三聚氰胺(MEL)是一种三嗪类含氮杂环有机化合物, 主要用于生产甲醛清洁剂、三聚氰胺甲醛树脂等, 在皮革、塑料、纺织、造纸、涂料等行业有广泛应用。中国国家食品质量监督检验中心曾明确指出三聚氰胺属于化工原料, 不允许添加到食品中。但因其含氮量高(66.6%), 曾多次被人为添加到食品和饲料中, 以增加食品中蛋白质的含量。2007年年初, 美国发生了多起猫、狗宠物因食用含三聚氰胺的宠物食品而中毒死亡的事件; 2008年9月, 中国发生奶制品污染事件, 多个品牌的婴幼儿奶粉检出三聚氰胺。这也引起了国内外对三聚氰胺及其同系物含量检测技术的重视。

牛奶的组成成分复杂, 要从牛奶中检测低浓度的三聚氰胺十分困难。目前检测牛奶中三聚氰胺的方法主要有液相色谱法^[1]、气相色谱-质谱法^[2]、液相色谱-质谱法^[3]、电化学检测法^[4]、毛细管电泳-质谱法^[5]和拉曼光谱法^[6]等，但预处理过程耗时长是这些方法共有的缺陷。为了加快检测过程, 有必要开发能够快速分离, 且具有高选择性、高吸附容量和低检出限的新方法。

磁分离技术能够简便而快速的分离磁性纳米粒子, 分子印迹技术能够对目标化合物进行特异性识别, 将二者结合, 可以同时实现对目标化合物的选择性吸附与快速分离^[7]。陈朗星等^[8]制备了核壳结构的萘夫西林磁性表面分子印迹聚合物(MMIPs), 该MMIPs对模板分子具有很高的吸附容量, 特异性识别性能良好。传统三聚氰胺分子印迹聚合物(MIPs)采用沉淀聚合法或本体聚合法制备^{[9, 10]}。采用这些方法制备的MIPs选择性高, 但是吸附容量低, 模板分子不易洗脱^{[11, 12]}, 而表面分子印迹技术有效地克服了这两类制备方法的缺陷^[13]。佟育奎等^[14]在Fe₃O₄磁性纳米粒子表面制备了氟喹诺酮类抗生素分子印迹层, 该MMIPs可应用于环境水样中氟喹诺酮类抗生素的残留检测。Wang等^[15]用制备的磁性纳米材料检测牛奶中的三聚氰胺, 效果理想, 但不足之处是仍需离心和溶剂萃取, 尚未完全开发材料的磁性能。Chen等^[16]和Wang等^[12]合成的磁性分子印迹聚合物可以直接添加到样品中, 不需要额外的过滤和离心, 简化了前处理过程。张丽丽等^[17]制备了三聚氰胺分子印迹表面等离子体共振传感器, 是三聚氰胺检测的一大进步。但是, 目前尚未见以Fe₃O₄@SiO₂为载体，采用MMIPs从牛奶中一步提取和分离三聚氰胺的相关报道。

本文以Fe₃O₄@SiO₂磁性材料为载体、三聚氰胺为模板分子, 选择α -甲基丙烯酸(MAA)作为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)作为交联剂，制备了MEL-MMIPs, 并将MEL-MMIPs用于富集和分离牛奶中的三聚氰胺。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

LC-20AT高效液相色谱仪、FTIR-8400S傅里叶变换红外光谱仪(日本Shimadzu公司); TU-1810紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司); JEM-2100透射电子显微镜(日本JEM公司); VSM-7404振动样品磁强计(美国Lakeshore公司); SETSYS-1750 CS Evol热重分析仪(TGA, 法国塞塔拉姆仪器公司)。

γ -(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS, 纯度98%)、正硅酸乙酯(TEOS, 纯度99.99%)、盐酸羟胺(纯度98.5%)、吡啶(纯度99.5%)购于阿拉丁试剂(上海)有限公司; 三聚氰胺(纯度99.9%)、三聚氰酸(CYA, 纯度99%)、灭蝇胺(CYR, 纯度99%)、α -甲基丙烯酸(纯度98%)、2, 2-偶氮二异丁腈(AIBN, 纯度99%)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(纯度98%)购于上海晶纯生化科技股份有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 实验条件

1.2.1 磁性Fe₃O₄纳米材料的制备

在烧瓶中加入含0.05 mol/L FeCl₃的乙醇-水(1 : 1, v/v)溶液60 mL, 于50 ℃水浴加热, 以100 r/min的速率机械搅拌, 然后加入0.051 1 g盐酸羟胺, 反应5 min后, 滴加30%(质量分数)浓氨水至pH＞9, 再滴加1 mL油酸, 继续反应10 min, 然后将温度升至70 ℃反应30 min。反应结束后, 将烧瓶置于室温下, 待磁性颗粒自由沉降后, 移去上清液, 然后加入100 mL热的无水乙醇, 洗涤磁性颗粒, 重复洗涤3次, 将洗涤过的磁性颗粒置于60 ℃真空干燥箱中干燥12 h, 备用。

1.2.2 磁性Fe₃O₄@SiO₂材料的制备

称取0.2 g磁性Fe₃O₄纳米材料置于烧瓶中, 加入200 mL乙醇-水(6 : 1, v/v)溶液, 超声分散均匀, 加入2 mL 30%(质量分数)浓氨水, 在100 r/min的速率下机械搅拌, 缓慢滴加1 mL正硅酸乙酯, 然后将烧瓶密封, 反应20 h。反应完毕后将产物磁性分离, 用超纯水洗涤至中性, 干燥备用。

1.2.3 Fe₃O₄@SiO₂@MPS的制备

称取1.0 g Fe₃O₄@SiO₂置于烧瓶中, 量取乙醇-水(1 : 1, v/v)混合溶液100 mL, 超声分散均匀后, 于室温下以100 r/min的速率进行机械搅拌, 加入1.3 mL MPS, 再加入3~4滴吡啶, 升温至50 ℃, 搅拌反应24 h。反应完毕后产物用乙醇洗涤3次, 然后用无水乙醇索氏提取24 h。

1.2.4 MEL-MMIPs和MEL-非印迹聚合物(MNIPs)的制备

称取0.126 g三聚氰胺置于烧瓶内, 量取30 mL乙醇-水(4 : 1, v/v)溶液, 超声溶解, 然后加入0.34 mL MAA, 于室温下以100 r/min的速率机械搅拌6 h, 静置过夜。然后加入1.0 g Fe₃O₄@SiO₂@MPS磁性材料、3.8 mL EGDMA和40 mg AIBN, 通入氮气除氧30 min, 密封，然后于60 ℃反应24 h。将反应产物进行磁分离, 然后用甲醇洗涤数次后真空干燥, 再用甲醇-冰乙酸(4 : 6, v/v)索氏提取24 h, 最后用甲醇洗去表面的乙酸, 即得到MEL-MMIPs，其制备过程见图 1。MEL-MNIPs的制备过程除不加模板分子外, 其余步骤与制备MEL-MMIPs时相同。

图 1

Fig. 1

图 1 三聚氰胺磁性表面分子印迹聚合物的制备过程 Fig. 1 Preparation process of melamine magnetic surface molecularly imprinted polymers (MEL-MMIPs) TEOS: tetraethyl orthosilicate; MPS: 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate; MAA: methacrylic acid; EGDMA: ethyleneglycol dimethacrylate; AIBN: 2, 2′-azobis(2-methylpropionitrile).

1.2.5 样品前处理

量取10 mL牛奶样品, 加入20 mL乙腈, 然后加入适量三聚氰胺标准溶液(使样品溶液中三聚氰胺的含量为300 μ g/L)，超声分散均匀, 以10 000 r/min离心10 min, 得到牛奶上清液, 备用。

称取20.0 mg MEL-MMIPs, 置于25 mL容量瓶中, 加入牛奶上清液定容。将溶液转移至锥形瓶中, 置于摇床上振荡吸附, 之后用磁铁分离出MEL-MMIPs, 经甲醇-乙酸(9 : 1, v/v)溶液洗脱后, 再次用磁铁分离出MEL-MMIPs, 洗脱液利用旋转蒸发仪蒸干。然后加入1 mL乙腈再次溶解, 经0.22 μ m尼龙滤膜过滤, 待测。

1.2.6 色谱条件

色谱柱:Luna HILIC柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m, 美国Phenomenex公司); 流动相:乙腈-10 mmol/L乙酸铵(9 : 1, v/v); 进样量:20 μ L; 检测波长:210 nm。

1.3 等温吸附量的测定

分别准确称取一定质量的MEL-MMIPs和MEL-MNIPs, 置于50 mL锥形瓶中, 加入含20~120 mg/L三聚氰胺的乙醇-水(1 : 1, v/v)溶液各10 mL, 于室温下振荡吸附24 h, 以5 000 r/min离心5 min, 过0.22 μ m尼龙滤膜后测定其吸光度, 并按公式(1)计算吸附量:

(1)

其中, Q是吸附量(mg/g), C₀是MEL的初始浓度(mg/L), C_e是MEL吸附平衡时的浓度(mg/L), V是溶液体积(L), m是MEL-MMIPs或者MEL-MNIPs的质量(g)。

1.4 吸附动力学的测定

称取6份0.020 g MEL-MMIPs置于锥形瓶中，分别加入10 mL含50 mg/L三聚氰胺的乙醇-水(4 : 1, v/v)溶液, 于25 ℃恒温振荡, 每隔10 min取出一组样品, 以5 000 r/min离心5 min, 过0.22 μ m尼龙滤膜, 测定三聚氰胺的浓度。采用同样方法对MEL-MNIPs进行处理。采用公式(1)计算MEL-MMIPs和MEL-MNIPs对MEL的吸附量。

1.5 吸附选择性的测定

分别配制MEL、CYA和CYR的乙醇-水(1 : 1, v/v)溶液, 使其质量浓度均为90 mg/L。分别准确称取3份0.020 g MEL-MMIPs, 共3组, 加入上述含MEL、CYA和CYR的乙醇-水溶液10 mL, 恒温振荡24 h, 然后测其吸光度, 按公式(1)计算吸附量。按照相同方法测定MEL-MNIPs。

2 结果与讨论

2.1 三聚氰胺与甲基丙烯酸的复合作用

将MEL与MAA按不同物质的量之比(1 : 0、1 : 0.5、1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7和1 : 8)溶于乙醇-水(1 : 1, v/v)溶液中, MEL的浓度均为0.2 mmol/L, 对其进行紫外光谱分析(见图 2)。可以看出, 随着MAA浓度的增加, 溶液的吸光度逐渐增加, 但是增加量逐渐减小, 而且溶液的吸收波长有红移现象, 说明随着MAA浓度的增加, MEL与MAA之间作用力逐渐增强, 但是当MEL与MAA物质的量之比超过1 : 4时, 相互作用力的增加幅度变小, 这也说明1 : 4是MEL与MAA的最佳配比。

图 2

Fig. 2

图 2 不同物质的量之比的MEL和MAA的紫外光谱图 Fig. 2 Ultraviolet spectra of different molar ratio of MAA to MEL

为进一步证明三聚氰胺与甲基丙烯酸间存在较强的复合作用，形成了稳定的复合物。配制含0.1 mmol/L三聚氰胺、0.4 mmol/L甲基丙烯酸和三聚氰胺与甲基丙烯酸物质的量之比为1 : 4的乙醇-水(4 : 1, v/v)溶液, 于25 ℃下振荡30 min, 静置12 h, 然后对其进行紫外光谱分析(见图 3)。可以看出, MEL与MAA混合溶液的吸收波长有红移现象, 且MEL与MAA混合溶液的吸光度值明显低于MEL和MAA吸光度值的加和。理论上, 如果MEL与MAA之间没有相互作用, 那么在所有波长下混合溶液的吸光度值是二者在同等条件下单独存在时吸光度值之和; 相互作用越强, 则吸光度值差别越大。因此, 测定结果说明MEL与MAA之间产生了明显的相互作用, 形成了比较稳定的复合物。

图 3

Fig. 3

图 3 三聚氰胺与甲基丙烯酸在乙醇-水溶液中的紫外光谱图 Fig. 3 UV spectra of melamine and methacrylic acid in ethanol aqueous solution

2.2 透射电镜表征

用透射电镜(TEM)对磁性Fe₃O₄纳米粒子(见图 4a)和MEL-MMIPs(见图 4b)的形貌进行表征。可以看出, 磁性Fe₃O₄纳米粒子的分散性良好, 粒径约为20 nm; MEL-MMIPs的粒径明显增大, 表明印迹层成功包覆在Fe₃O₄纳米粒子表面, 证实了制备的MEL-MMIPs具有核壳结构。

图 4

Fig. 4

图 4 (a) Fe3O4纳米粒子和(b)MEL-MMIPs的透射电镜图 Fig. 4 Transmission electron microscope (TEM) images of (a) Fe3O4 nanoparticles and (b) MEL-MMIPs

2.3 红外光谱分析

Fe₃O₄@SiO₂、Fe₃O₄@SiO₂-MPS和MEL-MMIPs的红外光谱图见图 5。其中, 图 5a和5b中的469.7 cm^-1和576.3 cm^-1处是Fe-O键弯曲和伸缩振动的特征吸收峰, 说明Fe₃O₄@SiO₂和Fe₃O₄@SiO₂-MPS具有相同的内核, 而MEL-MMIPs由于聚合物层的存在使得Fe-O键特征吸收峰不明显。图 5a中的792.3 cm^-1是Si-O键的伸缩振动峰; 948.4 cm^-1是Si-O-H键的伸缩振动峰; 1 081.1 cm^-1是Si-O-Si键不对称伸缩振动强吸收峰, 说明Fe₃O₄纳米粒子表面成功包覆了一层SiO₂。图 5b中1 715.9 cm^-1是MPS中的C=O伸缩振动峰, 说明MPS成功接枝到Fe₃O₄@SiO₂表面。图 5c中1 739.4 cm^-1是O-C=O酯基吸收峰, 说明EGDMA成功键合到磁性材料表面；2 988.3 cm^-1处是羧基的吸收峰, 说明MAA成功键合到磁性材料表面。

图 5

Fig. 5

图 5 (a) Fe3O4@SiO2、(b)Fe3O4@SiO2-MPS和(c)MEL- MMIPs的红外光谱图 Fig. 5 FT-IR spectra of (a) Fe3O4@SiO2, (b) Fe3O4@ SiO2-MPS, and (c) MEL-MMIPs

2.4 热重分析

Fe₃O₄、Fe₃O₄@SiO₂、Fe₃O₄@SiO₂-MPS和MEL-MMIPs磁性微球的热重曲线图见图 6。Fe₃O₄和Fe₃O₄@SiO₂的失重率仅为8%, Fe₃O₄@SiO₂-MPS的失重率仅为13%, 说明Fe₃O₄、Fe₃O₄@SiO₂和Fe₃O₄@SiO₂-MPS均具有良好的热稳定性。在400~800 ℃之间, Fe₃O₄@SiO₂-MPS的失重率高于Fe₃O₄@SiO₂, 说明Fe₃O₄@SiO₂表面成功接枝了MPS。由于印迹层的分解, 在250~450 ℃之间, MEL-MMIPs的失重很快, 失重率高达80.4%。

图 6

Fig. 6

图 6 Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2-MPS和MEL-MMIPs的热重曲线 Fig. 6 Thermogravimetric analysis (TGA) curves of Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2-MPS and MEL-MMIPs

2.5 振动磁强计分析

油酸改性Fe₃O₄纳米粒子、Fe₃O₄@SiO₂、Fe₃O₄@SiO₂-MPS、MEL-MMIPs的磁滞回线和在外界磁场作用下MEL-MMIPs的磁分离现场图片见图 7。可以看出, 油酸改性Fe₃O₄纳米粒子、Fe₃O₄@SiO₂、Fe₃O₄@SiO₂-MPS和MEL-MMIPs的饱和磁化强度分别为60.67、27.10、21.76和4.10 emu/g。随着表面聚合物厚度的增加, Fe₃O₄纳米粒子、Fe₃O₄@SiO₂、Fe₃O₄@SiO₂-MPS和MEL-MMIPs的饱和磁化强度依次降低。MEL-MMIPs的饱和磁化强度最小。如图 7所示, 没有磁场时, MEL-MMIPs磁性微球稳定、均匀地分散在乙醇溶液中; 外加磁场后, 磁性微球被快速、完全吸附到容器内壁上。

图 7

Fig. 7

图 7 Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2-MPS和MEL- MMIPs的磁滞回线和磁分离现象照片 Fig. 7 Hysteresis loops of Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@ SiO2-MPS and MEL-MMIPs and magnetic separation photo of MEL-MMIPs

2.6 等温吸附量的考察

对MEL-MMIPs和MEL-MNIPs进行等温吸附试验, 结果如图 8所示, 可以看出, MEL-MMIPs和MEL-MNIPs对MEL的吸附量有明显差别, 饱和吸附量分别为8.74和3.48 mg/g, 优于文献^[18]报道的数据, 表明MEL-MMIPs对三聚氰胺具有良好的吸附性能。

图 8

Fig. 8

图 8 不同三聚氰胺质量浓度下(a)印迹聚合物和(b)非印迹聚合物对三聚氰胺的吸附量 Fig. 8 Adsorption of (a) imprinted polymers and (b) non-imprinted polymers with different mass concentrations of MEL

通过Scatchard模型对等温吸附的结果进行分析, Scatchard方程为:

(2)

式中Q_max和K_d分别是MEL-MMIPs最大表观吸附量(mg/g)和平衡离解常数(mg/L)。

结果得到两条拟合直线, 高亲和力直线方程是:Q/C_e=-0.002 72Q+0.209 08, 低亲和力直线方程是:Q/C_e=-0.620 06×10^-5Q+0.198 83。表明MEL-MMIPs对模板分子有两种不同性质的结合位点。这种情况通常会在非共价印迹法的吸附过程中出现, 其中专一性吸附是由高亲和位点决定的。

2.7 吸附动力学考察

按1.4节描述对MEL-MMIPs和MEL-MNIPs进行吸附动力学分析, 其结果见图 9。由图 9可知, 吸附在40 min时达到饱和, MEL-MMIPs具有较高的吸附速率, 其吸附量也远高于MEL-MNIPs。

图 9

Fig. 9

图 9 印迹聚合物和非印迹聚合物的吸附动力学曲线 Fig. 9 Adsorption kinetic curves of imprinted polymers and non-imprinted polymers

2.8 吸附选择性的考察

按1.5节描述测定MEL-MMIPs和MEL-MNIPs对MEL的吸附选择性。结果表明, MEL-MMIPs对MEL、CYA和CYR的吸附量分别是8.79、2.63和1.13 mg/g, MEL-MNIPs对MEL、CYA和CYR的吸附量分别是3.47、3.6和1.6 mg/g。MEL-MMIPs对MEL的吸附量远高于对CYA和CYR的吸附量, 同时也高于MEL-MNIPs对三者的吸附量, 表明MEL-MMIPs对三聚氰胺具有较好的特异识别性。

2.9 检出限和回收率

对三聚氰胺样品进行加标回收试验，加标水平分别为200、300和500 μ g/L, 每个水平做3个平行样品。结果表明，三聚氰胺的加标回收率为85.6% ~104.2%, RSD≤8.3%(n=3)(见表 1)。

表 1 (Table 1)

表 1 牛奶样品中MEL的加标回收率和相对标准偏差(n=3) Table 1 Spiked recoveries and RSDs of MEL in milk samples (n=3) Added/(μg/L) Imprint Non-imprint Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% 200 85.6 2.8 72.6 3.7 300 92.1 3.2 81.7 3.3 500 104.2 8.3 96.3 9.3

表 1 牛奶样品中MEL的加标回收率和相对标准偏差(n=3) Table 1 Spiked recoveries and RSDs of MEL in milk samples (n=3)

配制系列浓度的三聚氰胺标准溶液，按1.2.6节进行分析，以3倍信噪比(S/N)对应的含量计算方法的检出限，为15 μ g/L。

2.10 实际样品分析

实际牛奶样品经印迹聚合物和非印迹聚合物萃取后的色谱图见图 10。可以看出, MEL-MMIPs对三聚氰胺的分离富集效果比MEL-MNIPs明显要好, 表明MEL-MMIPs可以用来富集分离牛奶中的三聚氰胺。

图 10

Fig. 10

图 10 实际牛奶样品的色谱图 Fig. 10 Chromatograms of the real milk samples a. the blank milk sample extracted by MEL-MMIPs; b. the spiked milk sample (300 μ g/L MEL) extracted by MEL-MMIPs; c. the spiked milk sample (300 μ g/L MEL) extracted by MEL-MNIPs.

3 结论

本研究成功地在Fe₃O₄纳米粒子表面制备了MEL-MMIPs, 该MEL-MMIPs具有良好的磁学性能和较高的吸附速率。与传统检测方法相比, 本方法操作简便, 溶剂消耗少, 成本低, 检测速度快。所制备的MEL-MMIPs有望作为三聚氰胺检测的新材料, 对于加快三聚氰胺的检测速度、提高检测的灵敏度与选择性和保障食品安全具有重要意义。

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