2017年8月初, 荷兰被爆出“毒鸡蛋”事件, 这是近年来少有的波及全球的食品安全问题, 也使得氟虫腈成为世人瞩目的焦点。氟虫腈为苯基吡唑类杀虫剂, 对昆虫有胃毒作用, 能够有效杀死跳蚤、虱子等生物, 被世界卫生组织列为“对人类有中度毒性”的化学品, 但其对甲壳类水生生物和蜜蜂具有较高毒性, 并且在水和土壤中降解缓慢[1-3]。我国规定自2009年10月1日起, 除卫生用、玉米等部分旱田种子包衣剂外, 在我国境内停止销售和使用用于其他方面的含氟虫腈成分的农药制剂[4]。
目前世界多个国家和组织制定了鸡蛋中氟虫腈总量(氟虫腈及其代谢物)的最大标准限量(MRL), 但我国最新的《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》(GB 2763-2016)中没有规定鸡蛋的最大残留限量值, 规定了玉米中氟虫腈的最大残留限量值为0.1 mg/kg[5]。饲料中过高含量的氟虫腈会在动物体内蓄积, 导致动物源性食品中氟虫腈含量超标, 危害消费者健康。在毒鸡蛋事件爆发以后, 农业部连发《农业部办公厅关于切实加强农药使用指导和市场监管的通知》《农业部办公厅关于切实加强蛋禽养殖质量安全管理工作的通知》等通知, 要求严格管理氟虫腈, 严防氟虫腈在生产经营各环节对饲料原料和产品造成污染, 严禁将氟虫腈作为兽药经营和使用。
目前针对氟虫腈及其代谢物的测定主要集中在蔬菜、水果、茶叶以及近期研究较多的禽蛋及蛋制品方面, 测定方法主要包括气相色谱法(GC)[6-9]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[10-14]以及液相色谱-质谱联用法(LC-MS)[15-18]等。但是目前国内还没有针对饲料中氟虫腈含量测定的相关标准, 也未见相关的文献报道, 给产品检验、风险排查与控制带来了诸多不便。
本研究采用QuEChERS净化法进行样品前处理, 建立了饲料中氟虫腈及其代谢物残留量的高效液相色谱-串联质谱法, 为政府的日常监管、养殖者的风险控制提供了有力的技术支持。
Sciex 4500 QTrap四极杆串联线性离子阱质谱仪(美国Sciex公司), 配LC-30A高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司); Milli-Q超纯水发生器(美国Millipore公司); DTC-27J超声波清洗机(湖北鼎泰生化科技设备制造有限公司); MS 3 Basic涡旋混合器(德国IKA公司); Multifuge X3R离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)。
氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈亚砜、氟虫腈砜(纯度＞98%)购自农业部农业环境保护科研监测所; 氟虫腈同位素内标(13C215N2-氟虫腈)购自北京振祥科技有限公司; 甲醇、乙腈(色谱纯)购自德国Merck公司; C18粉、石墨化炭黑(GCB)、N-丙基乙二胺(PSA)购自美国Agilent公司; 中性氧化铝(Al2O3, 100~200目)、氯化钠(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司; 0.2 μm聚四氟乙烯(PTFE)微孔滤膜购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
分别准确称取适量氟虫腈及其代谢物标准品和氟虫腈内标标准品, 置于10 mL容量瓶中, 用乙腈溶解并定容, 配制质量浓度为500 mg/L的标准储备液, 于-18 ℃避光保存。准确移取适量上述标准储备液, 根据需要用乙腈逐级稀释, 配制成适当浓度的标准工作液(含氟虫腈内标2.0 μg/L), 现用现配。
饲料样品经粉碎均匀后制成待测样, 于室温下密封保存。准确称取粉碎样品2 g(精确到0.01 g), 置于50 mL具塞离心管中, 加入20 μL氟虫腈内标(1.0 mg/L)和10 mL纯水, 涡旋混匀, 加入10.0 mL乙腈, 混匀, 超声提取30 min, 加入2 g氯化钠, 剧烈振荡1 min, 以10000 r/min高速离心5 min; 移取上清液1.0 mL, 转入2 mL QuEChERS净化管(含有50 mg GCB、50 mg PSA和50 mg Al2O3)中, 涡旋振荡1 min, 以16000 r/min离心3 min, 上清液用0.2 μm PTFE滤膜过滤, 待测。
色谱柱:Waters HSS T3 C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm); 柱温40 ℃; 流动相:A为纯水, B为甲醇; 流速:0.3 mL/min。梯度洗脱程序:0~4.0 min, 60%B~90%B; 4.0~5.5 min, 90%B; 5.5~7.0 min, 60%B。进样量:5 μL。
离子源:电喷雾电离(ESI)源, 负离子模式:多反应监测模式; 电喷雾电压:4500 V; 气帘气压力:0.21 MPa; 雾化气压力:0.38 MPa; 辅助气压力:0.38 MPa; 辅助气温度:550 ℃。其他质谱参数见表 1。
取200 μg/L的混合标准溶液, 用流动注射泵直接注入质谱仪进行质谱参数的优化。实验发现，氟虫腈及其代谢物在正、负离子模式下均有响应, 这主要是因为它们都有氨基, 既可以得到一个质子形成[M+H]+, 也可以失去一个质子形成[M-H]-, 但是在负离子模式下干扰较小, 信噪比更高, 因此本研究采用负离子模式。在负离子模式下, 对氟虫腈及其代谢物进行母离子扫描, 选择[M-H]-离子作为母离子, 确定母离子后进行子离子扫描, 选择最高响应的子离子作为定量离子, 响应次高的子离子作为定性离子, 再对每个离子对的去簇电压及碰撞能量进行优化, 得到最优质谱参数(见表 1)。氟虫腈及其代谢物的二级质谱图见图 1。
实验考察了水-甲醇、水-乙腈、10 mmol/L乙酸铵水溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇等4种流动相体系对色谱峰峰形及响应的影响。结果显示, 4种体系均能获得较好的色谱峰形, 但是采用水-甲醇体系时目标化合物的响应值最大, 灵敏度最高。因此本研究采用水-甲醇作为流动相。
饲料是一类相当复杂的样品, 不仅含有玉米、豆粕等植物源性原料, 还含有鱼粉、骨粉、羽毛粉等多种动物源性原料, 同时为了提高饲料回报率还要添加大量的矿物质元素、维生素、氨基酸以及各种植物提取液, 甚至部分种类的抗生素和促生长激素, 这使得一些在植物源性食品或动物源性食品中已较为成熟的分析方法无法直接应用到饲料样品的分析中。
与经典的固相萃取技术相比, QuEChERS净化法具有使用方便、成本低、效率高、试剂用量小、环境友好等特点, 越来越多地被分析工作者使用。实验分别采用50 mg中性氧化铝、PSA、GCB以及C18粉等几种常用的吸附剂考察其对目标化合物的吸附能力。结果表明, 4种吸附剂对氟虫腈及其代谢物的吸附率极低, 回收率可达95.4%~102.6%。
采用液相色谱-质谱分析时普遍存在基质效应(ME), ME是影响灵敏度、准确度的主要因素之一, 样品前处理的主要目的就是尽可能地降低ME对测量结果的影响。实验采用未净化的空白样品提取液以及经上述4种吸附剂净化后的空白样品提取液配制基质匹配标准溶液, 同时采用乙腈配制试剂标准溶液。通过ME=(基质匹配标准溶液峰面积/试剂标准溶液峰面积-1)×100%的计算方法考察净化前及采用不同吸附剂净化后的基质效应。
当ME为0时表示无基质效应, ME为负值时表示存在离子化抑制效应, ME为正值时表示存在离子化增强效应; ME越偏离0, 表示基质效应越显著。实验结果表明:未净化前具有很强的离子化抑制效应, ME为-42.1%~-64.0%; C18、GCB降低基质效应效果不明显, ME分别为-34.0%~-60.1%和-39.6%~-58.8%; Al2O3与PSA对于降低基质效应具有较好的效果, ME分别为-22.5%~-26.6%和-22.6%~24.6%(见表 2)。
实验又比较了不同含量Al2O3与PSA混合材料的净化效果, 结果表明, 采用50 mg PSA与50 mg Al2O3混合净化材料可进一步降低基质效应, 具有较好的净化效果。虽然GCB在降低基质效应上无显著效果, 但是可以吸附各种色素, 有利于延长色谱柱的使用寿命, 因此最终分别采用50 mg Al2O3、PSA与GCB作为净化材料。
在1.3节条件下对系列混合标准工作液进行测定, 采用内标法定量, 以目标化合物与内标定量离子对的峰面积之比为纵坐标(Y)、对应的质量浓度之比为横坐标(X)进行线性回归, 4种目标化合物在各自的线性范围内线性关系良好, 相关系数(r)＞0.9998。用空白样品提取液配制适当浓度的基质匹配标准溶液, 然后在1.3节条件下进行测定, 以3倍和10倍信噪比确定方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ), 详见表 3。
选取空白饲料样品, 分别加入高、中、低3个水平的混合标准溶液, 每个水平平行测定5次, 考察方法的回收率和精密度。氟虫腈及其代谢物的加标回收率为92.3%~105.4%, 相对标准偏差为0.9%~2.3%, 详见表 4。
采用本研究建立的分析方法对市售的24批次不同来源的饲料样品进行检测, 其中15批次饲料样品检出氟虫腈, 含量为0.24~1.73 μg/kg; 6批次饲料样品检出氟虫腈砜, 含量为0.21~0.29 μg/kg; 1批次饲料样品检出氟虫腈亚砜, 含量为0.29 μg/kg; 1批次饲料样品检出氟甲腈, 含量为0.41 μg/kg。由此可见, 饲料中氟虫腈及其代谢物的检出率较高, 需引起监管部门的重视。
本研究建立了QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱测定饲料中氟虫腈及其代谢物残留量的分析方法。该方法灵敏度高, 净化效果好, 操作简单, 精密度、准确度高, 适用于大批量样本中氟虫腈及其代谢物残留量的测定。
2018,
Vol. 36 Issue (7): 629-633
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2018,
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