我国《化妆品安全技术规范》将抗生素列为禁用物质[1], 不得在化妆品中添加使用, 但由于其具有杀菌、抑菌的功效, 一些不法企业在经济利益的驱使下, 在化妆品配方中非法添加抗生素类物质, 长期使用这些化妆品会导致对抗生素的耐药性, 造成健康隐患[2, 3]。近几年, 尽管国家加大了化妆品中各类禁、限用物质的抽检力度, 但一些不法企业为了规避政府监管, 添加不在法定检验方法监测范围内的禁用物质, 在近几年的国家化妆品监督抽检计划中, 本单位多次发现非标准检测方法范围内的禁用物质。因此, 建立简便、高效、可靠的多成分快速检测方法和相应的筛查数据库对化妆品行业的监管和保障消费者的使用安全具有重要的意义。
目前, 有关化妆品中抗生素类物质的检测方法主要有高效、超高效液相色谱法[4-7]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[8-13]。LC-MS/MS适用于已知目标物的分析, 在没有标准品和短时间内难以建立检测方法的情况下, 很难快速完成检测。同时, 由于LC-MS/MS检测通量受四极杆扫描速度的限制, 能同时检测的目标物数量有限[14]。近年来, 兼具离子阱和高分辨质谱平行检测能力的线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱检测系统(LTQ/Orbitrap MS)已在非法添加和残留分析领域得到应用[15-17]。文献[18]利用LTQ/Orbitrap MS对化妆品中一些抗生素的检测方法进行了研究, 但涉及的化合物种类较少, 达不到高通量筛查的目的。
本研究运用超高效液相色谱-高分辨质谱检测系统建立了同时快速筛查化妆品中66种抗生素类化合物的分析方法。通过66种抗生素类化合物的一级精确质量数和二级碎片离子质谱图数据库, 无需对照品即可完成66种抗生素化合物的快速筛查和确证。此研究提高了日常检验的工作效率和化妆品安全风险监控水平, 对保障监管工作的顺利开展和化妆品的使用安全具有重要意义。
Thermo U3000 UPLC液相色谱仪(美国Thermo Fisher公司); Thermo Scientific LTQ-Orbitrap XL组合式高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher公司); Thermo ST16台式离心机(美国Thermo Fisher公司); Vortex-Genic2旋涡混合器(美国Scientific Industries公司); Hyper Sonic DT-A超声波清洗仪(鼎泰恒胜公司); 45位N-EVAP氮吹仪(美国Organomation公司); Milli-Q A10超纯水机(美国Millipore公司); Mettler Toledo电子天平(梅特勒-托利多(上海)公司)。
甲醇、乙腈(色谱纯, Merck公司); 甲酸(色谱纯, 阿拉丁公司)。
羟基甲硝唑、洛硝哒唑、羟甲基甲硝咪唑3种对照品购于Witega公司; 硝基咪唑、异丙硝唑、二甲硝咪唑3种对照品购于德国Dr. Ehrenstorfer公司, 其他12种唑类对照品购于中国食品药品检定研究院; 磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧嗪4种磺胺对照品购于中检院, 其他11种磺胺类对照品购于德国Dr. Ehrenstorfer公司; 脱水差向四环素、脱水四环素等14种抗生素购于中检院; 丹诺沙星、西诺沙星、马波沙星、奥比沙星、恶喹酸5种对照品购于德国Dr. Ehrenstorfer公司, 其他14种沙星类物质购于中国食品药品检定研究院。
分别准确称取各对照品约20 mg置于10 mL容量瓶中, 唑类和磺胺类化合物用乙腈溶解并定容, 其他化合物用甲醇溶解并定容, 配成约2 g/L的单标溶液。储备液保存于-20 ℃的冰箱中。临用时, 根据需要逐级稀释成不同质量浓度的系列混合标准溶液。
称取0.5 g样品置于10 mL容量瓶中, 加入乙腈定容至10 mL, 涡旋30 s, 超声提取20 min, 必要时加氯化钠破除乳化, 离心, 上清液过0.22 μm滤膜, 注入质谱仪测定。
色谱柱:UPLC C18(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm); 流动相:0.1%(v/v)甲酸溶液(A)和乙腈(B); 梯度洗脱程序:0~3 min, 10%B~20%B; 3~6 min, 20%B~25%B; 6~14 min, 25%B~27%B; 14~19 min, 27%B~35%B; 19~29 min, 35%B~65%B; 29~34 min, 65%B~10%B; 34~35 min, 10%B; 流速:0.2 mL/min; 进样量:5 μL; 柱温:30 ℃。
电喷雾离子源(ESI)正离子模式; 鞘气(N2)和辅助气(Ar)流速分别为40和10 arb(arbitrary unit); 毛细管温度300 ℃; 离子源电压2.5 kV, 电流100 μA; 一级质谱质量扫描范围为m/z 50~800, 分辨率为60 000;多级质谱采用高能碰撞诱导解离(HCD)模式, 依赖一级质谱扫描中的第1到第4强峰, 分辨率15 000; HCD裂解能量为归一化能量40%。66种化合物的质谱分析参数见表 1。
在优化的质谱条件下, 对66种化合物的混合标准溶液进行测定, 将得到的精确质量数、特征碎片离子和保留时间信息输入TraceFinder软件, 建立筛查质谱数据库。
本实验选取乳液类化妆品作为典型代表基质, 考察在不同提取溶剂中的提取情况。分别考察了乙腈、乙腈-2%(v/v)甲酸水溶液(3:2，v/v)、甲醇等提取溶剂对乳液类化妆品中66种化合物的提取情况, 提取效率通过在0.5 g样品中加入10LOQ(LOQ为5 μg/kg或10 μg/kg)的混合标准溶液的加标回收率来体现, 结果见图 1。可以看出, 对大多数化合物而言, 乙腈比乙腈-2%(v/v)甲酸水溶液的提取效率略高, 沙星类化合物用乙腈-2%(v/v)甲酸水溶液(3:2，v/v)的提取效率要稍高; 甲醇与乙腈的提取效率变化趋势基本一致, 乙腈的提取效率略高于甲醇。综合考虑, 选择乙腈作为提取溶剂。
提取效率的高低除与提取溶剂有直接的关系外, 超声时间也是一个关键的因素。本实验考察了超声时间为5、10、15、20、30 min对提取效果的影响。结果发现, 以乙腈为提取溶剂, 超声提取15 min, 绝大多数化合物已达最大提取效率。
本研究涉及唑类、磺胺类、沙星类和其他类别抗生素的色谱分离, 参照《化妆品安全技术规范》(2015年版)关于这几类物质的检测要求和日常对这几类物质的检验经验, 采用C18柱, 以乙腈和0.1%甲酸溶液作为流动相对这几类化合物进行测定。乙腈的洗脱能力高于甲醇, 得到的峰形更为尖锐, 加入甲酸可增加离子化效率。添加一定浓度的乙酸铵会改善分离度以及提高质谱响应值[18], 但易在色谱系统结晶和对质谱离子化系统产生影响。本实验在不加入乙酸铵的情况下, 通过优化梯度洗脱, 使绝大多数化合物得到较好的分离, 分离度满足实验要求, 各化合物的具体保留时间见表 1, 故最后选择C18柱为分离柱, 乙腈和0.1%(v/v)甲酸溶液为流动相, 梯度洗脱程序见1.5.1节。各化合物的提取离子色谱图见图 2。
线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱仪可以提供碰撞诱导解离(CID)和HCD两种碰撞裂解模式。在CID模式下, 线性离子阱会产生三分之一质量数碎片离子的损失[17, 19], 无法得到低质量端碎片, 而HCD模式能有效避免CID模式的这一缺陷, 产生低质量端碎片离子, 因此, 为了得到比较丰富的二级特征离子碎片并建立筛查数据库, 本研究选择在HCD模式下对归一化能量为25%、30%、35%、40%和45%的二级碎片离子质谱图进行了优化。通过对几种碰撞能量下得到的质谱图进行分析发现, 在碰撞能量为30%时, 部分化合物产生了较丰富的二级碎片离子; 当碰撞能量为40%时, 绝大部分化合物可以得到比较丰富的二级碎片离子, 个别化合物如甲硝唑、羟甲基甲硝咪唑和氟甲喹只得到较少的碎片离子, 尽管这3种化合物的二级碎片离子较少, 但能满足筛查的需要[20], 综合考虑, 最终选择碰撞能量为40%的HCD作为二级碎裂模式。各化合物的二级碎片离子见表 1。
本研究在优化的色谱条件下进样, 通过LTQ/Orbitrap MS系统获得66种化合物的保留时间、精确质量数(m/z)及二级特征碎片离子, 将上述信息输入TraceFinder软件中, 建立各成分的质谱数据库。
依照欧盟2002/657号文件[20]对质谱分析方法的规定, LTQ/Orbitrap MS只需一个母离子和一个子离子即可完成对目标物质的确证[15]。为了筛选结果的高选择性和可靠性, 本研究选择2个以上的二级碎片离子质谱图作为标准参照图。对于精确质量数相同的同分异构体化合物, 可通过保留时间进行区分, 如磺胺邻二甲氧嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶, 分子式均为C12H14N4O4S, 保留时间分别为12.60 min和17.91 min; 磺胺二甲异嘧啶和磺胺二甲嘧啶, 分子式均为C12H14N4O2S, 保留时间分别为5.15 min和9.24 min。当保留时间无法区分时, 可通过精确质量数和二级碎片离子质谱图进行定性和确证, 如弗罗沙星和诺氟沙星, 保留时间均为7.74 min, 精确质量数不同, 分别为370.137 3和320.140 5。若精确质量数相同, 可通过二级碎片离子进一步确证。由表 1的结果可以看出, 本研究得到的数据满足建立筛查数据库的要求。
由于化妆品基质比较复杂, 存在一定的基质效应, 为消除和补偿基质效应, 本研究考察了乳液类化妆品基质中各目标化合物的线性关系, 以目标化合物的含量(x, μg/kg)和准分子离子峰面积(y)绘制标准曲线。结果表明, 各化合物的线性关系良好, 线性相关系数(R2)大于0.99。根据《化妆品安全技术规范》(2015年版)卫生化学检测方法总则要求, 色谱的检出限(LOD)以3倍空白噪声对应的质量或浓度表示。由于高分辨质谱的基线噪声非常低, 以S/N方法计算出的检出限可能与方法的实际检测值存在差别, 本研究采用基质混合标准溶液逐级稀释方法至仪器能检出的最低含量作为各化合物的检出限。定量限约为检出限的3倍。66种抗生素化合物的线性方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限见表 2。
本研究将以乳液为基质确定的方法用于水剂、乳液和膏霜类3种基质样品进行回收率试验。3种基质中分别加入LOQ、10LOQ、30LOQ 3种含量的混合标准溶液, 每个水平进行3次重复实验, 计算回收率和相对标准偏差(RSD)。结果表明, 乳液基质、水剂和膏霜基质的加标回收率分别为58.2%~119.1%、60.0%~117.5%和58.8%~116.1%, RSD分别为1.03%~11.9%、1.88%~11.6%和2.09%~11.9%。上述数据表明水剂和膏霜基质的加标回收率和RSD均在乳液基质结果的范围内, 表明这一方法适合水剂和膏霜基质的筛查测定。最低回收率较低(数据为58.2%)可能与某些抗生素化合物本身的性质有关, 得到的回收率范围与文献[18]基本一致。
本研究所用样品为2016年监督抽检的49批祛痘类化妆品。《化妆品卫生技术规范》(2015年版)甲硝唑的检验方法为高效液相色谱法, 以保留时间和紫外光谱图定性, 用此方法共检出可疑样品10批, 由于化妆品基质复杂, 仅通过保留时间和光谱无法准确定性, 易造成假阳性。本研究通过测得的精确质量数进行初筛, 确定样品中初筛检出的化合物, 然后将样品中可疑成分的二级碎片离子图和相应对照品的二级碎片离子图进行相似度比较, 若相似度达到95%, 则确定样品中添加了该化合物。采用本研究建立的方法对10批可疑样品进行了检测, 其中2批样品同时检出甲硝唑(7.2 mg/kg和8.2 mg/kg)和氧氟沙星(6.0 mg/kg和6.3 mg/kg), 1批样品检出克林霉素(35.2 mg/kg), 样品中几种检出物质的二级碎片离子图与对照品的相似度均在95%以上。
本研究采用乙腈超声提取, 运用高选择性的Orbitrap高分辨质谱技术, 同时测定了化妆品中66种抗生素化合物, 建立了筛查数据库。本工作可以快速、准确地筛查、确证化妆品中的抗生素类禁用化合物, 大大提高了日常检验的工作效率, 对日常监管检验工作具有非常重要的意义。
2018,
Vol. 36 Issue (7): 643-650
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2018,
Vol. 36 Issue (7): 643-650
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