色谱  2018, Vol. 36 Issue (9): 858-865   PDF    
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董青
李敏
杨亦文
鲍宗必
杨启炜
张治国
任其龙
模拟移动床色谱分离二十碳五烯酸乙酯和二十二碳六烯酸乙酯
董青, 李敏, 杨亦文, 鲍宗必, 杨启炜, 张治国, 任其龙     
浙江大学化学工程与生物工程学院, 生物质化工教育部重点实验室, 浙江 杭州 310027
收稿日期：2018-04-17
基金项目：国家自然科学基金面上项目（21776240）；国家自然科学基金重点项目（21436010）；浙江省重点科技创新团队计划（2011R50002）
通讯联系人：任其龙, Tel:(0571)87952773, E-mail:renql@zju.edu.cn
摘要：二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸是两种非常重要的ω-3多不饱和脂肪酸，广泛用于膳食补充剂和药品，同时它们的生理作用并不完全相同，因此分离制备它们的高纯度单体十分必要。首先以聚苯乙烯/二乙烯基苯（PS/DVB）聚合物为固定相，在液相色谱上分离二十碳五烯酸乙酯（EPA-EE）和二十二碳六烯酸乙酯（DHA-EE），考察了流动相、填料粒径、温度对分离的影响。然后采用粒径20 μm、孔径10 nm的PS/DVB填料装填了8根150 mm×10 mm的半制备色谱柱，测定了半制备柱装填的均一性。最后尝试在模拟移动床（SMB）色谱上分离EPA-EE和DHA-EE的混合物，探究了Ⅱ区和Ⅲ区的流量、进料流量、进料浓度对分离的影响，结果表明SMB制备的EPA-EE和DHA-EE的相对纯度分别为91.6%和93.6%，回收率分别为97.0%和91.6%，固定相生产率为5.97 g/（L·h），溶剂消耗为1.52 L/g。SMB制备EPA-EE和DHA-EE具有较大的应用潜力。
关键词：液相色谱    模拟移动床色谱    二十碳五烯酸乙酯    二十二碳六烯酸乙酯    分离    
Separation of eicosapentaenoic acid ethyl ester and docosahexaenoic acid ethyl ester by simulated moving bed chromatography
DONG Qing, LI Min, YANG Yiwen, BAO Zongbi, YANG Qiwei, ZHANG Zhiguo, REN Qilong     
Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education, College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 21776240); National Natural Science Foundation of China (No. 21436010); Program for Zhejiang Province Leading Team of S & T Innovation Key (No. 2011R50002)
Abstract: Eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) are important ω -3 polyunsaturated fatty acids. Their physiological effects on humans are not exactly the same; therefore, the production of products with high-purity EPA or DHA monomers is significant. In this work, EPA ethyl ester (EPA-EE) and DHA ethyl ester (DHA-EE) were first separated using HPLC with poly(styrene-co-divinylbenzene) (PS/DVB) as the stationary phase. The effects of the mobile phase, PS/DVB particle diameter, and column temperature were systematically evaluated. The results showed that methanol is a suitable mobile phase, having a resolution of 2.75. By comparing resolutions, a PS/DVB particle diameter of 10 μm was chosen; however, when the pressure drop of PS/DVB is considered, PS/DVB with a particle diameter of 20 μm is more favorable for large-scale preparations. A column temperature of 40℃ was found to be the most feasible for maintaining efficient separation. Second, eight semi-preparative columns (150 mm×10 mm) of PS/DVB polymer were prepared for the simulated moving bed (SMB) chromatography; the homogeneity of these columns was perfect, with a relative total column porosity error of less than 1%. Finally, an EPA-EE and DHA-EE mixture was separated using the SMB chromatography, and the contents of the extract and the raffinate were determined using GC-FID. The effects of the flow rate of Zone Ⅱ and Zone Ⅲ, the flow rate of the feed, and the feed concentration were investigated. Under optimal conditions, EPA-EE and DHA-EE with favorable purities of 91.6% and 93.6%, respectively, were achievable. The recovery of the EPA-EE was 97.0% and the recovery of the DHA-EE was 91.6%. The productivity and solvent requirements were 5.97 g/(L·h) and 1.52 L/g, respectively. Therefore, SMB chromatography is an attractive technology for the production of high-value products.
Key words: liquid chromatography (LC)     simulated moving bed (SMB) chromatography     eicosapentaenoic acid ethyl ester (EPA-EE)     docosahexaenoic acid ethyl ester (DHA-EE)     separation    

ω-3多不饱和脂肪酸是人体自身不能合成的必需脂肪酸[1], 对人类健康的重要性自20世纪80年代就被大量报道。特别是源于深海鱼油中的二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA), 它们是ω-3多不饱和脂肪酸中的重要成员, 结构式如图 1所示。大量流行病学和随机试验表明, 它们在治疗心脑血管疾病[2, 3]、炎症[4]、癌症[5-7]、抑郁症[8]、阿尔茨海默病[9]和促进婴儿生长发育[10]等方面有着一定的功效。目前市场上已经有许多鱼油膳食补充剂, 还有治疗高甘油三酯血症(人体内甘油三酯水平大于或等于500 mg/dL)的ω-3鱼油处方药, 如Lovaza[11](二十碳五烯酸乙酯(EPA-EE)含量46%、二十二碳六烯酸乙酯(DHA-EE)含量38%)、Vascepa[12](EPA-EE含量96%)、Epanova[13](EPA、DHA)。同时有许多研究[14, 15]表明EPA和DHA的生理功能并不完全相同, 因此需根据不同用途将两者分离, 但是EPA和DHA结构相似、容易发生氧化等变性反应, 分离难度大。目前有低温结晶法[16]、尿素包合法[17]、分子蒸馏法[18, 19]、银离子络合法[20]、超临界萃取法[21, 22]、脂肪酶法[23]等可从鱼油中富集EPA和DHA, 但是这些方法很难将EPA与DHA分开; EPA与DHA的分离主要用色谱法[24-26], 分离时EPA和DHA多以甲酯或者乙酯的形式存在。

图 1 EPA和DHA的结构式 Fig. 1 Chemical structures of EPA and DHA

20世纪60年代发展起来的模拟移动床(simulated moving bed, SMB)色谱技术, 是连续化的制备色谱技术[27]。SMB分离具有产品纯度和回收率高、固定相利用率高、溶剂消耗小、可自动控制等优点, 特别适合难分离两组分体系的规模化制备[28]。SMB技术在分离EPA与DHA方面也有一些报道。宋磊等[29]以二次分子蒸馏得到的较高纯度的鱼油乙酯为原料, 以C18柱为固定相, 甲醇/水(95:5, v/v)为流动相, 运用六区串联SMB工艺实现了EPA-EE、DHA-EE和杂质的3组分分离。Li等[30]在SMB上配置了8根C18柱, 以甲醇洗脱EPA-EE和DHA-EE混合物, 提取液中DHA-EE和提余液中EPA-EE的相对纯度达到99%。

本文在前人的基础上以PS/DVB聚合物为固定相, 甲醇为洗脱剂, 采用四区模拟移动床分离EPA-EE和DHA-EE; 并对Ⅱ区和Ⅲ区流量、进料流量和进料浓度对分离的影响进行了探究, 为工业化生产EPA-EE和DHA-EE单体提供实验探究基础。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

高效液相色谱仪(美国Waters公司); CSEP® C9116模拟移动床(德国KNAUER公司); GC-2010 plus气相色谱仪(日本Shimadzu公司); Beckman Coulter LS13320粒度分布仪(美国库尔特公司); SU-8010场发射扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)。

EPA-EE(纯度99%)、DHA-EE(纯度95%)、高纯度EPA-EE与DHA-EE混合物(纯度≥95%, 质量比1:1)(苏州仁普药业有限公司); PS/DVB聚合物填料(苏州纳微科技有限公司); 十七酸甲酯(纯度＞97%, 日本TCI公司); 甲醇(分析纯, 国药集团化学试剂有限公司); 甲醇(色谱纯, 美国Tedia公司), 乙醇(色谱纯, 德国Merck公司), 乙腈(色谱纯, 美国Tedia公司)。

1.2 实验方法
1.2.1 填料的表征

实验中所用到的PS/DVB聚合物填料, 用粒度测试仪测定粒径分布, 用扫描电子显微镜观察球形度和粒径分布。

1.2.2 液相色谱脉冲进样实验和评价参数

液相色谱脉冲进样实验有两个部分, 其一是为SMB分离选择合适的洗脱剂、填料粒径和操作温度, 其二是测试8根半制备色谱柱(150 mm×10 mm, 20 μm)装填的均一程度。

EPA-EE和DHA-EE混合物溶于甲醇中, 配制成1.0 g/L的溶液, 在PS/DVB聚合物色谱分析柱(150 mm×4.6 mm)上进样并用甲醇洗脱; 流动相流速1.0 mL/min, 进样量10 μL, 检测波长210 nm, 用分离度RS来评价EPA-EE和DHA-EE分离的程度, 从而确定较优的选择:

(1)

式中, tR, 1和tR, 2是两组分的保留时间(min), w1和w2是两组分的峰宽(min)。

尿嘧啶溶于甲醇, 配制成0.1 g/L溶液, 用于测定半制备色谱柱的总孔隙率εt。液相色谱操作条件为:流动相为甲醇; 进样量10 μL; 柱温40 ℃; 检测波长254 nm。在0.5 ~2.5 mL/min的流速下测定尿嘧啶在8根半制备色谱柱上的保留时间, 扣除仪器死时间后得到柱死时间t0, 根据公式(2)做出回归直线, 回归直线斜率的数值就是色谱柱总孔隙率εt:

(2)

式中, t0是色谱柱柱死时间(min), L是柱长(cm), u是表观流速(cm/min)。

1.2.3 模拟移动床实验和评价参数

在德国KNAUER公司CSEP® C9116四区SMB上分离EPA-EE和DHA-EE混合物, 操作步骤如下:(1)准确称取一定量EPA-EE和DHA-EE混合物溶解于甲醇中, 配成一定浓度的溶液, 用0.45 μm的有机滤膜过滤后备用, 准备足够量洗脱剂备用; (2)将8根柱子(150 mm×10 mm)装在SMB系统内, 设置好切换时间10 min、温度40 ℃，以及4个泵的流量, 温度达到设定值后开始实验; (3)待SMB系统达到平衡时取样, 分别在提取液口和提余液口接一次完整切换时间的产品, 分析产品组成。

在气相色谱上采用内标法测定SMB两出口产品的组成, 内标物为十七酸甲酯。气相色谱分析条件为:Agilent J & W HP-5非极性柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm); 进样口温度250 ℃; 柱温220 ℃; 氢火焰检测器(FID)温度280 ℃; 进样量1 μL; 分流比1:20。

SMB分离效果用纯度、回收率、固定相生产率、溶剂消耗4个参数评价。

纯度(%)为两出口中目标组分的浓度与两组分浓度和之比, 是相对纯度:

(3a)
(3b)

回收率(%)为目标组分的含量与原料液中该组分的比值:

(4a)
(4b)

固相相生产率(g/(L·h))为在单位时间内单位体积的固定相所能生产的两目标产品的质量:

(5)

溶剂消耗(L/g)为生产单位质量的产品需消耗的溶剂体积:

(6)

上述式中A代表强吸附组分, B代表弱吸附组分。CEx, A、CRa, B分别是提取液和提余液中相应组分的质量浓度(g/L), QEx、QRa、QD、QF分别对应提取液出口流量、提余液出口流量、洗脱剂流量、原料进料流量(mL/min), Vcol是单根半制备色谱柱的体积(mL)。

2 结果与讨论
2.1 聚合物色谱填料表征结果

填料粒径均一、球形度良好在分析实验和实际生产中都十分重要[31], 单分散的球形填料可以减小压降, 便于放大后用于实际生产。图 2的粒径分布图表明, 20 μm的粒径呈现窄正态分布, 测得的平均粒径为19.19 μm; 图 3的扫描电镜图表明, PS/DVB聚合物的球形度好, 粒径分布均一。因此本实验选择的PS/DVB聚合物色谱填料具有工业放大的良好前景。

图 2 粒径20 μm的PS/DVB聚合物粒径分布图 Fig. 2 Particle diameter distribution of poly(styrene-co-divinylbenzene) (PS/DVB) (particle diameter 20 μm)

图 3 粒径20 μm的PS/DVB聚合物扫描电镜图 Fig. 3 Scanning electron microscopy (SEM) images of PS/DVB polymer (particle diameter 20 μm)
2.2 流动相的选择

在色谱分离中, 固定相填料对样品的分离具有重要影响, 合适的流动相对改善分离效果有重要的辅助作用[32]。实际工业中确定流动相时, 不仅需要考虑分离度, 还要考虑成本、柱压力降限制以及后续产品纯化的难易程度, 因而低黏度、低沸点的纯溶剂是最佳的选择。

本实验选择了3种反相色谱常用的不同极性溶剂:甲醇、乙醇以及乙腈; 探讨这3种溶剂对EPA-EE和DHA-EE在PS/DVB色谱柱(150 mm×4.6 mm, 10 μm)上分离的影响, 并与实验室常用的C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)进行对比。图 4为洗脱的流出曲线, EPA-EE和DHA-EE的出峰顺序由EPA-EE和DHA-EE纯品的保留时间确定, 4个谱图中先流出的是弱保留组分EPA-EE, 后流出的是强保留组分DHA-EE。

图 4 不同流动相洗脱EPA-EE和DHA-EE的流出曲线 Fig. 4 Chromatograms of eicosapentaenoic acid ethyl ester(EPA-EE) and docosahexaenoic acid ethyl ester (DHA-EE) with different mobile phases Chromatographic column: (a, c, d) PS/DVB (150 mm×4.6 mm, 10 μm), (b) C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm); column temperature: 40 ℃; flow rate: 1.0 mL/min; injection volume: 10 μL; feed mass concentration: 1.0 g/L.

根据结果可知, 3种流动相在PS/DVB柱上的洗脱强度依次为:乙腈＞乙醇＞甲醇；分离度依次为:甲醇＞乙醇＞乙腈。乙腈不能实现EPA-EE和DHA-EE的基线分离, 而乙醇和甲醇均可以实现基线分离。乙醇为流动相时, EPA-EE和DHA-EE的分离度为1.83。甲醇在PS/DVB柱上的分离度达到2.75;而同样条件下, 实验室常用的C18柱上的分离度仅为1.39。考虑到甲醇较乙醇便宜, 且甲醇的黏度小, 可以减小压降, 沸点低更容易实现与产品分离, 后续实验均采用纯甲醇为流动相。

2.3 粒径的选择

固定相填料的粒径对分离影响很大。分别选取了粒径为10、15、20、30、40 μm, 孔径均为10 nm的PS/DVB聚合物装填在150 mm×4.6 mm柱子里, 在温度为40 ℃、甲醇为流动相、流速1.0 mL/min、上样质量浓度1.0 g/L、上样体积10 μL的条件下比较了粒径对EPA-EE和DHA-EE分离的影响。EPA-EE和DHA-EE在不同粒径色谱柱上的色谱图如图 5所示, 这5种粒径的填料都能分离EPA-EE和DHA-EE的混合物。随着固定相粒径的增大, 出峰时间提前, 峰宽变宽, 分离度减小。粒径10 μm分离效果最好, 分离度可达2.75。粒径为15 μm时分离度为2.24, 粒径20 μm时分离度为1.86, 均能达到基线分离。粒径30 μm和40 μm则不能实现基线分离。因此, 根据分离度, 粒径10 μm是最佳的选择。

图 5 在不同粒径PS/DVB柱分离EPA-EE和DHA-EE的色谱图 Fig. 5 Chromatograms of EPA-EE and DHA-EE on PS/DVB columns with different particles diameters Chromatographic column: PS/DVB (150 mm×4.6 mm); mobile phase: methanol; column temperature: 40 ℃; flow rate: 1.0 mL/min; injection volume: 10 μL; feed mass concentration: 1.0 g/L.

在实际工业生产时, 除了考虑分离度, 柱压降也是一个重要的参数。在液相色谱上测定了不同粒径的PS/DVB填料的柱压降, 柱规格为150 mm×4.6 mm, 流动相为甲醇, 柱温40 ℃。如图 6所示, 粒径10 μm的压降最大; 当粒径增大到20 μm时, 压降与30 μm时的已十分接近。同时考虑到分离度的影响, 在工业生产中可采用粒径为20 μm的填料, 在实验室分析中可采用粒径为10 μm的填料。

图 6 不同粒径PS/DVB的柱压降 Fig. 6 Pressure drop of PS/DVB columns with different particle diameters Chromatographic column: PS/DVB (150 mm×4.6 mm); mobile phase: methanol; column temperature: 40 ℃.
2.4 温度的选择

提高温度可以缩短保留时间, 对于分离度的影响则因分离物质不同而有所差别。在PS/DVB色谱柱(150 mm×4.6 mm, 10 μm)上测定了温度对EPA-EE和DHA-EE分离的影响, 流动相为甲醇, 流速1.0 mL/min, 进样质量浓度1.0 g/L, 进样量10 μL。不同温度下的流出曲线如图 7所示。在20~50 ℃范围内, 随着温度升高, EPA-EE和DHA-EE流出时间缩短, 峰宽变窄, 这说明随着温度增加, 脱附速率加快, 物质在色谱柱上停留时间变短。最重要的是, 随着温度升高, 分离度不断增大, 因此选择较高的操作温度对分离更有利, 考虑到PS/DVB聚合物适宜的操作温度在60 ℃以下, 因此本实验选择40 ℃为较佳的操作温度。

图 7 不同温度下EPA-EE和DHA-EE的流出曲线 Fig. 7 Chromatograms of EPA-EE and DHA-EE at different temperatures Chromatographic column: PS/DVB (150 mm×4.6 mm, 10 μm); mobile phase: methanol; flow rate: 1.0 mL/min; injection volume: 10 μL; feed mass concentration: 1.0 g/L.
2.5 半制备色谱柱均一性的评价

10 μm的PS/DVB色谱填料虽然对EPA-EE和DHA-EE分离度高, 但小粒径的填料压降较大。综合考虑分离度和压降, 确定选用粒径20 μm、孔径10 nm的PS/DVB聚合物装填了8根半制备柱(150 mm×10 mm)。SMB分离系统的稳定运行要求8根色谱柱填装均一、性能相近[33]。按照1.2.2节中方法测定8根PS/DVB聚合物半制备色谱柱的总孔隙率, 平均值为0.698, 相对偏差在1%以内, 这说明色谱柱的装填效果一致, 不会影响SMB色谱系统运行的稳定性。

2.6 模拟移动床分离实验结果

根据上文对流动相种类、粒径和温度的考察结果, 确定以甲醇为洗脱剂, 操作温度40 ℃, 填料粒径20 μm, 在SMB色谱上分离EPA-EE和DHA-EE。3组不同条件的实验结果如表 1所示。A组考察Ⅱ、Ⅲ区流量对分离EPA-EE和DHA-EE的影响, B组考察进料流量对分离的影响, C组考察进料浓度对分离的影响。从液相色谱上保留顺序可知, DHA-EE是强吸附组分, EPA-EE是弱吸附组分。因此在合适的操作参数下, DHA-EE从提取液口流出, EPA-EE从提余液口流出。

表 1 模拟移动床分离EPA-EE和DHA-EE的实验结果 Table 1 Separation results of EPA-EE and DHA-EE by simulated moving bed (SMB) chromatography
2.6.1 Ⅱ、Ⅲ区流量对分离的影响

根据前人的研究[34], 两个相近组分的分离是在SMB的Ⅱ区和Ⅲ区完成的。在Ⅰ区和Ⅳ区流量满足分离条件时, Ⅱ区和Ⅲ区的流量对EPA-EE和DHA-EE的分离有着至关重要的影响。A组实验中保持进料流量不变, 只改变Ⅱ区Q2的流量, Ⅲ区的流量Q3也会增加。当Ⅱ、Ⅲ区流量增加时, 提取液中DHA-EE的相对纯度缓慢增加, 提余液中EPA-EE的相对纯度则先缓慢下降后迅速下降。这是因为当Ⅱ、Ⅲ区流量增大时, EPA-EE和DHA-EE的浓度峰均向提余液口移动, 导致提余液中EPA-EE的纯度从93.8%下降到69.0%, 提取液中DHA-EE的纯度则从83.0%上升到95.9%。因Ⅱ、Ⅲ区流量变化对两出口目标组分的纯度有着相反的影响, 当Ⅱ、Ⅲ区流量增大时, 提取液出口DHA-EE的回收率不断下降, 提余液出口EPA-EE的回收率不断增加。因此存在一组最合适的Ⅱ、Ⅲ区流量, 在此流量下两出口产品纯度均较高、回收率高、固定相生产率大, 同时溶剂消耗小。在本实验流量变化范围内, 综合考虑到产品纯度和回收率, A3为最佳的操作点, 此时固定相生产率最大, 为5.97 g/(L·h); 溶剂消耗最小, 为1.52 L/g。

2.6.2 进料流量对分离的影响

加大进料流量可以提高SMB的处理能力, 但过大的进料量会影响分离效果。在B组的实验中, Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ区流量均保持不变, 进料流量从0.2 mL/min增加到0.5mL/min。加大进料流量, 提取液出口DHA-EE的纯度基本保持不变, 提余液出口EPA-EE的纯度则不断下降, 特别是当进料流速从0.3 mL/min增加到0.4 mL/min时, EPA-EE的纯度从91.6%降到68.1%。这是因为进料流量QF增大, Ⅲ区流量也相应增大, EPA-EE和DHA-EE更多从提余液中流出, 导致提余液中EPA-EE的纯度急剧下降; 而Ⅱ区流量没有改变, 提取液出口中DHA-EE的纯度也就没有太大变化。EPA-EE和DHA-EE的回收率与它们纯度的变化趋势相反。另一方面, 增大进样流量, 固定相生产率不断增加, 溶剂消耗在减小, 但是两者变化的幅度趋于平缓。考虑到纯度和回收率是最主要的考察指标, 因而B2对应的是此条件下的最佳进样量, 为0.3mL/min。

2.6.3 进样浓度对分离的影响

与增加进料流量一样, 提高进样浓度可提高SMB的处理量, C组是不同进料浓度的实验结果。进料浓度增加, 提取液出口DHA-EE的纯度略有上升, 提余液出口EPA-EE的纯度急剧下降; DHA-EE的回收率不断下降, EPA-EE回收率基本不变。随着进料浓度的增加, 分离效果显著变差, 这表明EPA-EE和DHA-EE在PS/DVB聚合物上存在较强的非线性吸附效应。因此在同样的操作条件下, 只改变进样浓度, 对分离的结果影响很大, 但是相应的固定相生产率增大, 溶剂消耗减小。因此进料浓度改变后需相应调整SMB的参数才能保证较佳的分离效果。

3 结论

用PS/DVB聚合物分析色谱柱实现了EPA-EE和DHA-EE的完全分离。通过在分析柱上的优化实验, 确定以粒径20 μm的PS/DVB聚合物为SMB分离的填料, 以甲醇为洗脱剂, 操作温度40 ℃。SMB实验能够成功制备较高纯度的EPA-EE和DHA-EE单体, 通过改变Ⅱ区和Ⅲ区的流量、进样流速、进样质量浓度, 得到了较佳的分离效果。SMB分离EPA-EE和DHA-EE具有较大开发潜力。

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