色谱  2018, Vol. 36 Issue (8): 827-832   PDF    
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李洁
鞠香
王艳丽
田其燕
申中兰
胡梅
刘艳明
祝建华
3种前处理方法处理婴幼儿配方奶粉中二十二碳六烯酸、花生四烯酸、亚油酸和α-亚麻酸的差异性
李洁, 鞠香, 王艳丽, 田其燕, 申中兰, 胡梅, 刘艳明, 祝建华     
山东省食品药品检验研究院, 山东 济南 250101
收稿日期：2018-03-20
基金项目：山东省财政厅发展类项目（SDFDAFZLS201801）
通讯联系人：刘艳明, E-mail:msymliu@163.com; 祝建华, E-mail:zhujianhua9@sina.com
摘要：探讨了国家标准GB 5009.168-2016中乙酰氯-甲醇甲酯化法、酸水解酯化法和碱水解酯化法3种前处理手段处理婴幼儿配方奶粉中4种多不饱和脂肪酸（二十二碳六烯酸、花生四烯酸、亚油酸和α-亚麻酸）含量的差异性。乙酰氯-甲醇甲酯化法和酸水解酯化法明显优于碱水解酯化法。乙酰氯-甲醇甲酯化法中，样品的水解和脂肪的甲酯化同时进行并相互促进，使得脂肪的释放和甲酯化能够完全进行。通过对反应过程和添加回收率两个方面的考察，证明了乙酰氯-甲醇甲酯化法检测结果的准确性。酸、碱水解酯化法是分别利用酸、碱对样品进行水解，然后提取脂肪进行甲酯化。从水解效率、提取效率及甲酯化效率3个方面对酸、碱水解酯化法进行对比，结果表明，水解效率是影响酸、碱水解差异性的主要因素，酸水解法更适用于婴幼儿配方奶粉中不饱和脂肪酸的测定。通过对实际样品的检测，进一步验证了乙酰氯-甲醇甲酯化法和酸水解酯化法测定多不饱和脂肪酸的准确性，同时对其他食品中脂肪酸的测定具有较强的指导意义。
关键词：乙酰氯-甲醇甲酯化法    酸水解酯化法    碱水解酯化法    差异性    多不饱和脂肪酸    婴幼儿配方奶粉    
Differences of three pretreatment methods for the detection of docosahexaenoic acid, eicosatetraenoic acid, linoleic acid and α-linolenic acid in infant formula milk powder
LI Jie, JU Xiang, WANG Yanli, TIAN Qiyan, SHEN Zhonglan, HU Mei, LIU Yanming, ZHU Jianhua     
Shandong Institute for Food and Drug Control, Jinan 250101, China
Foundation item: Development Program of the Shandong Provincial Finance Department (No. SDFDAFZLS201801)
Abstract: The differences of three pretreatment methods (acetyl chloro carbinol esterification, acid hydrolysis esterification and alkali hydrolysis esterification) for the detection of four polyunsaturated fatty acids (docosahexaenoic acid, arachidonic acid, linoleic acid and α -linolenic acid) in infant formula milk powder were discussed. Acetyl chloro carbinol esterification and acid hydrolysis esterification were found to be significantly better than alkali hydrolysis esterification. The sample digestion and fat methyl esterification were carried out simultaneously in the acetyl chloro carbinol esterification method, where the two processes seemed to enhance each other. This allowed the complete release and methyl esterification of the fats. The accuracy of the methods was determined by investigating the reaction processes and recovery rates. Acid and alkali hydrolysis esterification methods were employed to hydrolyze the samples using a hydrochloric acid solution and an ammonia solution, respectively. Then, the fats were extracted for subsequent methyl esterification. These two methods were compared in terms of the digestion efficiency, extraction efficiency, and methylation efficiency. The results showed that the digestion efficiency is the main factor determining the differences between the acid and alkali hydrolysis methods. The accuracies of acetyl chloro carbinol esterification and acid hydrolysis esterification methods were further verified in the detection of samples, providing a basis for the determination of fatty acids in other foods.
Key words: acetyl chloro carbinol esterification     acid hydrolysis esterification     alkali hydrolysis esterification     differences     polyunsaturated fatty acid     infant formula milk powder    

脂肪酸(fatty acid)是具有长烃链的羧酸, 根据碳氢链饱和程度可以分为饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)3大类。人体能自身合成所需的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸, 但是含有2个或2个以上双键的多不饱和脂肪酸则只能从植物中获得, 故后者称为必需脂肪酸。多不饱和脂肪酸具有良好的生理功能, 其中二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(ARA)对于人体的组织器官发育具有重要作用, 尤其是对大脑和神经系统的发育有着不可替代的作用; 亚油酸(C18:2n6c)和α-亚麻酸(C18:3n3)可以降低血中的胆固醇, 调节心脏功能, 改善血液微循环, 增强人体防御系统等[1-4]。亚油酸和α-亚麻酸在酶的催化作用下可转化为DHA和ARA, 从而被人体吸收[5]。在婴幼儿配方奶粉中, 多不饱和脂肪酸是重要的营养成分, 以甘油酯的形式存在, 由一分子甘油和三分子脂肪酸组成。甘油酯的结构式见图 1, R端是含有多个双键的碳氢链。卫生部发布的标准[6, 7]规定婴幼儿配方奶粉中DHA、ARA、亚油酸和α-亚麻酸的添加量有非常严格的要求, 因此准确测定婴幼儿配方奶粉中的脂肪酸含量十分必要。

图 1 甘油酯的结构式 Fig. 1 Structural formula of glyceride

由于DHA、ARA、亚油酸和α-亚麻酸的高度不饱和性, 对空气中的光照、氧气、金属离子等比较敏感[8-10], 容易发生氧化、分解等, 使其失去原有的营养价值。随着食品工业的发展, 奶粉生产厂家利用微胶囊技术, 将DHA、ARA等多不饱和脂肪酸包埋, 形成微米级或纳米级微胶囊[4, 11-13], 以提高其稳定性。包埋技术的应用使得脂肪酸在微胶囊中不容易游离出来, 尤其是含量较低的DHA和ARA, 不能准确测定。因此随着包埋技术的不断发展, 对检测技术的要求也越来越高。测定婴幼儿配方奶粉中DHA、ARA、亚油酸和α-亚麻酸含量的常用方法有气相色谱法; 常用的前处理方法有酸水解酯化法[14, 15]、碱水解酯化法[16-18]和乙酰氯-甲醇甲酯化法[1, 19]。3种前处理手段的差异性和反应机理的研究也鲜有报道。本文研究了乙酰氯-甲醇甲酯化法、酸水解酯化法、碱水解酯化法3种前处理方法在测定婴幼儿配方奶粉中脂肪酸含量的差异性, 通过研究反应过程, 建立了准确测定婴幼儿配方奶粉中脂肪酸含量的气相色谱法, 尤其对于DHA、ARA等包埋的多不饱和脂肪酸, 定量更加准确可信。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

7890B气相色谱仪、SepulcoSPTM-2560毛细管柱(100 m×0.25 mm×0.25 μm)(美国安捷伦公司); BT125D、TE214S电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司); RV10旋转蒸发仪(德国IKA公司); 20 mL带螺纹盖水解管(美国CNW公司); 电热恒温水浴锅(广东环凯微生物科技有限公司)。

甲醇、甲苯、正庚烷(色谱纯, 天津市科密欧化学试剂有限公司); 15%(体积分数)三氟化硼甲醇溶液(美国CNW公司); 焦性没食子酸、乙酰氯、乙醚和石油醚均购自国药集团化学试剂有限公司。

DHA甘油三酯、ARA甘油三酯、亚油酸甘油三酯、α-亚麻酸甘油三酯标准品(纯度≥99%, 上海安谱实验科技股份有限公司)。婴幼儿配方奶粉标准参考物质(美国NIST公司)。

1.2 标准溶液的配制

分别称取1000 mg亚油酸甘油三酯、α-亚麻酸甘油三酯、DHA甘油三酯、ARA甘油三酯标准品, 用甲苯定容至10 mL, 配制成质量浓度为100 g/L的混合标准溶液。

1.3 样品前处理
1.3.1 乙酰氯-甲醇甲酯化法

样品处理过程参照标准方法[20]第二法进行操作。准确称取婴幼儿配方奶粉试样0.5 g(精确到0.1 mg), 置于15 mL干燥螺口玻璃管中, 加入5.0 mL甲苯和6.0 mL含10%(v/v)乙酰氯的甲醇溶液, 振荡混合, 于(80±1) ℃水浴中衍生化2 h, 然后冷却至室温。将反应后的样液转移至50 mL离心管中, 分别用3 mL碳酸钠溶液清洗玻璃管3次, 合并碳酸钠溶液, 置于50 mL离心管中, 混匀, 以5000 r/min离心5 min, 移取上清液, 进样分析。

1.3.2 提取脂肪酯化法

参照标准方法[20]第一法的酸水解法和碱水解法进行脂肪的提取及甲酯化。准确称取乳粉试样0.5 g(精确到0.1 mg), 置于150 mL三角瓶中, 加入约100 mg焦性没食子酸, 然后加入10 mL盐酸溶液(酸水解酯化法)或5 mL氨水(碱水解酯化法), 于70~80 ℃水浴中水解40~50 min, 然后冷却至室温, 用乙醚-石油醚重复提取水解液3次, 合并有机相至旋蒸瓶中, 旋转蒸发浓缩至干, 残留物为脂肪提取物。在脂肪提取物中加入含0.16 g氢氧化钠的甲醇溶液8 mL, 于(80±1) ℃水浴中回流, 直至油滴消失。从回流冷凝器上端加入7 mL三氟化硼甲醇溶液继续回流2 min, 然后取出旋蒸瓶, 冷却至室温。准确加入10 mL正庚烷, 振摇2 min, 再加入饱和氯化钠水溶液, 静置分层, 移取上层溶液, 进样分析。

1.4 色谱条件

毛细管柱:SepulcoSPTM-2560毛细管柱(100 m×0.25 mm×0.25 μm); 进样口温度:240 ℃; 分流比:50:1;柱流量:1 mL/min。升温程序:初始温度70 ℃, 保持2 min; 以15 ℃/min升温至150 ℃, 保持15 min; 以2 ℃/min升温至220 ℃, 保持10 min; 以20 ℃/min升温至240 ℃, 保持10 min。进样体积:1 μL; 检测器:FID; 检测器温度:250 ℃; 氢气流量:30 mL/min; 空气流量:300 mL/min; 尾吹流量:30 mL/min。

2 结果与讨论
2.1 脂肪酸的检测过程

脂肪酸并不是以游离态存在于婴幼儿配方奶粉中, 而是以脂肪的形式被蛋白质和碳水化合物等包裹形成脂肪球, 如果要测定脂肪酸的含量, 需要破坏微胶囊壁材, 将包埋的脂肪释放出来, 然后用有机溶剂提取, 再进行甲酯化, 最后进行气相色谱检测, 具体过程见图 2。

图 2 不同前处理方法的过程示意图 Fig. 2 Process diagrams of the three pretreatment methods M1: acetyl chlorocarbinol esterification; M2: acid hydrolysis esterification; M3: alkali hydrolysis esterification.

如图 2所示, M1过程为乙酰氯-甲醇甲酯化法的过程示意图, 由于整个反应是在密闭环境下进行, 微胶囊壁的破坏和油脂的甲酯化是同时进行的, 因此影响测定结果的主要因素是微胶囊壁的破坏率(水解效率)和甲酯化效率。M2和M3过程分别为酸水解酯化法和碱水解酯化法的过程示意图, 可以看出, 水解效率、油脂的提取效率及甲酯化效率是影响酸、碱水解酯化法的3个要素。

2.2 乙酰氯-甲醇甲酯化法过程研究

乙酰氯-甲醇溶液可以释放盐酸, 促进酯化反应的进行[21, 22];强酸在非水溶液中具有很强的破坏性, 可以溶解非脂成分(蛋白质、磷脂和碳水化合物等)使得微胶囊壁材被破坏, 从而游离出脂肪。反应是在密闭环境中进行的, 脂肪的水解与甲酯化是同时进行的, 即由一分子甘油与三分子脂肪酸组成的羧酸酯与甲醇进行酯交换[23], 酯交换反应是可逆反应, 因此将生成的甘油消耗掉可以促进反应的进行。乙酰氯-甲醇体系中的乙酰氯是较强的亲核试剂, 与甘油发生加成消除反应[23], 不仅消耗了甘油促进酯交换的进行, 同时生成的盐酸可进一步破坏微胶囊壁材, 使反应相互循环促进。因此乙酰氯-甲醇甲酯化法可使脂肪反应更彻底, 测定结果也更准确。

在乙酰氯-甲醇甲酯化的体系中分别添加20、200和1000 mg/100 g 3个水平的DHA甘油三酯、ARA甘油三酯、亚油酸甘油三酯、α-亚麻酸甘油三酯, 4种脂肪酸在3个不同加标水平下的回收率均在95%~102%范围内, 进一步验证了乙酰氯-甲醇甲酯化法的准确性。

2.3 酸、碱水解酯化法过程研究
2.3.1 水解效率的考察

微胶囊的外壳成分通常为大分子化合物, 如乳糖、β-环糊精、酪蛋白、乳清蛋白等[4, 11-13], 这些化合物在强酸条件下比在碱性条件下水解程度高, 而β-环糊精在碱性条件下稳定存在, 不会产生水解, 脂肪酸也不会游离出来。因此酸碱环境对微胶囊壁的破坏程度有很大影响, 脂肪的释放效率也不同, 即水解效率有所差异。

实验考察了酸、碱水解酯化法测定婴幼儿配方奶粉中DHA、ARA、α-亚麻酸、亚油酸4种不饱和脂肪酸时的水解效率(见图 3)。结果表明, 碱水解酯化的水解效率约为酸水解酯化的80%。因此水解效率是影响酸、碱水解酯化法差异性的重要因素, 酸水解酯化法使包埋的脂肪更彻底地释放, 更适合于婴幼儿配方奶粉中脂肪的测定, 此结论与GB 5009.168-2016标准中利用碱水解法对乳粉及液态乳等试样进行水解的描述存在差异。

图 3 酸、碱水解酯化法测定4种不饱和脂肪酸时的水解效率 Fig. 3 Hydrolysis efficiencies of the four unsaturated fatty acids by acid and alkali hydrolysis esterification methods DHA: docosahexaenoic acid; ARA: eicosatetraenoic acid; C18:3n3: α-linolenic acid; C18:2n6c: linoleic acid.
2.3.2 甲酯化效率的考察

在空白油脂中分别加入20、200、1000 mg/100 g 3个水平的DHA、ARA、α-亚麻酸、亚油酸的甘油三酯混合标准溶液, 按1.3.2节描述进行甲酯化, 考察甲酯化效率对测定结果的影响, 结果见表 1。可以看出, 4种脂肪酸在3个加标水平下甲酯化效率为92.3%~96.9%。由此可知, 油脂的甲酯化效率较高, 因此甲酯化效率并不是影响测定结果的主要因素。

表 1 4种脂肪酸的甲酯化效率 Table 1 Methylation efficiencies of the four fatty acids
2.3.3 提取效率的考察

在酸、碱水解液中分别加入20、200、1000 mg/100 g 3个水平的DHA、ARA、α-亚麻酸、亚油酸的甘油三酯混合标准溶液, 用乙醚石油醚对溶液进行脂肪提取, 提取效率见表 2。

表 2 4种脂肪酸的提取效率 Table 2 Extraction efficiencies of the four fatty acids

从表 2可以看出, 4种脂肪酸在酸、碱水解液中的提取回收率分别为98.1%~99.2%和98.3%~99.3%, 并没有显著差异, 且提取效率较高, 因此提取步骤并不是影响酸、碱水解差异性的关键因素, 进一步说明了水解效率是酸碱水解结果差异性的根本影响因素。

2.4 实际样品的检测

对同一婴幼儿配方乳粉标准参考物质(已知各脂肪酸含量)分别采用乙酰氯-甲醇甲酯化法、酸水解酯化法、碱水解酯化法进行前处理, 在相同的色谱条件下测定, 获得的色谱图见图 4。对4种脂肪酸进行定量分析与比较, 结果见表 3。

图 4 实际样品采用不同前处理方法后4种脂肪酸的色谱图 Fig. 4 Chromatograms of the four fatty acids in real samples by different pretreatment methods

表 3 不同前处理方法测定婴幼儿乳粉中4种脂肪酸的含量 Table 3 Contents of the four fatty acids in infant milk powder with the different pretreatments

从表 3可以看出, 乙酰氯-甲醇甲酯化法测得的4种脂肪酸的含量最高; 乙酰氯-甲醇甲酯化法与酸水解酯化法测定的结果均在标准值范围内, 而碱水解酯化法测定的结果低于标准值, 尤其对于含量较低的DHA, 不能满足检测要求。此结果进一步验证了乙酰氯-甲醇甲酯化法和酸水解酯化法在测定婴幼儿乳粉中不饱和脂肪酸含量的准确性, 相较于碱水解酯化法，更适用于婴幼儿乳粉中多不饱和脂肪酸的检测。

3 结论

本文研究了国家标准[20]中酸水解酯化法、碱水解酯化法、乙酰氯-甲醇甲酯化法3种前处理方法在处理婴幼儿配方奶粉中不饱和脂肪酸时的差异性。通过分析实验过程, 得出乙酰氯甲醇甲酯化法和酸水解酯化法更适用于婴幼儿配方奶粉中多不饱和脂肪酸的检测, 此结论与标准方法中利用碱水解法对乳粉及液体乳等试样进行水解的描述存在差异。基于奶粉中饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸及反式脂肪酸等与多不饱和脂肪酸结构与性质的相似性, 本研究的实验方法也可用于其他脂肪酸的检测, 同时也对其他基质食品中脂肪酸的测定具有较强的指导意义。

参考文献
[1] Peng F J, Yang W H. Food Science, 2011, 32(14): 261.
彭飞进, 杨卫花. 食品科学, 2011, 32(14): 261.
[2] Du F F, Li J P, Zheng X H, et al. Food Science, 2015, 36(11): 245.
杜芳芳, 李建平, 郑晓辉, 等. 食品科学, 2015, 36(11): 245. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201511046
[3] Sun X Y, Gao G T, Duan A L, et al. Science and Technology of Food Industry, 2012, 33(7): 418.
孙翔宇, 高贵田, 段爱莉, 等. 食品工业科技, 2012, 33(7): 418.
[4] Dai Y, Dai Z Y, Zhang Y C, et al. Farm Products Processing, 2017(9): 44.
戴逸, 戴智勇, 张岩春, 等. 农产品加工, 2017(9): 44.
[5] He P. Science and Technology of Food Industry, 2004, 25(1): 126.
何平. 食品工业科技, 2004, 25(1): 126.
[6] GB 10765-2010
[7] GB 10767-2010
[8] Duan X X, Zhang Y C, Dai Z Y, et al. China Dairy Industry, 2011, 39(12): 27.
段潇潇, 张岩春, 戴智勇, 等. 中国乳品工业, 2011, 39(12): 27. doi: 10.3969/j.issn.1001-2230.2011.12.007
[9] Shen L, Tang J, Zhang Y X, et al. China Oils and Fats, 2016, 41(4): 14.
沈雷, 唐俊, 张云霞, 等. 中国油脂, 2016, 41(4): 14.
[10] Zhang P, Cao S F, Dai Z Y, et al. China Dairy Industry, 2016, 44(5): 9.
张鹏, 曹素芳, 戴智勇, 等. 中国乳品工业, 2016, 44(5): 9.
[11] Li X D, Jiang C. Journal of Dairy Science and Technology, 2013, 36(2): 34.
李晓东, 蒋琛. 乳业科学与技术, 2013, 36(2): 34.
[12] Hu S M, Jiang D M, Liu B H, et al. China Dairy Industry, 2017, 45(3): 9.
胡姝敏, 姜冬梅, 刘宝华, 等. 中国乳品工业, 2017, 45(3): 9.
[13] Zhang J Y, Du B, Xie L H, et al. Journal of Food Safety and Quality, 2013, 4(5): 1342.
张嘉怡, 杜冰, 谢蓝华, 等. 食品安全质量检测学报, 2013, 4(5): 1342.
[14] Chen Y S, Jin Q, He W. Guangdong Chemical Industry, 2016, 43(7): 189.
陈银珊, 靳权, 何维. 广东化工, 2016, 43(7): 189.
[15] Shao S P, Xiang D P, Li S, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(11): 1214.
邵仕萍, 相大鹏, 李双, 等. 色谱, 2015, 33(11): 1214.
[16] Wu W D, Jin S M, Zhu H. China Food Additives, 2015(1): 106.
吴伟都, 金世梅, 朱慧. 中国食品添加剂, 2015(1): 106.
[17] Lin Y Z, Chen S Y. Food Research and Development, 2012, 33(2): 143.
林玉宙, 陈士勇. 食品研究与开发, 2012, 33(2): 143.
[18] Hu F Y. Modern Food, 2017(12): 90.
胡凤杨. 现代食品, 2017(12): 90.
[19] Liu X Q. China Dairy Industry, 2016, 44(8): 52.
刘秀清. 中国乳品工业, 2016, 44(8): 52.
[20] GB 5009. 168-2016
[21] Ecker J, Scherer M, Schmitz G, et al. J Chromatogr B, 2012, 897(4): 98.
[22] Liu W Y, Jia W, Wu T, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(11): 1113.
刘文媛, 贾伟, 吴婷, 等. 色谱, 2016, 34(11): 1113.
[23] Smith M B. March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure. 5th ed. Li Y M, transl. Beijing: Chemical Industry Press, 2009 Smith M B.
高等有机化学: 反应、机理与结构. 5版. 李艳梅, 译. 北京: 化学工业出版社, 2009