单克隆抗体(单抗)药物因具有特异性强、见效快、副作用小等优点, 已成为当下治疗癌症和自身免疫疾病等多种高危疾病的有效药物[1]。作为重要的生物药物, 单抗的活性和安全性主要由其氨基酸序列决定, 但同时也受到转录后修饰的显著影响。常见的转录后修饰包括脱酰胺、氧化、二硫键连接、糖基化等, 其中以糖基化最复杂、最重要[2]。糖基化影响药物的溶解性、稳定性、药代动力学、生物活性和安全性等[3], 是单抗的关键质量属性之一, 受到特别关注[4, 5]。鉴于糖基化对于生物药物存在重要意义, 如何对其进行详细表征及功能分析已成为当前生物、制药、临床医学等研究方向的热点和难点之一。
几乎所有的单抗都含有N-糖, 对单抗的结构和功能有着重要影响, 对N-糖的表征是最重要、最广泛的单抗糖基化研究内容之一。有综述[6]对当前的单抗药物糖基化修饰分析技术进行了总结, 主要包括高效液相色谱[7, 8]、毛细管电泳[9]、基质辅助激光解析电离质谱[10]、液相色谱-电喷雾质谱联用[11, 12]等。其中, N-糖还原胺化衍生后通过LC-MS系统在正离子模式下进行表征已经成为生物制药企业普遍采用的方法。此方法的优势在于能够通过荧光检测器对样品进行相对定量分析, 较为稳定可靠。但也存在一些缺陷:第一, 唾液酸残基在正离子模式下电离效率低, 结构不稳定, 导致酸性糖的检测灵敏度较低; 第二, 流动相使用的甲酸铵溶液浓度较高, 容易在质谱锥孔和离子传输毛细管等处堆积, 从而污染仪器; 第三, 亲水相互作用色谱(HILIC)柱寿命较短, 难以长期保持谱图的重现性, 增加了实验的复杂性和使用成本等。第一个和第二个缺陷均与还原胺化衍生相关, 采用其他衍生方法代替还原胺化有望解决该问题。还原胺化N-糖的色谱分离经常依赖含盐流动相, 以便获得较好的色谱分离度, 如果要避免使用含盐流动相, 则替换衍生方法是可行的方案之一。第三个缺陷主要与色谱柱材料相关, 可使用结构更加稳定的色谱柱代替HILIC柱。
为了克服经典方法的三大缺陷, 本文尝试用新的方法分析单抗的N-糖基化。通过甲胺化衍生稳定唾液酸残基, 增强酸性糖的质谱电离效率, 采用结构比较稳定的基于硅氢化物固定相的正相色谱(SiH-NPC)柱代替HILIC柱, 以降低实验成本。此方法为单抗糖基化的表征提供了新的分析策略, 在生物制药行业具有重要的应用前景。
UPLC-MS(ACQUITY UPLC和Xevo G2-XS QTOF, 美国Waters公司), 真空离心浓缩仪(德国Eppendorf公司), Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司)。HILIC柱(TSKgel Amide-80, 250 mm×4.6 mm, 5.0 μm)购自日本东曹株式会社; 硅氢化物色谱柱(Cogent Silica-C, 250 mm×4.6 mm, 5.0 μm)购自美国MicroSolv公司。
2-氨基苯甲酸(2-AA)、氰基硼氢化钠、甲酸铵、二甲基亚砜(DMSO)、甲胺盐酸盐、甲基吗啉、六氟磷酸(7-氮杂苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷磷(PyAOP)、多孔石墨化碳(PGC)、微晶纤维素(MCC)、硼烷氨络合物(BAC)均为分析纯, 购自美国Sigma-Aldrich公司; 5×105 units/mL肽N-糖苷酶F(PNGase F)及糖苷内切酶缓冲液试剂盒(EBP)购自美国New England Biolabs公司; 乙酸(HAc)、三氟乙酸(TFA)、乙腈、甲醇、甲酸(FA)均为优级纯, 购自美国Thermo Fisher Scientific公司; 单克隆抗体药物(5 g/L)由人福医药集团股份公司友情提供。
N-糖与蛋白质的天冬酰胺残基相连, 需要将其从单抗分子上解离后再进行分析, 解离方法参考文献[13]:取10 μL单抗溶液(相当于100 μg样品)与90 μL蛋白质变性缓冲液混合, 于沸水中加热10 min; 冷却后加入12 μL 10%(质量体积分数)NP-40溶液(来自于EBP试剂盒)和5 unit PNGase F酶, 于37 ℃水浴过夜, 用真空离心浓缩仪干燥。
酶切后的样品溶于0.5 mL 5%(体积分数, 下同)乙腈(含0.1%TFA)中, 通过PGC固相萃取小柱纯化N-糖[14]。先用2 mL乙腈和2 mL 15%乙腈(含0.1% TFA)清洗PGC小柱, 然后用3 mL 5%乙腈(含0.1% TFA)平衡小柱; 上样后用3 mL 5%乙腈(含0.1% TFA)冲洗小柱; 再用1.2 mL 40%乙腈(含0.1% TFA)洗脱样品, 回收洗脱液, 于真空离心浓缩仪中干燥。
以2-AA作为N-糖的还原胺化衍生试剂, 衍生方法参考文献[15]。用DMSO/HAc(7:3, v/v)配制100 g/L氰基硼氢化钠和50 g/L 2-AA混合溶液, 取20 μL该混合溶液加入样品中, 于65 ℃放置2.5 h后完成衍生反应。
N-糖的甲胺化衍生方法参考文献[16]。干燥的样品与25 μL衍生试剂(含1 mol/L甲胺盐酸盐溶液和0.5 mol/L甲基吗啉溶液, 溶剂为DMSO)和25 μL的PyAOP溶液(溶剂为DMSO)混合, 于常温避光静置30 min。本研究小组[17]之前报道过, 对于单唾液酸化和二唾液酸化的N-糖而言, 甲胺化衍生效率约为95%。
还原胺化和甲胺化的样品均可通过MCC固相萃取小柱纯化[18]。先用2 mL水清洗MCC小柱, 然后用3 mL 80%乙腈(含3% FA)平衡小柱; 上样后用3 mL 80%乙腈(含3% FA)冲洗小柱; 再用1.2 mL 5%乙腈洗脱样品, 回收洗脱液并于真空离心浓缩仪中干燥。
天然的N-糖在还原端能够呈现α和β两种构型, 通常需要将其还原以便消除这种异构体[19]。还原方法如下:样品用20 μL BAC溶液(10 g/L)溶解, 置于65 ℃水浴中1.5 h。
衍生后的N-糖溶于50 μL 70%乙腈中, 用LC-MS进行检测。
使用HILIC进行分析时, 流动相比例及仪器参数选用生物制药企业普遍采用的配置, 即流动相A为50 mmol/L pH 4.4甲酸铵溶液; 流动相B为乙腈; 柱温恒定为40 ℃; 流速保持0.4 mL/min。梯度洗脱程序设置如下:0 min, 70%B; 5 min, 65%B; 40 min, 50%B; 50 min, 50%B; 55 min, 70%B; 65 min, 70%B。
使用SiH-NPC进行分析时, 流动相比例选用LC-MS常规配置, 即流动相A为5%乙腈(含0.1% FA); 流动相B为95%乙腈(含0.1% FA); 柱温恒定为35 ℃; 流速保持0.4 mL/min。梯度洗脱程序设置如下:0 min, 70%B; 35 min, 60%B; 40 min, 50%B; 50 min, 50%B; 55 min, 70%B; 65 min, 70%B。
MS参数:正离子模式; 毛细管电压为3.0 kV; 锥孔电压为35 V; 离子源温度为120 ℃; 一级质谱m/z区间为500~2000, 单次扫描时间为0.5秒; 二级质谱采用数据依赖采集(DDA)模式, m/z区间为100~1500, 每个扫描周期内扫描10次, 共2.0秒。
常见的单糖包括甘露糖(Man)、N-乙酰葡糖胺(GN)、半乳糖(G)、岩藻糖(F)、N-乙酰神经氨酸(NANA)等, 单糖残基共价连接构成N-糖。采用LC-MS技术分析单抗N-糖是近年来备受青睐的手段, 尤其是在鉴定低丰度糖、糖同分异构体等方面应用广泛[11, 12]。还原胺化衍生结合HILIC法是生物制药企业普遍采用的方法, 因其存在一些缺陷, 故本文尝试选择甲胺化衍生结合SiH-NPC法代替或补充经典方法。SiH-NPC柱拥有部分HILIC柱的特性, 也被认为是一种中性的HILIC柱。不过, SiH-NPC柱填料以独特的Si-H键代替了传统的Si-OH键, 不仅有效增强了填料的使用寿命而且极大地减小了水分子与填料的相互作用, 从而提供了与传统HILIC不同的分离机制。
使用HILIC和SiH-NPC, 通过LC-MS分析单抗N-糖的流程如图 1所示。还原胺化发生在糖的还原端, 经2-AA衍生后每个N-糖的相对分子质量增加121 Da。甲胺化发生在非还原端的唾液酸残基上, 每个衍生位点导致N-糖的相对分子质量增加13 Da(甲胺化并不会导致中性糖相对分子质量发生变化), 在N-糖被还原后相对分子质量再增加2 Da。
本文采用HILIC分析鉴定了12种2-AA衍生的单抗N-糖(不包括同分异构体); 采用SiH-NPC分析N-糖时, 不仅鉴定了此12种糖组分, 还得到了其他的糖结构。图 2显示了两种方法中G3F+NANA分别对应的提取离子色谱图(EIC)。如图 2a所示, 在HILIC分析中并没有检测到G3F+NANA(m/z 855.65, z=3);通过SiH-NPC分析则可以检测到该糖结构(m/z 820.24, z=3)。经甲胺化衍生后, 唾液酸的羧基转化成中性基团。中性化能够增强酸性糖在正离子模式下的稳定性和质谱电离效率, 从而提高其检测灵敏度。因此, 甲胺化相对于还原胺化更加有助于分析痕量的酸性糖, 这也是G3F+NANA能够被SiH-NPC分析鉴定的重要原因。
构成寡聚糖的单糖残基之间可以通过多种方式连接, 这导致N-糖不仅是多分支(天线)结构, 而且容易形成同分异构体。如图 3a所示, HILIC法对N-糖异构体具有一定的分离能力, 尤其是因非还原端残基的连接方式不同而形成的异构体, 例如G1F和G1F+NANA, HILIC法对半乳糖残基不同的连接方式呈现较好的分离度。SiH-NPC法也能够分离N-糖异构体, 如图 3b所示, 主要包括G1F、G2F和G2F+NANA。但两种分离方法得到的异构体并不一样。以G2F为例, 图 4显示了其EIC(m/z 954.87和895.31, z=2), 用HILIC法分析并没有得到G2F的异构体; 用SiH-NPC法分析则得到3个异构体。考虑到G2F的异构体主要由岩藻糖残基形成, 因此推测SiH-NPC法不同于HILIC法, 主要识别岩藻糖残基的连接位置, 包括1种核心结构(岩藻糖残基连接于还原端的N-乙酰葡糖胺上)和2种末端结构(岩藻糖残基连接于非还原端的N-乙酰葡糖胺上)。但是岩藻糖残基在电离时容易发生迁移, 这导致同一张二级质谱图中既存在核心结构的碎片离子也存在末端结构的碎片离子, 因此, 仅通过质谱图很难确定岩藻糖残基的位置[20], 不能对上述推测进行合理的验证。总之, HILIC法和SiH-NPC法都可以分离N-糖的同分异构体, 但分离类型很可能不同, 这也解释了G2F+NANA各异构体的相对丰度在两种色谱分析方法中存在显著差异的原因。
HILIC法和SiH-NPC法的另一个重要不同在于它们对N-糖的保留时间存在显著差异。如图 3所示, 在HILIC法中, 样品峰分布较为分散, 分析时间较长; 在SiH-NPC法中, 样品峰较为集中, 分析时间较短。因此, 后者更有利于单抗N-糖的快速分析, 适合大量样品的表征研究。此外, 在SiH-NPC法中, 样品峰的保留时间(RT)与其单糖单位(GU)数量存在相关关系。当设定Man、GN、G、F的单糖残基单位为1、被甲胺化的NANA单糖残基单位为2(NANA相对于其他单糖残基较大, 故设定为2)时, Man5、G0F、G1F、G2F、G1F+NANA、G2F+NANA的GU数量分别为7、8、9、10、11、12。此时, RT与GU之间呈线性相关关系(线性相关系数R=0.995)。已有研究[21]表明, 通过反相色谱分离全甲基化的N-糖时, 其保留时间和单糖残基数目呈现线性关系, 而本文进一步发现, 通过SiH-NPC法分析甲胺化的N-糖时也存在类似现象。不过造成此现象的原因并不相同。在反相色谱分析中, 疏水相互作用是关键因素; 在SiH-NPC法分析中, 分子的大小和形状可能是更加重要的影响因素。
通过SiH-NPC分析单抗N-糖时, 主要获得3种糖组分的同分异构体, 即G1F、G2F和G2F+NANA。为了探讨此分析方案的稳定性, 本文对比了重复实验中3种糖组分的各同分异构体的相对丰度(见图 5)。G1F包含2个同分异构体, 其EIC的峰面积百分比分别为80.9%(RSD＜2%)和19.1%(RSD＜2%); G2F包含3个同分异构体, 其EIC的峰面积百分比分别为37.1%(RSD＜2%)、59.0%(RSD＜2%)和3.88%(RSD＜8%); G2F+NANA包含2个同分异构体, 其EIC的峰面积百分比分别为47.6%(RSD＜2%)和52.4%(RSD＜2%)。这些结果表明, 甲胺化结合SiH-NPC法稳定性较高, 可以用于单抗N-糖异构体的相对定量研究。不过样品峰总面积呈现差异性, 这可能是由于酶切及富集纯化过程中的变异性导致的。
本文提出了甲胺化衍生结合SiH-NPC表征单抗N-糖基化的方法。该方法有效地克服了传统方法的一些缺陷。SiH-NPC法提供了与HILIC法不同的分离机制, 依据不同的实验目的, 可以选择HILIC法和SiH-NPC法分别分析不同残基引起的糖同分异构体。此外, SiH-NPC法分离速度快且保留时间与糖链组成相关度高, 因而可以用于快速分析以及评估糖链大小等。总之, 甲胺化衍生结合SiH-NPC法能够替代或补充还原胺化衍生结合HILIC法, 在生物制药行业中拥有重要的应用前景。
2018,
Vol. 36 Issue (7): 615-620
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