色谱  2018, Vol. 36 Issue (11): 1088-1098   PDF    
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宋月
张茜宁
张崴
钱永忠
邱静
基于鞘脂组学技术探究布洛芬对斑马鱼脑组织的立体选择性影响
宋月1,2,3, 张茜宁1,2, 张崴1,2, 钱永忠1,2, 邱静1,2     
1. 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所, 北京 100081;
2. 农业部农产品质量安全重点实验室, 北京 100081;
3. 山东莱博生物科技有限公司, 山东 济南 250000
收稿日期：2018-04-17
基金项目：国家自然科学基金项目（21477161）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（Y2017JC46）
通讯联系人：邱静.Tel:(010)82106551, E-mail:qiujing@caas.cn
摘要：以斑马鱼成鱼为研究对象，借助于鞘脂组学技术，探究了一种新型手性环境污染物布洛芬对斑马鱼脑组织中鞘脂含量的影响。建立了超高效液相色谱-三重四极杆-线性离子阱复合质谱检测斑马鱼成鱼脑组织中46种鞘脂的定量方法。借助于该方法对经布洛芬外消旋体及对映体暴露后的斑马鱼脑组织中的46种鞘脂进行了定量分析，通过考察主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）及显著性差异分析（P）筛选出差异代谢物。同时，结合组间差异分析的结果可知，环境水平的布洛芬会导致斑马鱼脑组织中鞘脂代谢发生紊乱，且布洛芬的对映体之间存在立体选择性毒性。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱    布洛芬    对映体    斑马鱼    鞘脂    脂质组学    
Stereoselective effects of ibuprofen on adult zebrafish brain tissues based on sphingolipidomics
SONG Yue1,2,3, ZHANG Xining1,2, ZHANG Wei1,2, QIAN Yongzhong1,2, QIU Jing1,2     
1. Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-Products of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;
2. Key Laboratory of Agri-food Quality and Safety, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China;
3. Shandong LaiBo Biotechnology Co. Ltd., Jinan 250000, China
Abstract: The aim of this study was to investigate the stereoselective effects of a popular pharmaceutical and personal care product component ibuprofen (IBU) on adult zebrafish using sphingolipidomics. Sphingolipidomics is an effective method developed to determine sphingolipids present in biological samples using ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole linear ion trap mass spectrometry. Using this method, 46 sphingolipids in adult zebrafish brain samples were quantified after rac-/R-(-)-/S-(+)-IBU exposure, and the biomarkers were selected using chemometric approaches, including principal component analysis and orthogonal partial least squares discrimination analysis. Besides, combined with the results of the Duncan post hoc test and Dunnett post hoc comparison, sphingolipidomic perturbations were found to be induced after exposure to ibuprofen at environmental concentrations, and enantiomers of ibuprofen had stereoselective effects on zebrafish. This study may provide a new insight on the influence of ibuprofen on aquatic organisms.
Key words: ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS)     ibuprofen     enantiomers     zebrafish     sphingolipid     lipidomics    

布洛芬(IBU)是一种非处方药, 常作为典型的退烧药和止痛药用于疾病治疗, 同时也是一种广泛存在于水环境中的新型环境污染物——药品及个人护理用品(PPCPs)[1]。研究表明, IBU可以引起氧化损伤、免疫功能紊乱和神经损伤等毒性作用[2-4]。IBU属于手性药物, 而且R-(-)-IBU和S-(+)-IBU在环境中都有检出且在性质和毒性方面存在差异[5]。IBU在人体和动物体内并不能完全代谢, 有一部分会通过尿液和粪便排放到水体和土壤中。由于IBU具有脂溶性的特点, 环境中的IBU会通过食物链和食物网在动植物体内累积并传递至人体, 从而影响人体正常代谢, 威胁人类健康。

随着IBU在全世界范围内的大量使用, 其在河流、湖泊、海洋、土壤以及动植物体内的检出率越来越高[6-7]。据报道, 西班牙的图里亚河地表水和污泥中检出IBU质量浓度为0.18~7.20 μg/L, 海水中检出IBU质量浓度为3.90 μg/L, 而在美国和挪威海水中检出质量浓度分别在N. D.~674.00 ng/L和0.10~20.00 μg/L范围内[8-11], 文献[12]甚至在饮用水中也检出了IBU残留。目前IBU已经广泛存在于世界范围内的水环境中, 但对于其外消旋体(rac-IBU)及单体的毒性还尚未明确[13]。目前对于IBU对映体的选择性毒性研究较少, 所以明确环境浓度水平的IBU对映体对水生生物的毒性作用显得尤为重要。

斑马鱼作为实验室常用模式生物, 在评估环境污染物对水生生物的影响时应用较多。有研究报道, IBU不仅可导致斑马鱼出现胚胎发育迟缓、卵孵化率降低、仔鱼体长发生变化[14], 而且会引起斑马鱼自发运动频率和游动距离减少, 游动速度降低[15, 16]。此外, IBU暴露还可导致斑马鱼中cytochrome P4501A、vitellogenin (vtg)基因表达及抗氧化酶活发生变化[17, 18]。

脂质组学技术是针对生物体或细胞中含量较多、成分较为复杂的脂质而发展起来的现代组学技术。从一定意义上来说, 脂质组学技术可视为代谢组学技术的一个分支。Kovacevic等[19]借助于核磁技术开展了IBU外消旋体对大型溞的毒性研究。结果表明, IBU外消旋体暴露会导致大型溞体内丝氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸和亮氨酸发生显著变化, 且具有明显的剂量依赖性。Akhtar等[20]借助于核磁技术开展了大麻素对斑马鱼的毒性研究。结果表明, 大麻素暴露会导致斑马鱼胚胎体内部分氨基酸发生变化, 主要包括谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、牛磺酸、苯丙氨酸、胆碱、肌酸和甘氨酸等。由于脂质组学起步较晚, 所以在毒理学研究中的应用不如代谢组学应用广泛[21]。但脂质分子结构的复杂性和多样性, 赋予了脂质分子许多重要的生理功能。鞘脂是一类广泛存在于中枢神经系统中的脂质, 对于调节细胞膜的流动性具有重要作用。此外, 神经酰胺、鞘氨醇、1-磷酸-神经鞘氨醇等作为信号分子在细胞生长、分化、衰老和死亡中起到重要作用[22]。因此, 借助于鞘脂组学技术进行毒理学研究具有十分重要的现实意义。

为了探究环境中IBU外消旋体及对映体对水生生物的选择性影响, 本研究基于靶向鞘脂组学技术, 以斑马鱼为模式生物, 开展了环境浓度的布洛芬暴露试验。通过脂质组学数据分析, 探究布洛芬手性对映体的毒性差异, 以期明确环境中布洛芬对水生生物的毒性作用机制, 为进一步研究PPCPs提供新思路。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-三重四极杆-线性离子阱复合质谱(ExionLC UHPLC-Qtrap 6500, AB Sciex公司), 高速冷冻离心机(美国ThermoFisher公司), 多功能氮吹仪(TTL-DC型, 北京同泰联科技发展有限公司), 涡旋混匀器(IKA® Vortex Genius 3, 德国IKA集团)。

rac-IBU(纯度98.0%, 中国天津阿尔塔公司), R-(-)-IBU和S-(+)-IBU由本实验室拆分制备得到[23], 46种神经鞘脂标准品(纯度＞99.0%, 美国Avanti Polar Lipids公司)。乙腈和甲醇(质谱级, 德国Merck公司), 正己烷和异丙醇(色谱级, 加拿大Fisher公司), 氯仿(韩国Duksan公司), 甲酸和甲酸铵(质谱级, 美国Sigma-Aldrich公司), 超纯水采用美国Milli-Q超纯水制备系统制备。

1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液的配制

准确称取46种神经鞘脂标准品分别溶解于适量体积的甲醇中(个别鞘脂在甲醇中溶解较小, 加入微量氯仿促进溶解), 配制成500 mg/L或1 000 mg/L的标准母液, 置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 46种鞘脂的色谱分离条件

Agilent Eclipse XDB C18色谱柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm); 柱温为30 ℃; 样品室温度为4 ℃; 流动相A为0.1%甲酸甲醇-水(40:60, v/v), 流动相B为0.1%甲酸甲醇-异丙醇(40:60, v/v), 洗脱梯度如下:0~3.0 min, 0~80%B; 3.0~8.0 min, 80%B~90%B; 8.0~15.0 min, 90%B~95%B; 15.1~17.0 min, 0%B。流速为0.4 mL/min; 进样量为1 μL。

1.2.3 质谱条件

采集模式为正离子模式下的Schedule MRM模式, 离子源电压为5 000 V, 离子源温度为600 ℃, 雾化气和辅助气均为379 kPa, 每种鞘脂的离子对信息及去簇电压(DP)和碰撞能(CE)见表 1。

表 1 46种鞘脂的保留时间、母离子(Q1)、子离子(Q3)、去簇电压和碰撞能 Table 1 Retention times, precursor ions (Q1), product ions (Q3), declustering potentials (DP) and collision energies (CE) of the 46 sphingolipids
1.2.4 暴露试验

进行暴露试验之前, 需将待暴露的斑马鱼提前饲养至少一周, 以保证鱼适应当前饲养环境。按照4 L水最多10条鱼的比例, 将待暴露的1 200条成年斑马鱼平均随机分装到12个鱼缸中, 每缸100条斑马鱼, 设置4组, 分别为溶剂对照组、rac-IBU暴露组、左旋体暴露组和右旋体暴露组, 每组设置3个平行, 布洛芬的暴露浓度设置为5 μg/L, 暴露周期为28天。对照组采用丙酮溶液作对照, 丙酮的体积与加入的布洛芬体积保持一致, 为200 μL, 不超过全部水溶液的0.01%(体积分数)。暴露期间, 每24 h换一次暴露溶液。暴露结束后, 使用MS-222麻醉剂将斑马鱼致死, 并在冰上采集斑马鱼脑组织。每5个鱼脑作为一个样本, 并在采集完毕后迅速放入-80 ℃冰箱冻存。

1.2.5 样品前处理

取5个斑马鱼的脑组织(约20 mg), 置于1.5 mL离心管中, 加入180 μL甲醇, 在冰上进行充分研磨, 将研磨液转移至5 mL离心管中; 加入180 μL甲醇冲洗管壁残留并将其合并至5 mL离心管中; 加入1.2 mL氯仿, 涡旋混匀1 min, 超声提取3 min; 加入240 μL水混匀, 静置分层, 取氯仿层至5 mL离心管中, 重复此提取步骤; 合并氯仿层, 室温条件下氮吹至干, 用1 mL甲醇复溶, 过0.2 μm滤膜, 然后上机测定。本研究中对照组及实验组分别设置7个平行样品。

1.2.6 数据处理

借助于Simca-P 13.0软件进行多元统计分析, 然后根据VIP值大于1筛选出具有差异变化的脂质。将筛选出的脂质数据导入SPSS 16.0软件进行显著性分析和组间差异分析, 最后用GraphPad软件进行作图。

2 结果与分析
2.1 鞘脂检测方法
2.1.1 色谱条件选择

在鞘脂分子的结构中存在一分子长链脂肪酸、一分子鞘氨醇及一分子极性头醇。结合鞘脂的结构, 选择流动相A为甲酸甲醇水组合, B为甲酸甲醇异丙醇组合, 为使46种鞘脂实现良好分离, 不断调节流动相各部分比例, 在1.2.2节梯度条件下, 46种鞘脂的色谱峰在14 min内实现了良好分离(见图 1)。

图 1 46种鞘脂标准品的提取离子流图 Fig. 1 Extracted ion chromatograms of a mixture of the 46 sphingolipid standards
2.1.2 质谱条件选择

在电喷雾质谱的正离子模式条件下, 采用单一标准品针泵进样, 找到该鞘脂的母离子和子离子。由扫描结果可知, 鞘脂的准分子离子峰多为[M+H]+, 且同一类别的鞘脂离子碎片具有一定的碎裂规律。为使得鞘脂分子母离子和子离子的响应提高, 对DP和CE进行了优化。DP主要在母离子扫描过程中起作用, 过高和过低都会影响离子的丰度。根据每一种鞘脂性质的不同, 我们分别优化了DP, 以确保母离子响应, 从而提高检测灵敏度。CE是指在子离子扫描过程中, 对母离子所施加的碰撞能量, CE的高低直接影响到子离子碎片的响应。在本研究中, 我们对每一种鞘脂的CE都分别进行了优化, 从而保证子离子碎片扫描的准确度和高响应性。随后, 我们采用MRM模式进行46种鞘脂标准品的扫描, 并对其他相关参数进行微调, 提高系统的灵敏度, 并确定每一种鞘脂分子的保留时间, 然后采用Schedule MRM模式进行扫描, 进一步提高系统灵敏度。

2.1.3 基质效应

基质效应的考察是采用溶剂标准曲线和基质标准曲线进行比较计算的, 即:基质效应=(b基质标/b溶剂标-1)×100%, 其中b基质标表示基质标准曲线的斜率, b溶剂标表示溶剂标准曲线的斜率。基质效应小于-20%时, 表现出基质抑制。当基质效应大于20%时, 表现出基质增强。结果(见表 2)显示, 18种鞘脂表现出基质抑制效应, 6种鞘脂表现出基质增强效应。在该提取条件下, 除鞘脂以外的其他脂质也会从斑马鱼脑组织中溶出, 如甘油磷脂等, 从而对鞘脂精确定量造成影响, 导致个别鞘脂的基质效应较强。尤其是梯度洗脱程序的10~14 min范围内, 在色谱柱上保留较强的鞘脂、磷脂或者其他物质因为流动相中的高比例有机溶剂存在(＞90%的0.1%甲酸甲醇-异丙醇), 会在运行后期形成更多的共流出物, 从而在质谱上表现出更强的基质响应。所以, 一方面我们利用色谱分离, 将干扰物与目标物分开, 将鞘脂的保留时间调至4 min以后, 以提高鞘脂分离度来降低基质干扰; 另一方面, 我们将进样量调至1 μL, 从而降低基质干扰[24], 故可使用溶剂标准曲线进行定量分析。

表 2 46种鞘脂的线性方程、相关系数、线性范围、检出限(LODs)、定量限(LOQs)和基质效应 Table 2 Linear equations, correlation coefficients (R), linear ranges, limits of detection (LODs), limits of quantification (LOQs), and matrix effects of the 46 sphingolipids
2.2 方法学考察
2.2.1 线性关系

将46种鞘脂混合标准溶液用甲醇稀释至质量浓度为0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列标准溶液, 以各鞘脂的质量浓度为横坐标, 色谱峰面积响应为纵坐标, 绘制标准曲线, 进行线性回归分析并计算相关系数。由表 2可知, 这46种鞘脂的相关系数(R)为0.991 3~0.999 9, 说明线性关系均较好, 满足检测要求。

将46种鞘脂的混合标准溶液上机测定, 以信噪比(S/N)为3的鞘脂质量浓度为LOD, S/N为10的鞘脂质量浓度为定量限。由结果可知, 其中44种鞘脂的检出限低于1 μg/L, 43种鞘脂的定量限低于2 μg/L。

2.2.2 回收率和精密度

在斑马鱼脑组织匀浆中分别添加3个水平的混合标准溶液进行回收率实验, 回收率的计算是采用空白样品背景扣除法, 得到每种鞘脂的平均回收率为82.4%~117.9%, 相对标准偏差(RSD)为0.3%~14.4%, 见表 3。

表 3 加标斑马鱼脑组织样品中46种鞘脂的回收率和RSD(n=5) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 46 sphingolipids spiked in adult zebrafish brain samples (n=5)
2.3 鞘脂组学分析
2.3.1 数据分析

将46种神经鞘脂的数据借助于6500 MultiQuant定量软件进行定量, 然后将定量结果导入Simca-P软件进行多元统计分析。为探究rac-IBU、R-(-)-IBU和S-(+)-IBU的暴露影响, 首先进行了主成分分析(PCA), R2X=0.876, Q2=0.573, 模型良好, 见图 2, 可以看出, 对照组、rac-IBU、R-(-)-IBU和S-(+)-IBU暴露组样品得到了很好的分离。说明布洛芬暴露确实会导致斑马鱼脑组织中的鞘脂代谢受到影响。为了进一步找到布洛芬暴露影响的靶标脂质, 建立了3组偏最小二乘(OPLS-DA)模型(见图 3a, b, c), 这3个模型参数均满足要求, 且经验证后, 参数显示模型未出现过拟合。根据VIP值＞1, 分别找到存在差异的脂质分子, 并建立了韦恩图模型(见图 3d), 以分析rac-IBU及对映体对斑马鱼脑组织中的鞘脂种类的立体选择性影响。将筛选出的16种VIP值＞1的鞘脂分子定量结果导入SPSS软件中进行显著性差异分析及多组间差异分析。结果见图 4。其中*代表p＜0.05, **代表p＜0.01, 不同的字母表示代表组间存在差异, 而相同字母代表不存在差异。以图 3中的12:0 SM (d18:1/12:0)为例, rac-IBU暴露组与R-(-)-IBU暴露组的字母分别为b和c, 说明这两组之间存在显著差异, 而R-(-)-IBU暴露组和S-(+)-IBU暴露组皆以c表示, 说明这两组之间不存在显著差异。

图 2 对照组、rac-IBU、R-(-)-IBU和S-(+)-IBU暴露组脑组织样品的主成分分析结果 Fig. 2 3D PCA plot of control-, rac-IBU-, R-(-)-IBU-, and S-(+)-IBU-treated brain tissue samples

图 3 rac-IBU、R-(-)-IBU和S-(+)-IBU暴露组与对照组相比的正交偏最小二乘分析及韦恩图分析结果 Fig. 3 Orthogonal partial least square-discriminate analysis (OPLS-DA) plots of rac-IBU-, R-(-)-IBU-, and S-(+)-IBU-treated samples vs controls, and a Venn plot for IBU-treated samples

图 4 16种存在显著差异的鞘脂在不同组别间的含量变化 Fig. 4 Content changes of 16 sphingolipids with significant difference among different ibuprofen-treated groups Bars without the same letter (a, b, and c) were significantly different based on the Duncan post hoc test and Dunnett post hoc comparison; *p < 0.05 and **p < 0.01.
2.3.2 潜在生物标志物的变化趋势及生理学意义分析

借助代谢组学数据分析方法, 筛选出16种存在显著差异的鞘脂(见图 4)。总体来看, 这16种神经鞘脂含量均发生了上调。其中C16 dihyrdroceramide (d18:0/16:0)、17:0 SM (d18:1/17:0)、C16 lactosyl (β) ceramide (d18:1/16:0)、18:0 SM (d18:1/18:0)、16:0 SM (d18:1/16:0)、C24 ceramide-1-phosphate (d18:0/24:0)和C18 glucosyl(β) ceramide (d18:1/18:0)在R-(-)-IBU暴露组中上调最高。Satoshi等[25]研究发现, 16:0 SM (d18:1/16:0)上调会显著增加葡萄糖的消耗量和乳酸的生成量, 从而增加ATP产生, 而且发现, 16:0 SM (d18:1/16:0)可以通过激活糖酵解途径来增加ATP的产生。在本研究中, 经布洛芬暴露后, 16:0 SM (d18:1/16:0)的含量出现明显上调, 说明布洛芬会导致斑马鱼成鱼脑组织中的能量代谢发生紊乱。而ceramide-1-phosphate (d18:0/24:0)的升高与脂肪变性有关, 说明布洛芬暴露会影响斑马鱼脑组织中的脂质代谢[26]。此外, Skotland等[27]发现C16 lactosyl (β) ceramide (d18:1/16:0)可作为诊断前列腺癌的潜在生物标志物。12:0 SM (d18:1/12:0)在S-(+)-IBU暴露组中上调最高。而C16 ceramide (d18:1/16:0)、C17 ceramide (d18:1/17:0)、C18 ceramide (d18:1/18:0)、C24:1 lactosyl (β) ceramide (d18:1/24:1(15Z))、C16 glucosyl (β) ceramide (d18:1/16:0)、C20 ceramide (d18:1/20:0)、C22 ceramide (d18:1/22:0)和C24:1 ceramide (d18:1/24:1(15Z))在rac-IBU暴露组中的含量上调最高。神经酰胺, 尤其是葡糖神经酰胺和乳糖神经酰胺的累积会抑制载体蛋白E的产生, 从而导致巨噬泡沫细胞中胆固醇的累积。其中C16 ceramide (d18:1/16:0)与动脉粥样硬化症状密切相关[28]。本研究结果说明, 布洛芬暴露会影响斑马鱼脑组织中的胆固醇代谢。

越来越多的研究发现神经鞘磷脂与细胞的内吞作用、蛋白质分选及其他细胞核的功能调控密切相关。而且, 神经酰胺还可作为心血管疾病的风险评估因子, 在心血管疾病监控中具有重要的研究意义[29]。Rye等[30]研究发现神经鞘磷脂不仅会影响盘状和球状重组高密度脂蛋白的结构, 还会抑制盘状重组高密度脂蛋白形成过程中的卵磷脂-胆固醇酰基转移酶反应, 而重组高密度脂蛋白可用于治疗动脉粥样硬化和其他心血管疾病。神经酰胺与动物的应激反应、细胞免疫、细胞生长和变异以及细胞凋亡有着密切的联系[31, 32]。本研究中, 有一种神经酰胺-1-磷酸盐发生了显著变化, 神经酰胺-1-磷酸盐是神经酰胺在特定的神经酰胺激酶的磷酸化作用下产生的。而且神经酰胺-1-磷酸盐也是花生四烯酸和前列腺素类物质合成的诱导剂[33]。以上结果说明长期布洛芬暴露会导致斑马鱼成鱼脑组织中的鞘脂代谢发生紊乱, 且外消旋体及其手性对映体产生的毒性影响表现出明显的选择性。

3 结论

本研究基于超高效液相色谱-串联质谱联用的鞘脂组学方法, 分析了经rac-布洛芬及其手性对映体暴露的斑马鱼脑组织中鞘脂变化。发现布洛芬长期暴露会导致包括神经鞘磷脂、神经酰胺、乳糖神经酰胺、葡糖神经酰胺以及神经酰胺-1-磷酸盐等5类鞘脂发生了代谢紊乱, 表明斑马鱼脑组织中的神经功能、能量代谢和过敏免疫系统受到影响, 且R-(-)-布洛芬和S-(+)-布洛芬暴露组中受影响的鞘脂种类和含量表现出明显的选择性, 可作为水生生物布洛芬污染判别的潜在生物标志物。

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