色谱  2018, Vol. 36 Issue (9): 873-879   PDF    
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叶美君
陆小磊
刘相真
张海华
杜颖颖
潘胜东
柱前衍生-超高效液相色谱-串联质谱测定茶叶中草甘膦、草铵膦及主要代谢物氨甲基膦酸残留
叶美君1, 陆小磊1, 刘相真1, 张海华1, 杜颖颖1, 潘胜东2     
1. 中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院, 浙江 杭州 310016;
2. 宁波市疾病预防控制中心, 浙江省微量有毒化学物健康风险评估技术研究重点实验室, 浙江 宁波 315010
收稿日期：2018-04-24
基金项目：浙江省公共卫生应急检测关键技术重点实验室开放基金；宁波市自然科学基金项目（2016A610178）；国家"十二五"科技支撑计划课题（2012BAD36B06）
通讯联系人：叶美君, Tel:(0571)86043882, E-mail:yemjmj@163.com; 潘胜东, Tel:(0574)87274559, E-mail:panshengdong0714@163.com
摘要：采用柱前衍生-超高效液相色谱-串联质谱测定茶叶中草甘膦、草铵膦及其主要代谢物氨甲基膦酸残留。利用正交试验方法，系统研究了提取与净化等前处理条件对茶叶中草甘膦、草铵膦和代谢物氨甲基膦酸检测的影响。实验结果表明，最优的前处理方案为茶叶样品经纯水旋涡提取，阳离子交换柱净化，0.5%（v/v）甲酸水溶液洗脱和9-芴甲基氯甲酸酯衍生，C18色谱柱分离，超高效液相色谱-串联质谱定量分析（电喷雾正离子）。结果表明：在1~100 μg/L范围内，草甘膦、草铵膦和氨甲基膦酸呈现良好的线性关系，相关系数（R2）均大于0.991，该方法检出限为0.0160~0.0300 mg/kg，定量限为0.0530~0.100 mg/kg。在0.0500、0.400和1.20 mg/kg 3个添加水平下，草甘膦、草铵膦和氨甲基膦酸的平均回收率为78.3%~108%，相对标准偏差为5.46%~9.63%。利用该方法检测837份茶叶中草甘膦、草铵膦和氨甲基磷酸残留，检出率分别为3.46%、0.24%和4.42%，超标率为0.24%。该方法简单、快速、灵敏、准确，能够满足大批量茶叶中草甘膦、草铵膦和氨甲基膦酸残留的检测需要。
关键词：柱前衍生    超高效液相色谱-串联质谱    草甘膦    草铵膦    氨甲基膦酸    茶叶    9-芴甲基氯甲酸酯    
Determination of glyphosate, glufosinate, and main metabolite aminomethylphosphonic acid residues in dry tea using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
YE Meijun1, LU Xiaolei1, LIU Xiangzhen1, ZHANG Haihua1, DU Yingying1, PAN Shengdong2     
1. Hangzhou Tea Research Institute, All-China Federation of Supply and Marketing Cooperatives, Hangzhou 310016, China;
2. Key Laboratory of Health Risk Appraisal for Trace Toxic Chemicals of Zhejiang Province, Ningbo Municipal Center for Disease Control and Prevention, Ningbo 315010, China
Foundation item: The Opening Foundation of Key Laboratory of Emergency Detection for Public Health of Zhejiang Province; Ningbo Natural Science Foundation of China (No. 2016A610178); National Key Technology R & D Program (No. 2012BAD36B06)
Abstract: A method has been developed for the determination of glyphosate (GLY), glufosinate (GLUF), and the main metabolite aminomethylphosphonic acid (AMPA) residues in dry tea based on ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) coupled with pre-column derivatization. A systematic study of the effects of pretreatment methods including extraction and purification procedures was designed and carried out for the determination of GLY, GLUF, and AMPA. The results indicated that the optimal pretreatment method was as follows:the tea sample was first extracted by water in vortex, and then purified by a cation exchange solid-phase extraction column with the elution of 0.5% (v/v) formic acid aqueous solution. Finally, the eluant was derivatized by 9-fluorenylmethyl chloroformate, and the target compounds were separated on a C18 chromatographic column and analysed by UPLC-MS/MS (ESI+). GLY, GLUF, and AMPA showed good linearity in the range of 1-100 μg/L, with correlation coefficients above 0.991. The limits of detection and limits of quantification were found to be 0.0160-0.0300 mg/kg and 0.0530-0.100 mg/kg, respectively. The average spiked recoveries of GLY, GLUF, and AMPA varied from 78.3% to 108% at three spiked levels (0.0500, 0.400, and 1.20 mg/kg), while the relative standard deviations ranged from 5.46% to 9.63%. The proposed method was utilized to detect 837 batches of tea samples. The detection ratios of GLY, GLUF, and AMPA were 3.46%, 0.24%, and 4.42%, respectively, while 0.24% of the investigated tea samples had values above maximum residue limits. The developed method is simple, rapid, sensitive, and accurate for the determination of GLY, GLUF, and AMPA in dry tea and may be used for routine analysis.
Key words: pre-column derivatization     ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)     glyphosate     glufosinate     aminomethylphosphonic acid     tea     9-fluorenylmethyl chloroformate    

由中国农药信息网(http://www.Chinapesticide.gov.cn)和文献[1]可知, 草甘膦(glyphosate, GLY)和草铵膦(glufosinate, GLUF)是我国登记的允许茶树使用的除草剂, 茶叶中草甘膦和草铵膦的最高残留限量(RML)较低, 与日本和欧盟等国家和地区的RML基本相近(中国为1.0 mg/kg和0.5 mg/kg, 日本为1.0 mg/kg和0.3 mg/kg, 欧盟为2.0 mg/kg和0.1 mg/kg)。茶多酚、氨基酸、咖啡碱、茶多糖等700余种内源性成分赋予茶叶独特的健康保健功能的同时[2], 极大地增加了茶叶中草甘膦和草铵膦检测前处理和仪器分析的难度, 进而影响样品检测的灵敏度(检出限和定量限)、精密度(重复性)和准确度(回收率)。

草甘膦和草铵膦的检测方法主要包括离子色谱法(IC)、高效液相色谱-荧光法(HPLC-FD)、气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱-质谱法(LC-MS)[3-5]。草甘膦和草铵膦及其主要代谢物氨甲基磷酸(minomethylphosphonic acid, AMPA)的分子质量小、极性大、不溶于有机溶剂、水溶性强, 与有机物有很强的结合能力, 直接分析难度较大[6]。黄嘉乐等[7]采用离子色谱法直接检测茶叶中草甘膦和草铵膦, 由于其定量限较高, 依据GB 2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中该除草剂的RML, 该检测方法无法满足日常检验要求, 因此植物源样品主要采用衍生法间接检测。茶叶中氨基酸种类繁多且含量高, 草甘膦和草铵膦属氨基酸类除草剂, 该衍生产物与氨基酸衍生产物结构相似, 荧光检测器分辨能力低, 假阳性高, 不利于茶叶样品的准确分析。气相色谱-质谱法(GB/T 23750-2009)衍生试剂七氟丁醇(HFB)价格昂贵, 衍生剂三氟乙酸酐(TFAA)易挥发, 衍生条件苛刻, 日常检验应用较少。9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC-Cl)作为氨基酸的保护基团, 用于固相多肽合成和有机物合成, 也作为衍生试剂常用于氨基酸的定性定量分析[8-11]。Ibáñez等[12]、曹赵云等[13]和吴晓刚等[14]将该衍生剂引入氨基酸类除草剂的检测, Ibáñez等报道了草甘膦、草铵膦和氨甲基磷酸衍生产物(FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA)的质谱图, 曹赵云等和吴晓刚等阐明该衍生产物在质谱中的裂解途径。由于FMOC-Cl易溶于有机溶剂, 不溶于水, 而形成的衍生产物FMOC-GLY、FMOC-AMPA和FMOC-GLUF溶于水, 基于这一特殊的理化特性, 以FMOC-Cl为衍生试剂的柱前衍生-高效液相色谱-质谱法广泛应用于茶叶中草甘膦、草铵膦和氨甲基膦酸的检测[14-21]。

基于FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测技术成熟, 实验条件简单, 茶叶样品的检测难点主要集中在提取和净化等前处理过程, 该过程直接决定茶叶样品中内源性物质的组成, 并影响草甘膦、草铵膦和氨甲基膦酸的衍生反应转化率, 进而影响样品检测的灵敏度、精密度和准确度。本实验选取水和0.2%(v/v)甲酸水溶液作为提取剂, 超声、振荡和旋涡作为提取方式, 草甘膦专用柱(Special SPE)、碳十八柱(C18柱)和阳离子交换柱(PCX)作为固相萃取(SPE)的净化小柱, 利用正交试验设计方法, 优化提取剂、提取方式和固相萃取净化小柱, 系统研究提取和净化等前处理过程对茶叶中草甘膦、草铵膦和氨甲基膦酸检测的影响。本文采用UPLC-MS/MS内标法对茶叶中草甘膦、草铵膦和氨甲基膦酸定性定量分析, 以灵敏度、精密度和准确度评价方法的适用性。

1 实验部分
1.1 仪器与设备

UPLC/TSQ Quantum Access MAX超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(美国Thermo Fisher Scientific公司); 分析天平(感量0.000 1 g, 瑞士Mettler Toledo公司); SC-3610低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司); FJ-12A固相萃取装置(上海京孚仪器有限公司); 超纯水系统(成都康宁实验专用纯水设备厂); 漩涡混合器(海门其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.2 试剂与材料

甲醇(色谱纯, 美国Tedia公司); 乙酸铵(色谱纯, 美国Fluka公司); 甲酸、37%盐酸(色谱纯, 德国Merck公司); 十水四硼酸钠(分析纯, 天津市风船化学试剂科技有限公司); 磷酸二氢钾(分析纯, 华东医药股份有限公司); FMOC-Cl(衍生级, 纯度≥ 99.9%, 上海安谱科学仪器有限公司); 草甘膦水溶液(100 μg/mL, AccuStandard, Inc); 草铵膦(纯度99.0%, AccuStandard, Inc); 氨甲基膦酸(纯度99.0%, Chem Service); 1, 2-14C15N草甘膦(GLY-15N, 纯度96%, TRC); FMOC-GLY和FMOC-AMPA水溶液(10 μg/mL, Dr. Ehrenstorfer); FMOC-GLUF(纯度96.2%, Dr. Ehrenstorfer); 100 mg/3 mL草甘膦专用柱(Special SPE, 福建昊阳生物科技有限公司); 200 mg/3 mL C18小柱(C18, 岛津技迩商贸有限公司); 60 mg/3 mL阳离子交换柱(PCX, 博纳艾杰尔科技公司); 茶粉(茶叶磨碎样品, 按照GB/T 8303-2013制备)。

1.3 标准溶液、硼酸钠溶液和衍生液的配制

标准溶液配制:准确称取10.0 mg(精确至0.1 mg)固体标准物质, 分别用超纯水溶解并配制成质量浓度为100 mg/L的标准储备液, 于4 ℃冰箱中避光保存。将上述标准储备液和液体标准品逐级稀释, 配成单标准溶液或混合标准溶液。

50.0 g/L硼酸钠溶液:称取9.46 g Na2B4O7·10H2O, 采用超纯水溶解并定容至100 mL。

250 g/L氢氧化钠溶液:称取25.00 g NaOH, 采用超纯水溶解并定容至100 mL。

1.00 g/L FMOC-Cl丙酮溶液:称取0.10 g FMOC-Cl, 采用丙酮溶解并定容至100 mL。

酸度调节剂:称取16.00 g磷酸二氢钾溶于160 mL水, 加入13.4 mL盐酸和40 mL甲醇, 超声混合均匀。

1.4 液相色谱-串联质谱条件

色谱柱:Thermo Hypersil GOLD C18(150 mm×2.1 mm, 1.9 μm); 流动相A为5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸), 流动相B为甲醇, 梯度洗脱条件见表 1; 柱温:40 ℃; 进样量:2.0 μL。

表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Program of the gradient elution

质谱电离模式:电喷雾离子化(ESI); 电离源极性:正离子模式; 雾化气:氮气; 离子喷雾电压:3 500 V; 雾化室温度:120 ℃; 离子传输管温度:350 ℃; 碰撞气:氩气, 0.2 Pa; 扫描模式:选择反应监测扫描(SRM)。

1.5 样品前处理

提取:称取茶粉2.5 g(精确至0.001 g)置于50 mL具塞聚乙烯离心管中, 加入10 μg/mL草甘膦同位素内标100 μL, 再加入20 mL超纯水, 旋涡提取30 min, 以2 500 r/min转速离心5 min, 取上清液待净化。

净化:分别移取2.0 mL甲醇和2.0 mL 0.5%(v/v)甲酸水溶液依次活化小柱, 准确移取1.0 mL提取上清液和100 μL酸度调节剂于10 mL离心管中混合后移取至小柱, 再加入1.0 mL 0.5%(v/v)甲酸水溶液洗脱, 采用250 g/L NaOH调节流出液至中性并加水定容至3 mL, 待衍生。

衍生:取0.6 mL净化液, 分别依次加入0.2 mL 50.0 g/L硼酸钠溶液, 0.2 mL 1.0 g/L FMOC-Cl丙酮溶液, 混匀后于25 ℃下衍生2 h, 0.2 μm有机微孔滤膜过滤, UPLC-MS/MS测定。

2 结果与讨论
2.1 质谱条件优化和衍生产物确证

将FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA的单标准溶液进质谱仪器直接分析, 调节碰撞能量, 以获得稳定性好、信号强度高的碎片离子, 优化得到的参数见表 2。

表 2 FMOC-GLY、FMOC-GLY-15N、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA的质谱参数 Table 2 MS parameters for FMOC-GLY, FMOC-GLY-15N, FMOC-GLUF, and FMOC-AMPA

在25 ℃下, GLY、AMPA和GLUF单标准溶液分别与FMOC-Cl溶液反应2 h, 将该衍生反应溶液进质谱分析, 谱图显示该衍生反应溶液的离子碎片与FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA的单标准溶液离子碎片一致。设置液相色谱条件和质谱参数, 经UPLC-MS/MS分析, FMOC-GLY、FMOC-GLU和FMOC-AMPA单标准溶液与该衍生反应溶液的液相色谱保留时间一致。由此可见, 根据1.5节衍生条件和方法, GLY、GLUF和AMPA与FMOC-Cl反应的产物为FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA。

2.2 前处理条件优化
2.2.1 GLY、GLUF和AMPA在不同固相萃取柱中的洗脱液用量

选取Special SPE、C18和PCX作为茶叶中GLY、GLUF和AMPA检测的净化小柱, 以此考察不同固相萃取柱的净化效果。为了确保目标物完全洗脱, 首先进行流出液实验, 优化各种固相萃取柱的洗脱液用量。以2 mL甲醇和2 mL 0.5%(v/v)甲酸水溶液活化小柱, 移取1 mL 100 μg/L的混合标准溶液和100 μL酸度调节剂混合后移取至固相萃取柱, 采用0.5%(v/v)甲酸水溶液为洗脱液, 每次分别加入0.5 mL洗脱液, 洗脱液用量见表 3。

表 3 目标物在不同固相萃取柱中不同洗脱液用量下的洗脱效果 Table 3 Elution effects of the targets on different SPE columns with different elution volumes

根据表 3数据显示, 以0.5%(v/v)甲酸水溶液为洗脱剂, 3种固相萃取柱的洗脱液用量相似, 均为1 mL, 试样流出液中已存在草甘膦和氨甲基膦酸, 前段流出液必须收集。

2.2.2 提取溶剂、提取方式和固相萃取净化柱的选择

以水和0.2%(v/v)甲酸水溶液作为提取剂, 超声、振荡和旋涡作为提取方式, Special SPE、C18和PCX为固相萃取净化小柱, 采用正交试验设计研究前处理方法对茶叶中草甘膦、草铵膦和氨甲基膦酸检测的影响, 样品添加水平为0.400 mg/kg, 实验过程如1.5节所示, 正交试验设计见表 4, 实验结果见表 5, 色谱图见图 1。由图 1可知, 在相同的色谱条件下, FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA的保留时间分别约为:FMOC-GLY 4.62 min, FMOC-GLUF 4.91 min, FMOC-AMPA 4.79 min, 经Special SPE和C18柱净化, FMOC-GLY和FMOC-GLUF与杂质峰尚未完全分离, 且杂质峰响应相对FMOC-GLY和FMOC-GLUF响应较大; 经PCX柱净化, FMOC-GLY与杂质峰完全分离, FMOC-GLY和FMOC-GLUF响应相对杂质峰响应较大。

表 4 正交试验设计 Table 4 Orthogonal experimental design

表 5 GLY、GLUF和AMPA在不同前处理方法中的添加回收率和相对标准偏差(n=3) Table 5 Spiked recoveries and RSDs of GLY, GLUF, and AMPA with different pretreatment methods (n=3)

图 1 采用不同固相萃取小柱净化的FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA色谱图 Fig. 1 Chromatograms of FMOC-GLY, FMOC-GLUF, and FMOC-AMPA purified by different SPE columns

根据表 5可知, No. 2、No. 4和No. 7的回收率为70%~120%, 回收率数据尚无显著差异性和规律性, 相对标准偏差小于10%, 满足检测要求。根据目标物的峰面积(见图 2)可知, 采用PCX柱的No. 4和Special柱的No. 7, FMOC-GLY和FMOC-GLUF的响应较大, 采用C18柱的No. 2, FMOC-AMPA响应较大。

图 2 不同实验条件下FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA的峰面积 Fig. 2 Peak area of FMOC-GLY, FMOC-GLUF, and FMOC-AMPA under different experiment conditions

设计低水平添加实验(在检出限附近), 通过信噪比(S/N)进一步确认最优实验方案。将添加水平为0.100 mg/kg的茶叶样品按照No. 2、No. 4和No. 7试验方案和1.5节的前处理过程进行处理, 目标物的信噪比见图 3。根据图 3可知, 在0.100 mg/kg添加水平下, 采用PCX净化柱的No. 4试验和Special SPE净化的No. 7试验, 草甘膦和草铵膦的信噪比较大, 氨甲基膦酸在3支净化柱上的信噪比相似。

图 3 不同实验条件下FMOC-GLY、FMOC-GLUF和FMOC-AMPA的信噪比 Fig. 3 S/N ratios of FMOC-GLY, FMOC-GLUF, and FMOC-AMPA under different experiment conditions

综合回收率、色谱分离度、目标物响应、杂质干扰和低浓度溶液的信噪比等因素, 本实验的最优前处理方法即采用水为提取剂, 旋涡为提取方式, PCX柱为净化小柱。

2.3 方法评价
2.3.1 标准曲线、基质效应、方法检出限和定量限

分别以PCX柱净化的茶提取液和纯水配制基质标准溶液和溶剂标准溶液, 以FMOC-Cl溶液进行衍生, 以目标物与草甘膦同位素内标物的峰面积比值作为纵坐标, 目标物浓度与草甘膦同位素内标物浓度的比值为横坐标, 绘制基质匹配标准曲线和溶剂标准曲线。基质效应以η表示:η=(基质匹配标准曲线的斜率-溶剂标准曲线的斜率)/溶剂标准曲线的斜率[22]。结果表明, 在1~100 μg/L范围内线性关系良好, 基质匹配标准曲线、相关系数(R2)和基质效应参数见表 6。由表 6可知, η < 10%, 说明无明显基质效应, 由此可见, 草甘膦同位素内标可以大幅度降低基质效应。在空白茶叶样品中添加草甘膦、草铵膦和氨甲基磷酸, 并经1.5节样品前处理方法处理, 根据3倍信噪比(S/N=3)确定方法的检出限(LOD), 根据0.050 0 mg/kg添加水平的回收率和RSD数据确认方法的定量限(LOQ)(见表 6)。

表 6 线性范围、基质匹配线性方程、相关系数、基质效应、检出限和定量限 Table 6 Linear ranges, matrix-matched regression equations, correlation coefficients (R2), matrix effects (η), limits of detection (LODs), and limits of quantification (LOQs)
2.3.2 方法准确度和精密度

分别称取2.50 g茶叶空白样品, 然后加入适量混合标准溶液, 配制成低、中、高3个添加水平(0.050 0、0.400和1.20 mg/kg), 按照1.5节样品前处理方法进行提取、净化和衍生, 然后采用UPLC-MS/MS检测, 每一个加标水平测定6次, 结果见表 7。

表 7 草甘膦、草铵膦和氨甲基磷酸在茶叶中的添加回收率和RSD(n=6) Table 7 Recoveries and RSDs of GLY, GLUF, and AMPA spiked in a tea sample (n=6)

由表 7可知, 草甘膦、草铵膦和氨甲基磷酸在低、中、高3个水平均有着较好的准确度与精密度, 符合实验室日常检测要求。

2.3.3 与其他方法的比较

目前国内现行标准GB/T 23750-2009《植物性产品中草甘膦残留量的测定气相色谱-质谱法》、SN/T 1923-2007《进出口食品中草甘膦残留量的检测方法液相色谱-质谱/质谱法》和SN/T 3983-2014《出口食品中氨基酸类有机磷除草剂残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》等前处理均采用美国Bio-Rad CAX阳离子交换树脂小柱, 按照上述标准方法对茶叶中草甘膦和草铵膦进行检测, 经过长期检测发现诸多问题:Bio-Rad CAX为湿柱, 柱体积大, 吸附容量小, 必须采用常压过柱方式, 洗脱液用量大且水占比高, 不易浓缩蒸干, 实际工作中需要耗费大量的时间和精力, 而且Bio-Rad CAX阳离子交换树脂小柱价格昂贵。本实验采用PCX干柱, 柱体积小, 可采用减压过柱方式, 采用0.5%(v/v)甲酸水溶液作为洗脱液, 洗脱液用量小, 在UPLC-MS/MS灵敏度范围内, 无需浓缩已达到定量限要求, 价格低廉, 可弥补Bio-Rad CAX柱的缺点。

2.4 实际样品检测

采用上述方法检测837份绿茶、红茶、青茶、黑茶、白茶、黄茶、代用茶和速溶茶等茶叶样品, 其中草甘膦阳性样品29份, 残留量在0.140~2.36 mg/kg之间, 草铵膦阳性样品2份, 残留量分别为0.110 mg/kg和0.130 mg/kg, 氨甲基磷酸阳性样品37份, 残留量在0.120~2.15 mg/kg之间。草甘膦、草铵膦和氨甲基磷酸的检出率分别为3.46%、0.24%和4.42%。按照GB 2763-2016的草甘膦和草铵膦的MRL判定, 茶叶样品草甘膦超标2份, 超标率为0.24%, 茶叶样品草铵膦未超标。目前GB 2763-2016尚未制订氨甲基磷酸的MRL。

3 结论

本文采用正交试验设计筛选出最优前处理方法, 以水为提取剂, 旋涡提取, PCX强阳离子交换固相萃取干柱净化, 建立了柱前衍生-超高效液相色谱-串联质谱测定茶叶中草甘膦、草铵膦及其主要代谢物氨甲基膦酸残留量的实验方法。该分析方法高效、便捷, 价格低廉, 可操作性强, 方法的灵敏度、精密度和准确度满足茶叶的日常检测要求。根据本实验现象可知, 茶叶丰富的内源性物质对草甘膦、草铵膦和氨甲基磷酸检测影响较大, 茶叶基质的有效去除是排除假阳性样品的关键。基于这一实验结果, 进一步深入探讨茶叶内源性成分对草甘膦等除草剂衍生反应的影响, 发现其中的内在规律, 可为提取溶剂和提取方式的选择、净化材料的开发和衍生试剂的选取等提供理论和现实依据。

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