快速、准确、低溶剂消耗、绿色环保的分析方法研究一直是分析领域发展的重要趋势[1, 2]。虽然分析仪器的不断发展提高了样品分析的速度和灵敏度, 但大部分分析仪器都无法直接测定样品基体中的待测物。传统的或目前采用较多的样品前处理方法如液液萃取[3]、微萃取[4, 5]、吸附类材料富集[6-8]、微流体[9]等, 或需要长时间、重复性的循环操作, 容易造成样品本身的破坏; 或使用大量有机溶剂, 造成环境污染; 或无法适应现代分析仪器分析速度快、灵敏度高的要求[10, 11]。因此, 研究找到更加简单、快速、环保、适应性强的样品富集方法是非常必要的。
2007年Keene等[12]提出气泡可以对有机物产生富集作用。最初, 有研究者[13, 14]发现, 在香槟和其他酒饮料中的气泡可对某些有机物产生富集。在此基础上, Keene等[12]研究发现, 海洋破裂气泡中有机物的浓度可以比海洋中有机物的浓度高2~3个数量级。随后, 研究者们陆续建立各种装置模型研究气泡富集现象[15-17]。这种富集效果主要是由于有机物的高表面活性使其在液相体系中被逐渐富集到气-液界面(气泡)上, 然后气泡在液面破裂, 产生的微小液滴(气溶胶)便富含高浓度有机物[18-21]。可见, 气泡富集技术是可以用于有机物选择性富集的一种简单、省时、无污染、低成本的方法[22]。
抗生素在畜禽养殖中应用非常广泛[23]。当动物食用添加抗生素的饲料后, 绝大部分抗生素以原药或代谢产物的形式排出体外, 随地表径流汇入江河或渗入地下[24], 从而引发土壤、水体等一系列环境污染问题, 间接威胁到人类的健康。因此, 对环境中抗生素的检测尤为必要。目前进行抗生素检测时较常使用的样品前处理方法有固相萃取[25]、液相微萃取[26]、和超临界萃取[27]等。这些前处理方法虽然各有优点, 但是大都需要使用特定的试剂或材料, 成本较高, 甚至对环境还有一定的污染。本文则选择了广谱类抗生素土霉素作为研究对象, 建立了气泡富集-高效液相色谱检测地表水样中微量土霉素的方法。相比于其他样品前处理方法, 本法采用的气泡富集法不但装置简单, 成本低廉易操作, 且不使用任何有机溶剂, 避免了环境污染, 同时该方法富集倍数高, 灵敏度高, 能满足地表水样中微量土霉素的定性定量分析要求, 是一种值得推广的新型样品处理方法。
土霉素标准品(中国食品药品检定研究院); 地表水样(取自南昌市某地); 甲醇和乙腈(色谱级, 上海国药集团化学试剂有限公司); 三氟乙酸(分析纯试剂, 上海国药集团化学试剂有限公司)。
100 μm孔径毛细管(美国安捷伦公司); 氮气、二氧化碳、乙烯(99.999%, 南昌国滕气体有限公司)。实验室用水为二次蒸馏水。
Agilent-1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司); KQ5200DB数控超声清洗器(昆山舒美超声仪器有限公司)。
自制气泡富集装置(具体见2.1节)。
准确称取10.0 mg土霉素标准品, 于50 mL烧杯中溶解, 用超纯水定溶于100 mL棕色容量瓶中, 得到100 mg/L的标准储备液, 避光保存, 待用。
将待测样品溶液放入气泡富集装置的下段开口的长管玻璃管中, 溶液底部距溶液表面的液面高度为100 cm, 长口处通入压强为10 kPa的二氧化碳气体, 由此产生的气溶胶液滴通过距液面高度为3 cm玻璃片收集, 并引流到另一个玻璃管中。收集10 min, 得到350 μL左右的待测溶液, 再用于色谱分析。
色谱柱为Accurasil-C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm, 美国美瑞泰克科技有限公司); 流动相为乙腈+0.02%(v/v)三氟乙酸+甲醇, 流速为1.5 mL/min; 柱温为25 ℃; 紫外检测波长为350 nm。
本法采用梯度洗脱, 洗脱梯度见表 1。
自行搭建的气泡富集装置(见图 1)主要包括气泡产生和气泡收集两部分。其中气泡产生部分由一个下端开口的敞口玻璃管组成, 在紧挨开口上面用孔径100 μm的毛细管插入橡胶活塞, 制作出均匀分布的多孔材料隔层, 气体从玻璃管下端开口处通入, 通过隔层中毛细管孔进入玻璃管所盛的待测溶液中, 产生气泡; 气泡收集部分则由一块玻璃片和一个敞口容器组成, 溶液中待测组分会富集在气泡产生部分产生的气泡表面, 并随气泡上升到液面, 气泡破裂后产生气泡液滴, 通过玻璃片收集产生的气泡液滴并引流到敞口玻璃管, 累积到一定量再用于色谱分析。
气体种类是影响气泡富集效果的一个重要因素, 不同的气体所产生的气泡与溶液中待测组分接触所达到的富集效果不同。
根据气体自身的稳定性, 本文选择3种气体:氮气、二氧化碳、乙烯(水中的溶解度:二氧化碳＞乙烯＞氮气)。气体由于气压通过气液分离界面, 产生的气泡与溶液中待测组分接触后从液面破裂, 通过玻璃片收集气泡从液面破裂产生的气泡液。装置的气压为10 kPa, 液面高度为100 cm, 玻璃片中心距液面高度为3 cm, 收集气泡时间为10 min。结果发现, 采用氮气、二氧化碳、乙烯时对应的土霉素峰面积分别为91、125、103, 故二氧化碳对土霉素富集效果最好。这可能是因为氮气、乙烯不溶于水, 而二氧化碳微溶于水, 当通入二氧化碳时, 待测有机物更容易在二氧化碳带动下富集到气-液界面(气泡)上, 伴随气泡在液面破裂, 产生的气溶胶含有更高浓度的待测有机物。本文采用二氧化碳作为通入的气体。
从气液分离界面通入的二氧化碳气压是影响富集效果的一个重要因素。实验发现, 若气压过小, 气体几乎不能通过气液分离界面, 不能产生气泡; 若气压过大, 会产生剧烈的鼓动气泡, 影响富集效果。
设置二氧化碳气压大小分别为5、10、20、30、50 kPa, 每个气压重复测7次, 其余条件同2.2.1节。如图 2所示, 气压在0~10 kPa时, 峰面积逐渐增加, 气压超过10 kPa以后, 峰面积迅速减小, 10 kPa时峰面积最大, 富集效果最好。
溶液底部距溶液表面的高度是影响富集效果的一个重要因素。实验发现, 液面高度过高时, 溶液底部压力越大, 需要的气体压力越大, 同时气泡上升到液面过程中, 易与其他气泡结合, 形成直径更大的气泡, 影响富集效果; 液面高度过低时, 气泡与溶液中待测组分的接触不够充分, 影响富集效果。
在以上优化条件下, 设置液面高度分别为10、30、50、100、150 cm, 每个高度重复测7次, 其余条件同2.2.1节。如图 3所示, 液面高度为10~100 cm时，峰面积逐渐增加, 100 cm以后峰面积开始减小, 液面高度为100 cm时峰面积最高, 富集效果最好。
玻璃片与水平面成30°角, 其中心距液面的高度是影响气泡液收集的一个重要因素。实验发现, 玻璃片距液面过高时, 气泡从液面破裂产生的气泡液接触不到玻璃片, 从而无法收集样品; 玻璃片距液面过低时, 玻璃片易与气泡破裂带动的水花接触, 从而稀释收集的气泡液, 影响富集。
在以上优化的条件下, 设置玻璃片中心距液面高度分别为1、2、3、4、5 cm, 每个高度重复测7次, 其余条件同2.2.1节。如图 4所示, 玻璃片中心距液面高度在1~3 cm时, 峰面积逐渐增加, 3~5 cm时峰面积迅速减小, 高度为3 cm时峰面积最高, 富集效果最好。
收集时间是影响富集效果的一个因素。实验发现, 时间过短, 收集到的气泡液体积达不到检测要求, 需要稀释后定容检测; 耗时过长, 则原样品溶液浓度降低, 气泡液浓度降低, 影响富集效果。
在以上优化的条件下, 设置收集时间分别为3、5、10、20 min。每个时间点重复测7次。如图 5所示, 收集时间为0~20 min时, 随着时间的增加, 收集到的气泡液体积越加, 在0~10 min内峰面积有上升的趋势, 10~20 min时峰面积开始下降。故选择收集时间为10 min。
分别取1.3节制备好的标准溶液, 配制成0.01、0.05、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00、25.00、50.0 mg/L的标准溶液, 在1.5节的色谱条件下进行测定, 得到土霉素的标准曲线。土霉素在0.01~50.0 mg/L范围内线性关系良好, 线性回归方程为A=4.65C-0.72(式中A为峰面积; C为质量浓度, mg/L), 相关系数为0.999 8。取1.00 mg/L的土霉素标准溶液, 在上述色谱条件下重复测定11次, 峰面积的RSD为4.8%。根据公式[28]LOD=3cσ/S计算检出限LOD, 其中c为标准品的质量浓度(mg/L), σ为标准偏差, S为净相应信号强度的平均值。结果LOD为0.038 mg/L。可见, 本文建立的色谱检测方法的灵敏度和精密度均能达到溶液中微量土霉素检测的要求。
取质量浓度1 mg/L的土霉素标准溶液6份, 其中3份不经气泡富集处理, 直接在1.5节的色谱条件下平行测定3次, 另外3份在优化的气泡富集方法和1.5节的色谱条件下平行测定3次, 各取平行测定的平均值, 得到如图 6所示的色谱图。方法的SD为2.25, 富集倍数为37.06。可见, 本法对土霉素具有较好的富集效果, 有效提高了检测的灵敏度, 且整个萃取过程绿色环保。
取地表水样品, 采用以上优化的气泡富集方法和1.5节的色谱条件对其进行分析检测, 结果均未检出土霉素。取该地表水样加入适量土霉素标准溶液, 制成0.005 mg/L的模拟样品溶液, 平行取3份100 mL模拟样品溶液。分别加入0.000 5 mg土霉素标准品, 此时溶液浓度为0.01 mg/L。对该3份溶液采用气泡富集法富集后进行HPLC分析, 计算加标回收率。土霉素检测的平均加标回收率可达101.9%, 说明本法准确度高。
由于模拟样品中土霉素的质量浓度(0.005 mg/L)低于其HPLC分析之线性回归方程的线性范围下限(0.01 mg/L), 无法直接测定其浓度。而经过的气泡富集处理则可以检测出来, 说明本法提高了土霉素检测的灵敏度。根据文献[29], 地表水中土霉素含量在0.01 mg/L以内, 因此本法也能满足环境水样中土霉素的测定需求。
气泡富集法是新型样品预处理方法, 操作简便、快速、绿色环保, 是有机物提取富集的有效方法。该方法装置简单, 适应性强, 气泡富集预处理方法有广阔的应用前景。不但能与HPLC结合用于水溶液中土霉素的富集和测定, 还有望与气相色谱、质谱、光谱等技术联用, 用于其他有机物质的检测。为了更好地推动气泡富集法的实际应用, 其富集机理和规律的研究还有待进一步的探索和研究。
2018,
Vol. 36 Issue (7): 665-669
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