高效液相色谱快速测定草本植物饮料中28种外源性药物和内源性成分


扩展功能
	加入收藏夹

	复制引文信息

	加入引用管理器

	Email Alert

	RSS
本文作者相关文章
	何嘉雯

	温家欣

	赖宇红

	曹雅静

何嘉雯, 温家欣, 赖宇红, 曹雅静

广东省药品检验所, 广东广州 510180

收稿日期：2018-02-04

基金项目：广东省省级科技计划项目（2015A030401062）

通讯联系人：何嘉雯, E-mail:hjw7hjw@163.com

摘要：建立了高效液相色谱快速测定草本植物饮料中28种外源性药物和内源性成分的分析方法。样品经甲醇-水（70：30，v/v）超声提取后，使用Thermo Accucore C18色谱柱（100 mm×4.6 mm，2.6 μm），以甲醇、乙腈和20 mmol/L乙酸铵溶液（pH 4.2）为流动相进行梯度洗脱，流速为1.2 mL/min，柱温为35℃，采用二极管阵列检测器，检测波长为254和220 nm，外标法定量。结果表明，28种成分在1~100 mg/L范围内线性关系良好，相关系数（r）均不小于0.999。液体样品和固体样品的检出限（LODs）分别为1~10和20~200 mg/kg。28种成分在液体和固体样品中的加标回收率分别为88.8%~118.6%和92.7%~112.3%，相对标准偏差（RSDs）分别为0.1%~6.7%和0.1%~6.4%。按上述方法检测草本植物饮料456批，检出阳性样品55批次，检出率为12.1%。该法简便快速、准确可靠，适用于草本植物饮料中28种成分的测定。

关键词：高效液相色谱法核壳色谱柱非法添加药物草本植物饮料

Determination of 28 exogenous medicines and endogenous components in herbal drink using high performance liquid chromatography

HE Jiawen, WEN Jiaxin, LAI Yuhong, CAO Yajing

Guangdong Institute for Drug Control, Guangzhou 510180, China

Foundation item: Science and Technology Planning Project of Guangdong Province (No. 2015A030401062)

Abstract: A high performance liquid chromatographic method for the determination of 28 exogenous medicines and endogenous components in the herbal drink was developed. The samples were extracted ultrasonically with methanol-water (70:30, v/v), and the extracts were separated in a Thermo Accucore C18 column (100 mm×4.6 mm, 2.6 μm) with methanol-acetonitrile-20 mmol/L ammonium acetate solution (pH 4.2) as the mobile phases by gradient elution. The flow rate was 1.2 mL/min and the column temperature was 35℃. The detection wavelengths were 254 nm and 220 nm. Quantification analysis was performed by the external standard method. The result showed the compounds had a good linear relationship in the range of 1-100 mg/L, and the correlation coefficients (r) were not less than 0.999. The limits of detection (LODs) of the 28 compounds were 1-10 mg/kg in the liquid sample and 20-200 mg/kg in the solid sample. The average recoveries of the 28 compounds in the liquid and solid samples were in the ranges of 88.8%-118.6% and 92.7%-112.3% with the relative standard deviations (RSDs) of 0.1%-6.7% and 0.1%-6.4%, respectively. The method was applied to analyze 456 herbal drink samples, and 55 positive samples were found. The positive rate was 12.1%. The developed method was simple and reliable, and it was suitable for the determination of 28 components in the herbal drink.

Key words: high performance liquid chromatography (HPLC) fused core particle column illegally added medicine herbal drink

草本植物饮料凭借着去火排毒的宣传, 以功能性饮料的姿态成为饮料市场中的新宠, 人们熟知的有凉茶、板蓝根饮料等^[1]。随着草本植物饮料的兴起, 凉茶作为重要代表再次在市场上火起来。然而在激烈的市场竞争中, 不法商家在凉茶中非法添加化学药物, 以求达到其宣称的降火功效, 埋下了严重的安全隐患。这种违法行为并不是个别行为, 已渐渐演变成行业潜规则, 严重影响草本饮料产业健康发展, 扰乱市场秩序。

目前, 针对草本植物饮料非法添加的研究较少^[2-9]。具有解热、消炎药理作用的药物均有被非法添加的可能, 目前发现的药物有非甾体解热镇痛药、激素、抗菌药、中枢兴奋剂等^[10-14], 种类繁杂。谢文辉等^[3]和谢集照等^[4]采用TLC、刘辉等^[5]采用酶联免疫法, 建立了对乙酰氨基酚的快筛方法。温家欣等^[6]采用HPLC快速测定凉茶中11种非法添加化学药物。宋宁宁等^[7]建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS测定凉茶中12种化学药物。韩婉清等^[8]采用SPE-UPLC-MS/MS测定凉茶中15种植物源性兴奋剂和外源性药物。通过QuEChERS、SPE净化手段去除基质干扰, 使液相色谱-质谱联用法获得较好的结果。然而, 本研究组在大批量实际样品检测过程中发现, 液相色谱-质谱联用法净化手段虽能减少基质污染, 但凉茶中外源性药物过高的浓度造成的自身污染仍难以避免, 使得仪器污染后出现大量假阳性, 影响实验重复性。虽然稀释样品能改善污染情况, 但由于不同药物间添加量的极大差异和非法添加的未知性, 稀释容易造成漏检。而且目前研究集中在液体凉茶, 没有涵盖颗粒剂、凉茶粉、代用茶等新剂型。本文以添加风险较高的28种成分作为研究对象, 选择抗污染能力强、重复性好的高效液相色谱法, 建立一套准确性好、耐用性高的检测方法, 为草本植物饮料的监督检验提供助力。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters e2695高效液相色谱仪, 配二极管阵列检测器(美国Waters公司); Thermo Accucore C18色谱柱(100 mm×4.6 mm, 2.6 μ m, 美国Thermo公司); Sartorius MS205DU电子天平(德国Sartorius公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

标准品纯度均≥98%, 其中对乙酰氨基酚(paracetamol)、水杨酸(salicylic acid)、咖啡因(caffeine)、安乃近(dipyrone)、4-甲氨基安替比林(4-methylaminoantipyrine)、甲氧苄啶(trimethoprim)、氨基比林(antipyrine)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)、非那西丁(phenacetin)、泼尼松(prednisone)、氢化可的松(hydrocortisone)、吡罗昔康(piroxicam)、异丙安替比林(propyphenazon)、地塞米松(dexamethasone)、舒林酸(sulindac)、酮洛芬(ketoprofen)、萘普生(naproxen)、醋酸泼尼松(prednisone acetate)、芬布芬(fenbufen)、醋酸地塞米松(dexamethasone acetate)、奥沙普秦(oxaprozin)、萘丁美酮(nabumetone)、双氯芬酸钠(diclofenac sodium)、保泰松(phenylbutazone)、吲哚美辛(indometacin)、布洛芬(ibuprofen)和阿司匹林(aspirin)均购自中国食品药品检定研究院; 甲基泼尼松龙(methylprednisolone)购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。甲醇和乙腈(均为色谱纯)购自美国Holly公司, 乙酸铵和冰醋酸(均为分析纯)购自广州化学试剂厂, 实验用水为超纯水。

草本饮料样品收集于2016年~2017年风险监测任务, 范围涵盖广东全省, 包含预包装产品和现场制售凉茶, 共456批次。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液:除阿司匹林外, 分别准确称取各成分标准品0.02 g, 用甲醇溶解并配制2 g/L的标准储备液。吡罗昔康难溶, 可用冰醋酸助溶。阿司匹林采用甲醇-冰醋酸(99 : 1, v/v)配制。

混合标准溶液:分别吸取一定量的标准储备液, 用甲醇-水(70 : 30, v/v)稀释, 混匀, 配制成质量浓度为50 mg/L的混合标准溶液, 现配现用。定量时, 阿司匹林需用甲醇-冰醋酸(99 : 1, v/v)单独配制。

混合标准工作溶液:吸取适量混合标准溶液, 用甲醇-水(70 : 30, v/v)配制成1~50 mg/L的系列混合标准溶液, 现配现用。必要时, 可按实际需要, 采用分组方式配制质量浓度范围更广的混合标准工作溶液。

1.3 样品前处理

液体样品:摇匀, 称取5.0 g试样, 加甲醇-水(70 : 30, v/v)适量。超声提取15 min, 放冷, 定容至25 mL, 摇匀, 提取液过0.22 μ m滤膜, 待测。固体饮料、代用茶和颗粒:样品先用研磨机充分粉碎或用研钵研细, 称取0.5 g试样, 加甲醇-水(70 : 30, v/v)适量, 超声提取30 min, 放冷, 定容至50 mL, 摇匀, 提取液过0.22 μ m滤膜, 待测。若样品中待测成分浓度超出线性范围, 用甲醇-水(70 : 30, v/v)适当稀释。

1.4 分析条件

色谱柱:Thermo Accucore C18色谱柱(100 mm×4.6 mm, 2.6 μ m); 流速为1.2 mL/min; 柱温为35 ℃; 进样量为5 μL; 检测波长为254和220 nm。流动相:A为甲醇, B为乙腈, C为20 mmol/L乙酸铵溶液(pH 4.2, 冰醋酸调)。梯度洗脱条件:0~3 min, 3%A~6%A, 6%B~12%B, 91%C~82%C; 3~4 min, 6%A~8%A, 12%B~15%B, 82%C~77%C; 4~9 min, 8%A~12%A, 15%B~23%B, 77%C~65%C; 9~12 min, 12%A, 23%B, 65%C; 12~24 min, 12%A~20%A, 23%B~38%B, 65%C~42%C; 24~25 min, 20%A~3%A, 38%B~6%B, 42%C~91%C; 25~30 min, 3%A, 6%B, 91%C。

1.5 计算公式

除阿司匹林外, 27种成分计算公式为:

(1)

其中X为草本植物饮料中化学成分的含量(mg/kg), C为由标准曲线得出的质量浓度(mg/L), V为稀释体积(mL), m为试样取样量(g)。

阿司匹林在溶液中易水解, 计算时需对降解产物水杨酸进行折算, 计算公式为:

(2)

其中asp.表示阿司匹林, s.a.表示水杨酸。仅检出水杨酸时, 视为阿司匹林未检出, 不进行折算。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

核壳填料能减少分析物在色谱柱中的涡流扩散, 从而获得较好的分离效率, 缩短分析时间, 实现快速分离^[15]。考察了不同品牌和不同填料的C18核壳色谱柱的分离效果, 包括Thermo Accucore C18(100 mm×4.6 mm, 2.6 μ m)、Thermo Accucore aQ(100 mm×4.6 mm, 2.6 μ m)、Thermo Accucore RP-MS(100 mm×4.6 mm, 2.6 μ m)、Agilent Poroshell 120 EC-C18(100 mm×4.6 mm, 2.7 μ m)和ACE UltraCore SuperC18(100 mm×4.6 mm, 2.5 μ m)。图 1为分别使用5种色谱柱的分离情况比较。Thermo Accucore C18、Thermo Accucore aQ和Thermo Accucore RP-MS为同品牌的不同C18填料色谱柱, 在相同的色谱条件下保留行为基本相似, Thermo Accucore C18能基本分离28种成分, 但Thermo Accucore aQ在5~10 min、Thermo Accucore RP-MS在20~25 min分离效果不理想。Agilent Poroshell 120 EC-C18除氢化可的松和吡罗昔康分离较差、保泰松和吲哚美辛重合外, 其余24种成分分离良好。ACE UltraCore SuperC18除萘丁美酮和双氯芬酸钠分离较差外, 其余26种成分能基本分离。综上, 选择Thermo Accucore C18作为分析柱。

图 1 使用不同色谱柱时28种成分的分离色谱图 Fig. 1 Chromatograms of the 28 components separated on different columns a. Thermo Accucore C18 (100 mm×4.6 mm, 2.6 μ m); b. Thermo Accucore aQ (100 mm×4.6 mm, 2.6 μ m); c. Thermo Accucore RP-MS (100 mm×4.6 mm, 2.6 μ m); d. Agilent Poroshell 120 EC-C18 (100 mm×4.6 mm, 2.7 μ m); e. ACE UltraCore SuperC18 (100 mm×4.6 mm, 2.5 μ m).
Peak Nos: 1. paracetamol; 2. salicylic acid; 3. caffeine; 4. aspirin; 5. dipyrone; 6. trimethoprim; 7. antipyrine; 8. 4-methylaminoantipyrine; 9. sulfamethoxazole; 10. phenacetin; 11. prednisone; 12. hydrocortisone; 13. piroxicam; 14. propyphenazon; 15. methylprednisolone; 16. dexamethasone; 17. sulindac; 18. ketoprofen; 19. naproxen; 20. prednisone acetate; 21. fenbufen; 22. dexamethasone acetate; 23. oxaprozin; 24. nabumetone; 25. diclofenac sodium; 26. phenylbutazone; 27. indometacin; 28. ibuprofen.

2.1.2 缓冲盐pH值的优化

由于28种成分结构各异, 缓冲盐pH值的变动对酸碱物质的保留行为有较大影响, 可能改变出峰顺序。考察pH 4~pH 5之间各成分的保留行为。随着pH值降低, 保泰松、吡罗昔康、阿司匹林、舒林酸、酮洛芬、萘普生、芬布芬、奥沙普秦、双氯芬酸钠、吲哚美辛、布洛芬的保留时间增加, 氨基比林、4-甲氨基安替比林的保留时间减少, 其余成分的保留时间变化不大。当缓冲盐pH值为4.2时, 分离效果最佳。

2.1.3 光谱特征和检测波长的选择

阿司匹林、水杨酸、布洛芬在220 nm下有较强吸收。但受梯度影响, 在220 nm下的色谱基线波动较大, 阿司匹林、水杨酸的积分效果较差。其他成分最大吸收波长分布在240~290 nm之间, 在254 nm下均有良好的响应。综合考虑, 选取254 nm作为主要检测波长, 220 nm作为布洛芬的辅助检测波长。

2.2 前处理的优化

2.2.1 提取溶剂的选择

28种成分均能溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂, 综合考虑液相色谱的适用性, 提取溶剂考察以甲醇、乙腈为主。对于固体样品, 考察了水、甲醇-水(70 : 30, v/v)、甲醇、甲醇-乙腈(50 : 50, v/v)的提取效果。部分成分在水中溶解度较差, 回收率不理想; 有机试剂提取效果佳, 但提取液有较强的溶剂效应, 峰形差。甲醇-水(70 : 30, v/v)作提取溶剂时回收率达92%以上, 同时避免高有机溶剂比例带来溶剂效应, 令人满意。部分液体样品沉淀较多或过于浓稠, 直接过滤干扰非常大。同法考察液体样品的提取溶剂, 结果与固体样品类似, 甲醇-水(70 : 30, v/v)作提取溶剂时回收率达88%以上。因此选择甲醇-水(70 : 30, v/v)作为提取溶剂。

2.2.2 易降解成分的稳定性考察

阿司匹林、安乃近在溶液中稳定性较差, 对其稳定性进行考察。阿司匹林的降解物主要为水杨酸, 安乃近的降解物主要为4-甲氨基安替比林, 其降解程度与溶剂和基质有关。在甲醇-水(70 : 30, v/v)中, 阿司匹林24 h内降解64%, 安乃近24 h内降解9%。将空白样品按1.3节方法进行前处理, 制得空白样品溶液, 在该溶液中阿司匹林24 h内降解90%, 安乃近24 h内降解10%。在甲醇-冰醋酸(99 : 1, v/v)中, 阿司匹林24 h内几乎不降解。因此, 阿司匹林标准溶液采用甲醇-冰醋酸(99 : 1, v/v)配制, 现配现用。当计算阿司匹林含量时, 将降解的水杨酸进行折算, 更为合理。本实验标准溶液和样品溶液配制后应在24 h内完成分析。

2.3 方法学评价

2.3.1 线性范围与检出限

除阿司匹林外, 准确吸取适量混合标准溶液, 用甲醇-水(70 : 30, v/v)配制质量浓度为1、5、10、25、40和50 mg/L的系列溶液。阿司匹林采用甲醇-冰醋酸(99 : 1, v/v)配制, 质量浓度为5、10、25、40、50和100 mg/L。以峰面积(y)对质量浓度(x, mg/L)进行线性回归, 结果表明各成分呈良好的线性关系, 相关系数(r)均大于0.999(见表 1)。

表 1 28种成分的线性方程、相关系数(r)、线性范围与检出限 Table 1 Linear equations, correlation coefficients (r), linear ranges and limits of detection (LODs) of the 28 components

Compound	Linear equation	r	Linear range/(mg/L)	LOD in liquid sample/(mg/kg)	LOD in solid sample/(mg/kg)
Paracetamol	y=34.7953x-2.1311	1.0000	1.0-52.0	1	20
Salicylic acid	y=1.7625x-2.2435	0.9996	1.1-57.3	5	100
Aspirin	y=2.4511x-1.7813	0.9997	5.9-117.2	10	200
Caffeine	y=12.4111x+1.5720	1.0000	1.0-51.7	5	100
Trimethoprim	y=11.6119x+1.1034	0.9996	1.0-51.7	5	100
Dipyrone	y=11.6934x-0.7964	1.0000	1.1-53.7	5	100
Antipyrine	y=19.6327x-3.5051	1.0000	1.1-54.9	5	100
4-Methylaminoantipyrine	y=22.8386x-0.1459	1.0000	1.0-51.9	5	100
Sulfamethoxazole	y=23.0830x-3.4705	0.9995	1.1-53.2	5	100
Phenacetin	y=42.2160x-2.9783	1.0000	1.0-51.3	1	20
Prednisone	y=21.3166x-9.4945	0.9999	1.0-52.2	1	20
Hydrocortisone	y=26.7350x-11.4824	0.9999	1.0-52.0	1	20
Piroxicam	y=22.7893x-16.3374	0.9998	1.1-53.3	5	100
Propyphenazon	y=22.8157x-3.3998	1.0000	1.1-52.9	1	20
Methylprednisolone	y=11.7777x-5.7735	0.9999	1.0-52.4	5	100
Dexamethasone	y=20.4622x-8.9715	0.9999	1.0-52.5	1	20
Sulindac	y=24.5976x-4.8700	0.9997	0.9-45.2	1	20
Ketoprofen	y=38.9099x-7.9927	0.9998	1.1-53.5	1	20
Naproxen	y=10.7753x+1.9379	0.9998	1.1-56.5	5	100
Prednisone acetate	y=20.7696x-8.8018	0.9999	1.0-50.6	1	20
Fenbufen	y=17.0031x-3.0801	0.9998	1.1-54.1	5	100
Dexamethasone acetate	y=13.0706x-5.5947	0.9999	1.1-53.3	5	100
Oxaprozin	y=24.4579x+2.9971	0.9998	1.0-52.4	1	20
Nabumetone	y=10.8904x-0.0205	0.9999	1.0-51.1	5	100
Diclofenac sodium	y=10.3540x+4.6466	0.9993	1.2-60.0	5	100
Phenylbutazone	y=22.6626x+6.8173	0.9998	1.0-51.9	1	20
Indometacin	y=10.3052x-11.2270	0.9998	1.2-57.7	1	20
Ibuprofen	y=25.5432x-40.1303	0.9997	5.2-51.7	10	200
y: peak area; x: mass concentration, mg/L.

表 1 28种成分的线性方程、相关系数(r)、线性范围与检出限 Table 1 Linear equations, correlation coefficients (r), linear ranges and limits of detection (LODs) of the 28 components

当浓度接近检出限时, 应考虑样品基质的干扰, 配制基质标准溶液以确定检出限(LOD)。将空白液体样品和固体饮料样品按1.3节方法进行前处理, 制得溶液作为检出限溶液稀释溶剂, 以3倍信噪比(S/N=3)的结果作为检出限。结果表明, 液体样品和固体样品中成分的检出限分别为1~10 mg/kg和20~200 mg/kg(见表 1)。

2.3.2 回收率与精密度

按照1.3节样品前处理方法向空白基质中分别加入低、中、高3个水平的混合标准溶液进行加标回收率的测定。结果(见表 2)表明, 液体样品中28种成分的加标回收率为88.8% ~118.6%, RSD为0.1% ~6.7%;固体样品中的平均加标回收率为92.7% ~112.3%, RSD为0.1% ~6.4%。

表 2 液体样品和固体样品中28种成分的加标回收率及RSD(n=6) Table 2 Spiked recoveries and RSDs of the 28 components in the liquid and solid samples (n=6)

Compound	Liquid			Solid
Compound	Spiked/(mg/kg)	Recovery/%	RSD/%	Spiked/(mg/kg)	Recovery/%	RSD/%
Paracetamol	15	107.8	2.1	300	102.5	1.3
	50	99.2	0.7	1000	107.6	0.7
	200	91.3	0.4	4000	104.7	0.4
Salicylic acid	15	111.2	6.6	300	111.9	0.4
	50	118.6	2.7	1000	104.5	2.2
	200	116.3	0.7	4000	92.7	0.7
Aspirin	200	95.7	2.2	3000	108.5	0.4
	500	98.8	6.2	6000	98.9	0.5
	1000	101.5	1.6	10000	95.9	2.7
Caffeine	15	100.1	4.8	300	103.7	1.6
	50	104.5	3.0	1000	107.1	0.9
	200	99.1	0.2	4000	100.2	0.2
Trimethoprim	15	102.8	6.0	300	97.2	2.6
	50	97.9	3.3	1000	95.7	6.4
	200	94.5	0.1	4000	100.1	0.1
Dipyrone	15	108.5	0.3	300	99.7	1.0
	50	88.8	1.4	1000	101.6	0.6
	200	88.8	2.1	4000	101.3	2.1
Antipyrine	15	105.4	4.3	300	111.2	0.9
	50	98.2	6.7	1000	108.5	4.3
	200	93.3	0.1	4000	106.7	0.1
4-Methylaminoantipyrine	15	96.1	5.9	300	102.3	2.2
	50	100.0	5.6	1000	100.5	1.0
	200	98.9	0.2	4000	101.1	0.2
Sulfamethoxazole	15	105.2	0.7	300	101.5	1.7
	50	98.6	1.6	1000	96.6	4.0
	200	93.7	0.1	4000	93.8	0.1
Phenacetin	15	114.9	4.4	300	105.6	1.3
	50	100.3	0.6	1000	109.1	0.7
	200	92.8	0.1	4000	104.6	0.1
Prednisone	15	105.5	0.9	300	105.2	1.6
	50	100.0	0.7	1000	109.6	0.4
	200	90.4	0.2	4000	102.0	0.2
Hydrocortisone	15	100.7	1.4	300	103.9	1.6
	50	101.2	0.9	1000	110.1	0.6
	200	92.0	0.2	4000	102.1	0.2
Piroxicam	15	105.9	1.5	300	100.0	1.5
	50	102.2	1.9	1000	110.7	2.2
	200	91.0	0.1	4000	96.8	0.1
Propyphenazon	15	101.5	1.5	300	102.6	2.0
	50	101.5	0.8	1000	109.2	0.5
	200	93.1	0.1	4000	104.4	0.1
Methylprednisolone	15	99.1	2.7	300	101.7	2.3
	50	98.0	1.0	1000	104.1	0.8
	200	91.6	0.2	4000	102.5	0.2
Dexamethasone	15	100.6	2.0	300	101.1	1.5
	50	100.0	0.9	1000	111.3	0.7
	200	90.1	0.2	4000	102.0	0.2
Sulindac	15	101.4	1.4	300	101.7	2.7
	50	100.8	1.2	1000	107.8	1.2
	200	90.6	0.4	4000	96.5	0.4
Ketoprofen	15	100.8	2.0	300	103.3	1.3
	50	101.6	1.2	1000	110.5	0.6
	200	91.1	0.4	4000	97.4	0.4
Naproxen	15	103.6	3.4	300	103.2	2.8
	50	103.1	1.7	1000	110.2	0.9
	200	91.5	0.3	4000	106.1	0.3
Prednisone acetate	15	99.8	2.6	300	102.7	1.7
	50	91.7	0.9	1000	100.8	0.5
	200	93.8	0.2	4000	102.6	0.3
Fenbufen	15	103.1	1.9	300	105.9	2.0
	50	99.8	1.8	1000	107.7	0.9
	200	90.6	0.3	4000	97.0	0.3
Dexamethasone acetate	15	98.7	1.7	300	100.2	1.3
	50	96.3	1.1	1000	108.7	0.8
	200	92.9	0.4	4000	101.8	0.2
Oxaprozin	15	101.3	0.6	300	101.5	1.8
	50	98.9	0.6	1000	108.2	2.7
	200	91.0	0.3	4000	97.4	0.3
Nabumetone	15	100.8	1.5	300	101.6	1.5
	50	95.6	1.4	1000	109.9	1.1
	200	92.8	0.2	4000	103.3	0.2
Diclofenac sodium	15	100.8	1.5	300	101.6	1.5
	50	95.6	1.4	1000	107.6	1.5
	200	89.4	0.3	4000	98.8	0.3
Phenylbutazone	15	107.2	2.5	300	111.7	2.7
	50	106.6	0.6	1000	112.3	5.3
	200	89.5	0.2	4000	105.2	0.2
Indometacin	15	100.1	1.7	300	101.5	1.4
	50	96.9	2.1	1000	112.0	2.8
	200	89.9	0.4	4000	95.7	0.4
Ibuprofen	50	96.0	1.2	3000	104.5	1.7
	100	96.4	3.6	6000	101.3	1.0
	200	91.5	0.1	10000	98.5	2.5

表 2 液体样品和固体样品中28种成分的加标回收率及RSD(n=6) Table 2 Spiked recoveries and RSDs of the 28 components in the liquid and solid samples (n=6)

2.4 实际样品检测

2.4.1 检测结果

应用建立的方法对456批次样品进行分析, 阳性样品代表色谱图见图 2。结果表明, 55批次样品中检出目标成分, 检出率为12.1%。检出成分包括对乙酰氨基酚、阿司匹林、咖啡因、非那西丁等。对乙酰氨基酚检出批次最多, 共48批次。普遍存在组合添加的情况, 具体结果见表 3。

图 2 阳性样品色谱图 Fig. 2 Chromatogram of the positive sample Peak Nos: 1. paracetamol; 9. sulfamethoxazole; 20. prednisone acetate.

表 3 阳性成分的检出数量和检出含量范围 Table 3 Detected amounts and detected content ranges of the positive compounds

2.4.2 检测结果分析

统计实验结果可知, 不同种类成分的添加量是不同的, 可基本分为两级浓度水平。第一级是以对乙酰氨基酚为代表的解热镇痛药, 添加范围为50~4 500 mg/kg(液体样品)和1.0×10⁴~4.5×10⁵ mg/kg(固体样品), 其特点是浓度较高、跨度较大、个别成分添加量极高。第二级为以醋酸泼尼松为代表的糖皮质激素, 添加范围为8~20 mg/kg(液体样品)和6.0×10²~6.0×10³ mg/kg(固体样品)。这种非法添加特点与药物治疗剂量相关。当两种浓度水平成分被同时添加于同一样品时, 需选择合适的稀释倍数, 避免峰过载或低含量成分漏检。另外, 部分第一级成分也存在低浓度检出的情况, 可能是非法添加现场加工器皿不洁造成的。

2.4.3 植物内源性成分的判定

草本植物饮料原料多为药食同源的中药材, 经煎制后成品的具体组分尚未明确。水杨酸为植物内源性激素, 存在于柳树皮、烟草、黄瓜等植物中。456批样品中, 没有单独检出水杨酸, 1批样品中检出水杨酸和阿司匹林。经讨论, 阿司匹林在水中易水解得到水杨酸, 若两者同时检出, 检出的水杨酸很有可能是由阿司匹林产生的。单独检测水杨酸意义不大, 当只检出水杨酸时, 不应将其折算为阿司匹林。本实验水杨酸检测的目的是辅助阿司匹林含量计算。

咖啡因是一种植物生物碱, 存在于咖啡、茶及一些可可中, 可作为食品添加剂用于可乐型碳酸饮料。然而, 咖啡因也是一种中枢神经兴奋剂, 可加强其他解热镇痛药物的疗效, 是较常用的感冒药处方。456批凉茶中, 有3批单独检出咖啡因, 均为预包装产品; 有4批同时检出咖啡因与其他解热镇痛药, 为现场制售凉茶或凉茶粉。在预包装产品中单独检出咖啡因时, 可参考其标签上的食品添加剂信息和食品分类, 判断是否非法添加。若咖啡因与外源性药物同时检出, 则有作为感冒药被加入的可能, 其检出可以作为非法添加行为的一种提示。水杨酸、咖啡因的检出不代表非法添加行为的存在, 应综合考虑各种因素, 根据实际情况加以判定。

3 结论

本文考虑到草本饮料中非法添加药物的浓度水平和差异性, 结合实际工作中液相色谱-质谱联用法出现假阳性的问题, 建立了快速测定草本植物饮料中28种外源性药物和内源性成分的HPLC分析方法。该法优化了柱体系、流动相体系、提取溶剂等参数, 并对易降解成分的计算、内源性成分的判定等进行讨论, 操作简便, 重复性高, 可为草本植物饮料中非法添加药物的监督检验提供有力的技术支撑。

参考文献

[1]	Li H F. Marketing Management Review, 2014(6): 62. 李海凤. 现代营销, 2014(6): 62.
[2]	He W B, He Z M, Pan Z W. Chinese Pharmaceutical Affairs, 2011, 25(2): 126. 何文斌, 何作民, 潘志文. 中国药事, 2011, 25(2): 126.
[3]	Xie W H, Chen S Q, Chen W M, et al. Guangdong Chemical Industry, 2013, 40(1): 104. 谢文辉, 陈少渠, 陈伟美, 等. 广东化工, 2013, 40(1): 104.
[4]	Xie J Z, Wei Q, Jiao Y, et al. Strait Pharmaceutical Journal, 2015, 27(4): 55. 谢集照, 韦倩, 焦杨, 等. 海峡药学, 2015, 27(4): 55.
[5]	Liu H, Xiong B, Chen L, et al. Guangdong Chemical Industry, 2017, 44(11): 62. 刘辉, 熊波, 陈磊, 等. 广东化工, 2017, 44(11): 62. doi: 10.3969/j.issn.1007-1865.2017.11.028
[6]	Wen J X, Chen L, Lai Y H, et al. Journal of Instrumental Analysis, 2016, 35(3): 285. 温家欣, 陈林, 赖宇红, 等. 分析测试学报, 2016, 35(3): 285.
[7]	Song N N, Zhang K M, Liu X H, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(10): 1026. 宋宁宁, 张科明, 刘向红, 等. 色谱, 2015, 33(10): 1026.
[8]	Han W Q, Wang B, Wu C S, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2016, 44(10): 1584. 韩婉清, 王斌, 吴楚森, 等. 分析化学, 2016, 44(10): 1584. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.160265
[9]	Zhang H F, Peng R F, Luo X Y, et al. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2017, 27(16): 2287. 张宏峰, 彭荣飞, 罗晓燕, 等. 中国卫生检验杂志, 2017, 27(16): 2287.
[10]	Zhuang H, Ge X S, Zhuo J, et al. China Pharmaceuticals, 2016, 25(17): 71. 庄航, 葛雪松, 卓静, 等. 中国药业, 2016, 25(17): 71.
[11]	Wen J X, Chen L, Yang W J, et al. Physical Testing and Chemical Analysis Part B:Chemical Analysis, 2017, 53(6): 621. 温家欣, 陈林, 杨文杰, 等. 理化检验(化学分册), 2017, 53(6): 621.
[12]	He R S, Huang Y T, Lei Y, et al. Journal of Instrumental Analysis, 2016, 35(11): 1486. 何睿偲, 黄艳婷, 雷毅, 等. 分析测试学报, 2016, 35(11): 1486. doi: 10.3969/j.issn.1004-4957.2016.11.021
[13]	Li X Q, Lu Y, Wang T J, et al. China Medical Herald, 2015, 12(6): 86. 黎雪清, 鲁艺, 王铁杰, 等. 中国医药导报, 2015, 12(6): 86.
[14]	Li D, Wen H M, Cui F C, et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2010, 30(8): 1527. 李丹, 文红梅, 崔福春, 等. 药物分析杂志, 2010, 30(8): 1527.
[15]	Hong X X, Shi Y, Song X J, et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2017, 37(2): 191. 洪小栩, 石莹, 宋雪洁, 等. 药物分析杂志, 2017, 37(2): 191.