苯丙胺类兴奋剂(amphetamine-type stimulants, ATSs)属人工合成兴奋剂, 对中枢和交感神经可产生强烈兴奋或致幻作用, 长期滥用会导致使用者敏感、精神异常、偏执、攻击性强甚至暴力^{[1, 2]}。自20世纪80年代以来, ATSs的滥用趋势逐年上升, 已成为我国乃至全世界滥用最广的毒品之一。在滥用ATSs案件的侦破中, 通常需要对嫌疑人尿样中的ATSs进行准确测定。此外, 在诸多苯丙胺类兴奋剂中, 苯丙胺(AM)、甲基苯丙胺(MA)、苯丁胺(PTM)、3, 4-亚甲二氧基苯丙胺(MDA)、3, 4-亚甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA)和3, 4-亚甲二氧基乙基苯丙胺(MDEA)是滥用最为广泛的毒品或毒品代谢物。因此建立快速、简便且能准确测定尿中常见ATSs的方法具有重要意义。

目前, 已报道的对尿中ATSs测定的前处理方法有液-液萃取法^[3-5]、液相微萃取法^[6-13]、固相萃取法^[14-17]和固相微萃取法^[18-20]等。以液-液萃取法为代表的传统样品前处理技术具有耗时耗力、步骤繁琐、需要使用大量有机溶剂等缺点, 分析效率低且对环境和操作人员健康有一定危害^[21];固相微萃取技术集采样、萃取、富集和进样于一体, 具有无溶剂、操作简便、易于自动化等优点^[22], 但市售固相微萃取探头价格昂贵, 种类有限, 因此需要制备对目标化合物具有选择吸附性能的特殊涂层材料^[23]。单滴微萃取技术(single drop microextraction, SDME)具有有机溶剂使用量小、操作简单、成本低等优点, 是一种较为理想的样品前处理方法。但在SDME操作过程中, 除要求萃取溶剂与水不互溶、对目标化合物有很好的萃取能力外, 还要求萃取溶剂单滴在样品溶液中具有良好的稳定性^[24]。在前期研究^[25]中发现, 尿样中三氯甲烷液滴的黏度会随时间的增长而降低, 导致萃取完成后整个液滴无法被完全抽回微量注射器, 因而会造成灵敏度、精密度和准确度的降低。目前最简单的解决方法是缩短萃取时间。但传统SDME是目标化合物从水相向有机相被动扩散的过程, 并且由于液滴受外界扰动时会从针尖偏移或脱落, 从而无法使用搅拌和超声等加速促进手段, 因此单纯缩短萃取时间会降低方法的灵敏度。

本文利用ATSs在正常生物样品中以阳离子形式存在的特点, 向萃取体系中引入了电场。在电场力作用下, ATSs阳离子被迫向处在阴极附近的溶剂单滴快速迁移, 从而大大提高了单滴的萃取效率。结合气相色谱技术(GC), 建立了一种具有简便、快速、灵敏、准确等优点的电场促进下的单滴微萃取-气相色谱(EE-SDME-GC)同时测定6种常见苯丙胺类化合物的分析方法, 并且利用该方法对实际尿样中的ATSs进行了测定。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

6890A气相色谱仪(配氢火焰离子化检测器(FID))、HP-5毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm×0.50 μm)(美国Agilent公司); RS-1603DN型可调开关稳压电源(东莞市龙威电子科技有限公司); Milli-Q Element纯水机(美国Millipore公司)。

AM、MA、PTM、MDA、MDMA、MDEA(1 g/L, 溶于甲醇)和4-PBA(纯度为99%)均购自美国Sigma-Aldrich公司; 二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯、乙酸乙酯、正己烷、环己烷和氢氧化钠均购自天津利安隆博华医药化学有限公司; 氯化钠购自汕头市西陇化工厂有限公司; 盐酸购自北京化工厂。

收集无吸毒史实验室人员的尿样作为空白, 取冰毒滥用嫌疑人员的尿样作为实际样品。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

移取1 g/L的6种苯丙胺类兴奋剂标准溶液1 mL, 用甲醇定容至10 mL, 配制成100 mg/L的标准储备液。准确称取4-PBA标准品20 mg, 用甲醇定容至10 mL, 配制成2000 mg/L的内标标准溶液; 准确移取内标标准溶液1.0 mL, 用甲醇定容至10 mL, 配制成200 mg/L的内标储备液。以上溶液均于4 ℃冰箱保存备用。

准确吸取适量标准储备液(100 mg/L), 用去离子水逐级稀释, 配制成质量浓度分别为20(MDA除外)、50、100、500和1000μg/L的系列标准溶液, 同时加入内标储备液, 使内标质量浓度均为200 μg/L, 内标法定量。

1.2.2 EE-SDME

将待测尿样用等体积去离子水进行稀释, 再将其pH调至7。准确吸取该尿样5.0 mL, 置于10 mL色谱瓶中, 将铂丝和吸取了2 μL二氯甲烷的微量注射器针头通过橡胶塞插入待测样品溶液中, 然后将铂丝和微量注射器金属针头分别与稳压电源的正极和负极相连(萃取装置见图 1), 推出萃取溶剂, 在注射器针尖形成单滴, 打开稳压电源, 调节电压至-2.5 V, 萃取3 min, 待萃取完成后, 断开电源, 将整个液滴抽回微量注射器, 并立即插入GC进样口, 完成进样。

图 1

Fig. 1

图 1 电场促进下的单滴微萃取装置 Fig. 1 Apparatus of electro-enhanced single drop microextraction (EE-SDME)

1.2.3 色谱条件

色谱柱:HP-5毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm); 进样口温度:280 ℃, 不分流进样; 载气:氮气; 流速:1 mL/min; 尾吹气流速:25 mL/min。程序升温条件:初始温度70 ℃, 保持2 min, 然后以30 ℃/min的速率升至160 ℃, 再以2 ℃/min的速率升至175 ℃, 最后以30 ℃/min的速率升至280 ℃, 保持2.5 min。检测器温度:300 ℃。

1.3 统计学处理

采用SPSS 16.0软件进行统计分析; 对实际尿样测定结果的比较采用秩和检验, P＜0.05表示有统计学差异。

2 结果与讨论

2.1 萃取条件的优化

2.1.1 萃取溶剂的选择

在单滴微萃取过程中, 有机溶剂起着至关重要的作用。有机溶剂的性质决定了其萃取效率和单滴在萃取过程中的稳定性, 从而进一步影响所建方法的选择性、灵敏度和准确度等重要参数。本文考察了二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯、乙酸乙酯、正己烷和环己烷6种有机溶剂对AM、MA、PTM、MDA、MDMA、MDEA和内标4-PBA的萃取效率。结果表明, 采用二氯甲烷时萃取效率最高, 其次是三氯甲烷, 其余有机溶剂对目标化合物的萃取效果均不理想。可能原因主要有:(1)虽然目标化合物具有良好的水溶性, 但其分子结构中的亲油性基团(苯环和烃基)使其在二氯甲烷中也具有一定的溶解性; (2)由于电场的存在, 迫使大量带正电的目标化合物向作为阴极的微量注射器金属针管周围迁移, 从而大大促进了目标化合物从水相向有机相的扩散, 继而提高了二氯甲烷对目标化合物的萃取效率。因此, 本研究选取二氯甲烷作为萃取溶剂。

2.1.2 单滴体积的选择

在萃取过程中单滴体积不仅决定了对目标化合物的萃取量, 而且还通过影响单滴所受重力与浮力的大小来影响单滴在萃取过程中的稳定性, 进而对方法灵敏度、精密度、准确度等参数产生显著影响。本文探讨了不同单滴体积(0.5、1.0、2.0、3.0 μL)对萃取效率的影响(见图 2)。结果发现, 随单滴体积的增加, 萃取效率不断提高, 但当体积超过2 μL时, 单滴在萃取过程中易从微量注射器针尖脱落。为确保单滴在萃取过程中具有良好的稳定性, 本研究选择单滴体积为2 μL。

图 2

Fig. 2

图 2 单滴体积对6种苯丙胺类兴奋剂萃取效率的影响(n=3) Fig. 2 Effect of single drop volume on the extraction efficiencies of the six amphetamine-type stimulants (ATSs) (n=3) AM: amphetamine; MA: methamphetamine; MDA: 3, 4-methylenedioxyamphetamine; MDMA: 3, 4-methylenedioxymethamphetamine; MDEA: 3, 4-methylenedioxy-N-ethylamphetamine; PTM: phentermine; 4-PBA: 4-phenyl-butylamine.

2.1.3 萃取时间的选择

萃取时间也是影响萃取效率的重要参数。为确保所建方法的实用性, 本研究首先考察了二氯甲烷单滴在尿样中的稳定时间。结果发现, 当萃取时间超过3 min时, 将整个溶剂单滴抽回微量注射器的过程中会有部分二氯甲烷从单滴掉落至样品溶液中, 易造成方法精密度和准确度的严重下降。可能的原因是溶剂微滴萃取了样品中的某些组分, 导致其黏度降低。为避免该问题的发生, 本研究在3 min内考察了萃取时间对萃取效率的影响, 结果发现, 在考察时间内, 萃取效率随萃取时间的增加而增大。因此本研究选定萃取时间为3 min。

2.1.4 样品溶液pH值的影响

由于ATSs分子中含有带孤对电子的氮原子, 在中性或弱酸性条件下, 样品溶液中的质子会与ATSs分子中的氮原子结合形成阳离子, 而在强碱性条件下, ATSs则主要以分子形式存在。本研究用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH对样品溶液的pH值进行调控, 考察了样品溶液pH值对萃取效率的影响, 结果见图 3。可以看出, 当样品溶液pH值为7时, 萃取效率最佳, 在酸性(pH 2)或碱性(pH 12)条件下萃取效率均不理想。在酸性条件下, 样品溶液中的大量质子会与ATSs阳离子产生竞争迁移, 从而降低萃取溶剂对目标化合物的萃取效率; 在碱性条件下, 目标化合物主要以分子形式存在, 降低了所受的电场力, 进而大大降低萃取溶剂单滴的萃取效率。因此本研究将样品溶液的pH值设为7。

图 3

Fig. 3

图 3 样品溶液pH对6种苯丙胺类兴奋剂萃取效率的影响(n=3) Fig. 3 Effect of pH value of sample solution on the extraction efficiencies of the six ATSs (n=3)

2.1.5 电压的影响

电压值会影响目标化合物阳离子在萃取过程中所受的电场驱动力, 从而进一步影响有机溶剂单滴对目标化合物的萃取效率。本文考察了不同电压(0、-0.5、-1.0、-1.5、-2.0、-2.5和-3.0 V)对萃取效率的影响, 结果见图 4。可以看出, 向萃取体系引入电场会明显提高萃取效率, 并且萃取效率随电压的增大而提高。但当电压达到-3 V时, 浸入样品溶液中的金属针头表面会产生气泡从而降低有机溶剂单滴在针尖处的附着力, 最终导致其脱落。因此, 本研究选取-2.5 V作为最佳萃取电压。

图 4

Fig. 4

图 4 电压对6种苯丙胺类兴奋剂萃取效率的影响(n=3) Fig. 4 Effect of voltage on the extraction efficiencies of the six ATSs (n=3)

2.2 方法学验证

2.2.1 线性范围和检出限

对6种ATSs的系列标准溶液进行分析, 得到6种ATSs的线性回归方程、相关系数(r)、线性范围和检出限(见表 1)。可以看出, 6种目标化合物在20~1000 μg/L范围内线性关系良好, 相关系数(r)为0.989~0.997。以信噪比(S/N)为3时的含量计算方法的检出限, 为3.2~7.6 μg/L。说明所建方法具有较宽的线性范围和较高的灵敏度。

表 1 (Table 1)

表 1 6种ATSs的线性范围、回归方程、相关系数和检出限 Table 1 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r), and limits of detection (LODs) of the six ATSs Analyte Linear range/(μg/L) Regression equation r LOD/(μg/L) AM 20-1000 y=0.48x+0.04 0.992 3.2 MA 20-1000 y=0.83x+0.07 0.996 4.2 PTM 20-1000 y=0.67x+0.06 0.989 3.8 MDA 50-1000 y=0.10x+0.08 0.997 7.6 MDMA 20-1000 y=0.24x+0.06 0.992 5.7 MDEA 20-1000 y=0.37x+0.07 0.993 4.5 y: peak area ratio of the target analyte to the internal standard; x: mass concentration ratio of the target analyte to the internal standard.

表 1 6种ATSs的线性范围、回归方程、相关系数和检出限 Table 1 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r), and limits of detection (LODs) of the six ATSs

2.2.2 富集因子、准确度与精密度

富集因子(enrichment factor, EF)为萃取前后目标化合物浓度之比, 实验测得AM、MA、MDA、MDMA、MDEA、PTM和4-PBA的富集因子分别为83、73、62、95、134、72和88。空白尿样中添加不同水平的ATSs, 利用所建方法进行萃取, 内标法定量, 计算6种目标化合物的加标回收率和相对标准偏差, 结果见表 2。可以看出, 在不同的添加水平下, 6种目标化合物的平均回收率为91.6%~111.2%, 精密度为2.9%~6.2%(n=3), 说明所建方法具有良好的准确度和重复性。

表 2 (Table 2)

表 2 6种苯丙胺类兴奋剂的加标回收率和精密度(n=3) Table 2 Spiked recoveries and precisions of the six ATSs (n=3) Analyte Spiked/(μg/L) Found/(μg/L) Recovery/% RSD/% AM 50 46.9 93.8 3.8 100 92.4 92.4 5.6 500 484.7 96.9 2.9 MA 50 48.1 96.2 3.7 100 97.6 97.6 4.3 500 513.5 102.7 6.2 PTM 50 53.2 106.4 3.9 100 106.7 106.7 4.6 500 523.3 104.7 5.3 MDA 50 47.8 95.6 3.8 100 111.2 111.2 4.5 500 467.5 94.5 3.7 MDMA 50 53.8 107.6 5.3 100 93.1 93.1 5.7 500 513.4 102.7 4.2 MDEA 50 45.8 91.6 3.9 100 104.2 104.2 4.2 500 510.4 102.1 5.3

表 2 6种苯丙胺类兴奋剂的加标回收率和精密度(n=3) Table 2 Spiked recoveries and precisions of the six ATSs (n=3)

2.3 实际尿样的测定

应用本方法对3份冰毒滥用嫌疑人员的尿样进行测定。结果表明, 尿样1、2、3中仅检测出AM和MA, 含量分别为0.12、0.37、1.95 mg/L和1.36、0.84、2.63 mg/L(见表 3), 其余目标物均未检出。典型尿样的色谱图见图 5。

表 3 (Table 3)

表 3 本方法与标准方法的比较 Table 3 Comparison of this method with the standard method Sample AM MA EE-SDME LLE[26] EE-SDME LLE[26] Content/(mg/L) RSD(n=3)/% Content/(mg/L) RSD(n=3)/% Content/(mg/L) RSD(n=3)/% Content/(mg/L) RSD(n=3)/% Urine 1 0.12 5.3 0.16 7.1 1.36 4.6 1.43 3.5 Urine 2 0.37 4.7 0.32 8.9 0.84 4.3 0.89 5.3 Urine 3 1.05 2.8 0.92 5.7 2.63 5.7 2.29 9.2 LLE: liquid-liquid extraction.

表 3 本方法与标准方法的比较 Table 3 Comparison of this method with the standard method

图 5

Fig. 5

图 5 实际尿样的色谱图 Fig. 5 Chromatogram of a real urine sample

采用标准方法(LLE)^[26]对3份尿样进行测定, 通过秩和检验将测定结果与本文所建方法的测定结果进行统计学分析。结果表明, 两种分析方法对实际尿样中的AM和MA的测定结果无显著性差异(P＞0.05), 说明本方法具较好的实用性, 可用来测定尿样中的苯丙胺类兴奋剂。

3 结论

本文建立了EE-SDME-GC测定尿样中6种苯丙胺类兴奋剂的分析方法。该法具有快速简便、灵敏度高、重复性好、线性范围宽、对环境友好等特点。通过向单滴微萃取体系引入电场, 促进了萃取溶剂微滴在温和条件下对苯丙胺类化合物的萃取效率, 确保了溶剂微滴在萃取过程中的稳定性, 使所建方法的实用性得以进一步提升。

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