营养价值, 是食品真伪鉴别和品质检测的指标之一。蛋白质标志物可应用于地源识别, 具有简单、快速的优点。
Qu等[55]对中国蜜蜂和欧洲蜜蜂的蜂王浆蛋白质组进行了分离、酶解及质谱分析, 表明MRJP2和MRJP3在样品中相对分子质量和等电点存在显著差异, 且中国蜂王浆的多态性明显低于欧洲蜂王浆, 推动了蜂王浆蛋白质组的研究进展。Won等[56]在韩国本土蜂蜜及欧洲蜂蜜中发现了两个一级结构相似、相对分子质量不同的MRJP1蛋白质。将两种蛋白质的人造标记蛋白质分别与蜂蜜样品混合并进行SDS-PAGE电泳, 根据条带数量可对蜂蜜样品产地进行区分。此外, 利用蛋白质的指纹图谱和条形码也可快速鉴定地理起源。Wang等[73]以16种夏威夷蜂蜜为材料, 利用MALDI-TOF-MS获得蛋白质指纹图谱, 经比对发现其与数据库中同产区的蜂蜜间有较好的同源性, 与其他产区的蜂蜜间存在差异, 表明指纹图谱可用于鉴别商业蜂蜜产品的地理起源。以生长于伊比利亚半岛西北海岸和耶尔瑟克的紫贻贝和贻贝为对象进行蛋白质组学研究, 发现两种样品间存在37个显著表达差异蛋白质, 利用质谱技术对其中15个差异蛋白质进行鉴定, 发现其与生物的应激、储存等能力相关, 为生态学和生理学研究提供了依据[57]。Di等[58]利用2-DE、MALDI-TOF-TOF/MS及生物信息学手段发现3个不同产地的九孔鲍的足肌蛋白质组间存在表达差异, 且差异蛋白质参与了能量的产生、储存及应激反应; 分层聚类分析显示台湾鲍鱼和越南鲍鱼关系相近, 与日本鲍鱼关系较远, 这与地理分布表现一致。可见蛋白质组学分析具有较高的精确性和可靠性。Pepe等[59]利用简易蛋白质组学手段, 发现地中海的金枪鱼特异性地具有一种相对分子质量约为70 kDa的蛋白质, 可区分于厄瓜多尔及巴勒莫的金枪鱼。
食品品质研究多以果品和农作物为材料, 涉及发育阶段、采后贮藏及外源处理等方面。
在生长发育阶段, 果实内发生一系列变化, 质地、色泽、香气等品质逐渐达到成熟标准。Prinsi等[51]以发育期和成熟的桃果实为研究材料, 经串联质谱分析, 发现代谢相关酶、乙烯合成酶、胁迫应答相关酶等蛋白质在两个阶段的果实中存在差异, 其中1-氨基环丙烷基羧酸(ACC)氧化酶丰度变化最为明显, 表明乙烯代谢在果实生长发育阶段发挥重要作用。香气是评估草莓品质的重要指标, 利用蛋白质组学对草莓进行研究, 发现醇酰基转移酶、丙酮酸脱羧化酶、醌氧化还原酶等在发育过程中含量显著增加, 表明其在草莓挥发性香气物质合成过程中发挥了重要作用[60]。与果树相似, 农作物蛋白质组在生长发育阶段也会发生变化。以绿色期及成熟期的胡椒果实为材料, 发现蛋白质在两个发育阶段间具有修饰差异, 如甲酸脱氢酶、孔蛋白等蛋白质在两个阶段均可被羰基化, 而顺乌头酸酶、抗增殖蛋白等只在成熟期发生羰基化, 表明线粒体的羰基化对维持胡椒线粒体功能和成熟过程起着重要作用[61]。
营养品、肉类等食品品质在贮藏过程中发生的变化引起了广泛关注。为探究蜂王浆保存的最适温度, 分别将其放置于-20 ℃、4 ℃、常温各12个月, 利用2-DE及多种质谱技术对其蛋白质组进行分析, 发现新鲜蜂王浆样品及-20 ℃贮藏样品中的蛋白质数量多于4 ℃及常温贮藏的样品, 表明-20 ℃贮藏可较好地维持蜂王浆的营养品质[74]。Zhao等[62]利用质谱技术及免疫印迹法对不同贮藏环境下的蜂王浆进行分析, 发现MRJP5在常温贮藏30 d时水解, 75 d时完全水解, 因此可作为标志物用于蜂王浆的品质评估。肉类食品在贮藏过程中常发生颜色变化。利用靶向蛋白质组学和生物信息学对贮藏期间黄牛的不同肌肉进行分析, 发现过氧化物酶2及超氧化物歧化酶可作为标志物用于分析肉色稳定性, 此外, 参与最长肌的糖酵解途径的蛋白质数量多于腰大肌, 表明最长肌比腰大肌的肉色更稳定[63]。Yu等[64]利用“鸟枪法”对烘烤后的羊羔背最长肌进行研究, 发现烘烤可导致肌动蛋白、肌球蛋白重链、肌浆蛋白的聚集, 长时间烘烤会导致蛋白质含量降低, 营养成分流失。可见, 蛋白质组学的应用延伸了食品品质相关研究的深度、广度和精度。
此外, Lerma-García等[65]利用组合肽配体技术(CPLLS)、质谱和指纹图谱技术对橙汁、苏打水等饮料进行了品质检测, 正宗的橙汁经串联质谱分析得到了1109个蛋白质, 商业橙汁所含蛋白质数量明显减少, 而苏打水中只含有少量蛋白质, 此方法可用于评估商业饮料的品质。
食品产业中掺假现象频发, 肉类食品是主要领域之一。利用蛋白质组学对标志物进行分析是鉴定肉类食品掺假的重要手段。Surowiec等[68]对生鸡肉进行提取、分离和鉴定, 发现血红蛋白亚基可作为机械回收鸡肉的标志物用以掺假检验。以商业肉类产品为实验材料建立了2 min快速蛋白质提取法, 并利用HPLC-MS/MS、MRM及MRM3对具有物种专一性且高度稳定的胰蛋白酶标志肽进行快速检测, 判定马肉或猪肉在牛肉中是否存在, 此方法灵敏度高, 可检测到0.24%的掺假含量[69]。肌钙蛋白I(TnI)可作为动物性肉类食品稳定的标记物, Zvereva等[54]利用基于MALDI-TOF的蛋白质组学和酶联免疫法对TnI蛋白进行定量, 可对哺乳动物的肉类食品进行简便、高效的检测。
市场需求导致乳品掺假现象严重, 真蛋白是乳品质量的重要指标之一, 利用SDS-PAGE分离乳品中的蛋白质, 对其进行定性和定量分析, 建立了真蛋白鉴定图谱库用于掺假检测[70]。Guarino等[75]发现了绵羊奶的特异性肽段(m/z 860), 利用此片段可在山羊奶制品中检测绵羊奶的存在, 也可快速定量绵羊奶在奶制品中的比例。蛋白质组学手段的使用加速了掺假检测的进程, 但仍旧存在不足, 如检测范围局限、覆盖面小、机制不完全等。
基于质谱技术的蛋白质组学具备高稳定性、高灵敏度、多重性以及高通量的特点, 具有其他方法无可比拟的优越性, 如可对加工贮藏过程中的特征标记肽段、氨基酸序列的修饰进行监控, 利用热稳定蛋白对标志物进行筛选, 利用PMF技术在序列水平上区分近缘物种, 利用特征肽段进行过敏原检测等[15, 56, 62, 69]。此外, 基于质谱技术的蛋白质组学可以同时检测多种生物物种, 远好于ELISA的研究效率。因此, 基于质谱技术的蛋白质组学日益成为食品真伪鉴别研究中的核心技术, 同其他技术互相补充, 成为食品打假的有效工具, 有力保障食品安全和消费者利益。
尽管如此, 基于蛋白质组学的真伪鉴别研究也存在某些制约因素, 有待进一步研究和突破。首先, 为了提高分析结果的灵敏度和可重复性, 需建立蛋白质提取和富集的标准方法, 包括技术细节、一定数量的代表性样品以及技术重复等, 以解决低浓度靶标蛋白质及复杂基质蛋白质提取困难的问题; 其次, 鉴于分析物和食品种类、浓度的复杂性, 蛋白质组学研究的另一限制因素是标准物质的获得, 这将对结果的验证起到至关重要的作用。此外, 蛋白质特征标志物的鉴定将更多地依赖质谱技术的发展, 高分辨质谱技术将有效填补庞大的原始组学数据与深层次结果挖掘之间的空白; 数据非依赖的分析方法(如SWATH技术)能够在一个循环中同时定量并分析低丰度蛋白质, 将显著拓宽分析的覆盖面。最后, 新型生物信息学技术的发展和数据库的共享应用将在食品真伪鉴别组学数据的阐述中起到重要作用。
2018,
Vol. 36 Issue (7): 588-598
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