色谱  2018, Vol. 36 Issue (10): 1005-1017   PDF    
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张静娴
毛秀红
季申
超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法定性筛查保健食品中西地那非及其相关功效类非法添加化合物
于泓, 胡青, 孙健, 冯睿, 张甦, 张静娴, 毛秀红, 季申     
上海市食品药品检验所, 上海 201203
收稿日期：2018-04-27
基金项目：上海市科委技术平台专项(14DZ2294000);上海市科委"长三角科技联合公关领域"项目(18395810300);2017-国家食品药品监督管理总局食品补充检验方法项目
通讯联系人：季申.Tel:(021)50798195, E-mail:jishen2013@163.com
摘要：建立了超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）定性筛查102种西地那非及其相关功效化合物的方法。甲醇超声提取样品；采用Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱（75 mm×3.0 mm，2.7 μm），以0.1%（v/v）甲酸水溶液-乙腈为流动相梯度洗脱，流速0.4 mL/min；采用电喷雾离子（ESI）源，Q-TOF-MS作检测器，正离子模式检测；与对照品保留时间、母离子及碎片离子精确相对分子质量、元素组成比对，准确定性。西地那非等100种化合物在10种基质中的检出限为0.1~50 mg/kg或0.1~50 mg/L。并分类归纳了文中涉及的98种磷酸二酯酶5抑制剂质谱碎片裂解规律，为可疑物的识别和鉴定提供参考。该方法已应用于实际样品的测定，检出19种化合物，有效打击了非法添加行为。
关键词：超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱    西地那非    磷酸二酯酶5抑制剂    保健食品    非法添加    
Qualitative analysis of illegally adulterated sildenafil and related compounds in dietary supplements by ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry
YU Hong, HU Qing, SUN Jian, FENG Rui, ZHANG Su, ZHANG Jingxian, MAO Xiuhong, JI Shen     
Shanghai Institute for Food and Drug Control, Shanghai 201203, China
Foundation item: Platform Project of Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (No.14DZ2294000); Project of Joint Research on Science and Technology in the Yangtze River Delta of Shanghai Municipality (No. 18395810300); 2017 Food Detection Method Development Project of China Food and Drug Administration
Abstract: The presence of illegally adulterated sildenafil and related compounds in dietary supplements was qualitatively analyzed by employing ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS). Samples were extracted by ultrasonic method using methanol. The analysis was performed on an Agilent Poroshell 120 SB-C18 column (75 mm×3.0 mm, 2.7 μm) using gradient elution with a mixture of aqueous formic acid solution (0.1%, v/v) and acetonitrile as the mobile phase at a flow rate of 0.4 mL/min. Q-TOF-MS equipped with ESI ion source was operated in a positive ionization mode. Qualitative analysis was based on the retention time and the accurate relative molecular mass of elemental compositions of the precursor ion and product ions. The limits of detection (LODs) of sildenafil and other 99 compounds were found to be 0.1-50 mg/kg or 0.1~50 mg/L in 10 different matrices. In this manuscript, the fragmentation behavior of 98 phosphodiesterase-5 inhibitors are categorically summarized, which can provide information for referencing and identification of suspicious compounds. The method was successfully applied to the analysis of actual samples, of which 19 compounds combated the illegal adulteration behavior effectively.
Key words: ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS)     sildenafil     phosphodiesterase-5 inhibitors (PDE-5)     dietary supplements     adulteration    

勃起功能障碍(erectile dysfunction, ED)为发病率较高的疾病之一, 因此抗ED药物有着庞大的市场[1]。近年来, 针对此类疾病而生产的补肾壮阳、抗疲劳类保健食品数量不断攀升。而违禁添加抗ED药物现象亦屡禁不绝, 其中以添加西地那非为代表的磷酸二酯酶5抑制剂(phosphodiesterase-5, PDE-5)类的化合物最为常见, 另外亦存在违禁添加育宾亨、达泊西汀等化合物的情况[2]。上海食品药品检验所在2016年3月~2018年3月期间对1 414批可能存在添加西地那非及其相关功效类化合物的食品、保健品进行检测, 其中458批样品中存在非法添加化学药物现象。此类非法添加行为的添加剂量及种类随意, 消费者在不知情的情况下长期或过量服用可能对健康和生命安全造成严重危害[2-3]。

目前, 我国相关标检测标准共5项:国家药品补充检验方法和检验项目批准件2009030、食药监食监三[2016]28号文附件7和国家食品补充检验方法BJS201601、BJS201704、BJS201710。共计覆盖检测PDE-5抑制剂类化合物13种。但不法商贩为规避监管, 不择手段地寻找新型添加物以牟取暴利, 仅国内报道的新型PDE-5抑制剂, 如丙氧苯基西地那非、丙氧基艾地那非、丙氧苯基硫代艾地那非、羟基硫代豪莫西地那非、丙氧苯基硫代羟基豪莫西地那非、2-羟乙基去甲基他达拉非等就有数十种[4-8]。在北美、欧洲、日韩等地发现被非法添加入食品及保健品的西地那非及其相关功效类的化合物还有:卡波地那非、西地那非N-氧化物、他达拉非甲基氯化物、去甲基卡巴地那非等近80种[2, 9-12]。因此, 现行标准难以有效打击非法添加新型衍生物的行为, 亟须更为准确高效、专属性强、覆盖范围广的国家标准以支撑目前市场监管需求。美国药典(USP)通则〈2251〉是目前国际上较为明确的针对非法添加检测的标准。其通则附录A中共列出64种性功能类化合物的6种定性检测方法[13]。

超高效液相色谱串联高分辨质谱法具有准确可靠、灵敏快速、通量高等特点, 被广泛应用于国内外的非法添加检测领域[2, 14-22]。而离子全通过的检测模式可以实现非靶标(nontarget)检测[19]; 通过诱导碰撞解离(collision induced dissociation, CID)可以获得碎片离子的精确相对分子质量信息, 定性准确，有利于跨类别添加物及未知新型类似物的发现, 亦可根据精确碎片信息发现并解析未知化合物, 非常适用于非法添加类的检测。

本实验采用超高效液相色谱串联四级杆-飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF-MS), 研究建立了102种抗ED药物高分辨质谱的定性筛查检测方法, 包括98种PDE-5抑制剂, 及育亨宾等其他4种具抗ED功效的化合物。该方法快速、准确、通量高, 可根据保留时间、母离子及碎片离子的精确相对分子质量准确定性, 并且覆盖化合物范围较广, 验证基质更加全面。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Agilent 1290 Infinity高效液相色谱仪, Agilent 6530 Q-TOF质谱仪(美国Agilent公司), Sartorius CP225D分析天平(德国Sartorius公司), 超声仪(上海科导超声仪器有限公司)。甲醇、盐酸和乙酸乙酯为分析纯试剂(上海凌峰化学试剂有限公司); 质谱用水和乙腈为LC-MS级试剂, 甲酸为色谱纯试剂，均为德国Merck公司提供; 质谱所用参比液、调谐液均为美国Agilent公司提供。

对照品来源及相关信息详见表 1, 对照品纯度均≥98%。样品购自市场。

表 1 102种化合物对照品的信息、碰撞能量(CE)、母离子和主要碎片离子 Table 1 Information of the reference standards, collision energies (CEs), precursor ions and major product ions of the 102 compounds
1.2 分析条件

Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱(75 mm×3.0 mm, 2.7 μm); 柱温:30 ℃; 进样体积:1 μL; 流速:0.4 mL/min; 流动相:A为0.1%(v/v)的甲酸水溶液, B为乙腈。洗脱梯度:0~15 min, 5%B~95%B; 15~17 min, 2%B; 后运行时间3 min。

离子源:电喷雾离子(electrospray ionization, ESI)源; 扫描方式:正离子模式; 毛细管电压:正离子模式5 000 V; 离子源温度:325 ℃; 干燥气流量:12 L/min; 雾化气压力:345 kPa; 鞘气温度:375 ℃; 鞘气(N2)流量:12 L/min。

将102种化合物的名称、分子式、CAS号、精确相对分子质量、结构图等信息导入MassHunter PCDL Manager软件(美国Agilent公司)谱库。用已建立的液相色谱及质谱方法采集对照品数据, 将保留时间输入谱库。分别对各化合物[M+H]+峰进行诱导碰撞能量的优化, 得到各化合物的二级碎片离子信息, 再将采集的二级数据通过软件计算进行标准化后导入谱库。所建立标准谱库中各化合物二级碎片均为理论值。各化合物主要二级碎片(m/z)见表 1。

1.3 标准溶液的配制

分别取上述标准品适量, 精密称定, 用甲醇溶解并配制质量浓度为200 μg/L的标准品储备溶液(如不能溶解完全, 可滴加1滴盐酸), 分别取标准品储备液适量混合, 作为标准品混合溶液, 供检测用。

1.4 样品前处理

固态或半固态试样:取适量混匀, 研细, 称取0.50 g于50 mL具塞离心管中, 加入甲醇25 mL, 密塞, 超声提取10 min, 放冷, 用0.22 μm滤膜过滤, 取续滤液, 根据实际浓度适当稀释, 备用。

液态试样:取适量摇匀, 吸取0.5 mL于50 mL具塞离心管中, 加甲醇至25 mL, 密塞, 超声提取10 min, 放冷, 用0.22 μm滤膜过滤, 取续滤液, 根据实际浓度适当稀释, 备用。

软胶囊试样(油性基质):取内容物适量, 混匀, 称取0.50 g于50 mL具塞离心管中, 加乙酸乙酯5 mL, 振摇, 使其分散, 再加甲醇至25 mL, 密塞, 超声提取10 min, 放冷, 用0.22 μm滤膜过滤, 取续滤液, 根据实际浓度适当稀释, 备用。

2 结果与讨论
2.1 流动相条件的优化

比较了0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈、10 mmol/L甲酸铵水溶液-乙腈两种流动相体系对目标化合物分离效果的影响。结果表明, 以含0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈为流动相时, 各待测化合物响应好, 灵敏度高, 离子化效率最佳。

采用梯度洗脱, 为尽量去除极性基质干扰, 流动相起始梯度为5%乙腈, PDE-5抑制剂出峰时间集中在2.7~12.4 min, 分析时间20 min。

2.2 样品前处理方法的考察

考虑大部分PDE-5抑制剂类化合物在甲醇中溶解性较好, 故采用甲醇作为提取溶剂。比较了乙腈的提取效果, 与甲醇提取结果基本一致, 综合考虑成本、试剂毒性等因素, 最终确定甲醇作为提取试剂。含油脂类成分较高的基质, 如油性基质的软胶囊, 先加少量乙酸乙酯, 振摇, 使分散, 再加甲醇超声提取。

比较超声时间, 确定超声10 min即可基本提取完全待测化合物。在实际样品测定中, 宜根据样品添加量的实际浓度, 进行适当的稀释后进样, 避免进样浓度过高, 污染仪器。另外, 复杂的基质如咖啡和中成药等, 适当稀释后进样, 可有效降低基质效应的影响。

2.3 定性结果判定方法

根据已建立的标准谱库进行检索分析。提取供试品溶液中的化合物信息与标准谱库比较, 设置提取质量窗口为20 ppm(20×10-6), 保留时间漂移小于0.5 min。

样品中检出的化合物需通过精确相对分子质量(＜5 ppm)、保留时间(＜0.2 min)、母离子及碎片离子的精确相对分子质量(＜5 ppm)与标准谱库匹配。

2.4 PDE-5抑制剂类特征碎片的归属

PDE-5抑制剂类化合物在实际样品检测中的检出频率最高, 按结构主要分为3类:西地那非、伐地那非和他达拉非类。新型衍生物是那非及相关功效类化合物检出的难点。为迅速识别、判断样品是否添加了PDE-5抑制剂类成分, 本研究对3类结构类型的化合物碎片进行了分类分析。102种化合物所属类别详见表 1。通过Molecular Structure Correlator(美国Agilent公司)软件计算各碎片的可能结构, 结合各类别化合物结构特点, 推测得到各类别化合物质谱裂解机制, 并列出各类别的常见碎片及其结构。图 1~3分别为3种结构类型化合物的共同母核特征及推测的主要碎片结构。表 2为不同亚型的代表化合物的特征碎片及归属。

图 1 西地那非及其衍生物的主要碎片离子裂解机制 Fig. 1 Proposed fragmentation mechanism of sildenafil and its analogues R1-R4, X and Y: substituents.

图 2 伐地那非及其衍生物的主要碎片离子裂解机制 Fig. 2 Proposed fragmentation mechanism of vardenafil and its analogues

图 3 他达拉非及其衍生物的主要碎片离子裂解机制 Fig. 3 Proposed fragmentation mechanism of tadalafil and its analogues

表 2 各亚型典型化合物的主要特征碎片 Table 2 Major product ions of typical compound of each subtypes
2.4.1 西地那非及其衍生物

本研究中西地那非类化合物共61种, 根据其X及Y取代基不同又可分为6个不同亚型:西地那非类(Ss)、硫代西地那非类(Sst)、红地那非类(Sa)、carbodenafil类(Sc)、dithiocarbodenafil类(Scd)和其他类(So)。各亚型化合物特征碎片与结构息息相关, 通过分析各西地那非衍生物碎片信息, 将常见共同碎片归类总结, 并推测其结构如图 1所示[5, 23]。由于化合物取代基不同(尤其Y取代基), 质谱行为略有差异, 但通常同一亚型的裂解行为相似度极高, 实例详见表 2。另外, 西地那非类化合物一般在m/z 150以下碎片丰度较高, 其中包含取代基R3的碎片信息。

2.4.2 伐地那非及其衍生物

伐地那非及其衍生物与西地那非类结构较为接近。本研究中共涉及12种, 可分为3个不同亚型:伐地那非类(Vv)、硫代伐地那非类(Vvt)和acetylvardenafil类(Va)。裂解规律与西地那非类似, 如图 2所示。V6碎片相同裂解机制同样存在于西地那非类衍生物中, 但非主要裂解碎片故未列出; 由于母核中氮原子位置不同, 碎片V5与碎片S5差异明显, 因此为两类衍生物区分的关键信息, 实例详见表 2。而相同碰撞能量下, 伐地那非类化合物m/z 150以下区域碎片丰度及数量通常弱于西地那非类。

2.4.3 他达拉非及其衍生物

他达拉非及其衍生物根据母核可分为两类:有哌嗪二酮环(Tt)及没有哌嗪二酮环(To)。此类化合物与西地那非和伐地那非类结构差异较大, 主要特征碎片离子如图 3所示, 其中T1和T2为两类化合物共有主要碎片。实例详见表 2。

2.5 方法学验证
2.5.1 样品基质影响的考察

根据市场上常见的补肾壮阳、抗疲劳类产品, 选择了玛卡片、功能型饮料、软胶囊、半固体能量胶、蛋白粉、含中药成分胶囊, 饼干、糖果、保健酒、咖啡共10种作为代表性基质。研究发现, 在中药成分胶囊和咖啡中, 由于基质效应影响较大, 导致多个化合物的检出限较其他基质偏高, 但仍远低于一般的非法添加检出剂量, 检出限能够满足检测要求, 详见2.5.3节。

2.5.2 专属性试验

上述10种基质按1.4节中所述方法进行前处理, 经测试上述10种基质中均不含本标准中102种化合物, 对方法无干扰。

2.5.3 检出限试验

如表 3所示，为考察上述100种(化合物49和100在溶液中非常不稳定, 未做检出限试验, 详见2.5.5节)化合物在10种基质中的准确检出限(LOD), 参考GB/T 27417-2017化学分析方法确认和验证指南中要求, 采用目视评价法, 以真实最低检出浓度作为LOD。即分别在各基质中加样, 加样浓度逐级递减, 至恰好能满足2.3节中所述定性检出要求的含量作为LOD, 结果100种化合物的检出限在0.1~50 mg/kg或0.1~50 mg/L之间。

表 3 100种化合物在10种基质中的检出限(n=7) Table 3 Limits of detection (LODs) of the 100 compounds spiked in the 10 matrices (n=7)

从结果可知, 绝大多数化合物的检出限低于50 mg/kg或50 mg/L。极少数化合物的检出限稍高, 与其化学结构相关, 包括含他达拉非及其衍生物、二聚结构和硫代结构普遍稍高, 原因为这几类结构不易离子化; 另与基质也相关, 胶囊剂和咖啡等基质普遍较高, 该类基质复杂, 基质效应严重, 导致检出限稍高。

临床中, 西地那非、他达拉非推荐使用剂量分别为50 mg/次[24]和5~25 mg/次[25]。假设每次服用保健食品以1 g计, 非法添加的含量水平分别为50 g/kg和5~25 g/kg, 本方法的检出限为0.1~50 mg/kg之间, 即使对于多种化合物混合添加或大口服剂量(添加浓度较低)的样品, 亦可完全满足非法添加剂量检测的监管需求。

2.5.4 重复性试验

在检出限水平加样进行重复性试验, 10种基质一式7份, 均检出100种化合物。(化合物49和100在溶液中非常不稳定, 未做重复性试验, 详见2.5.5节。)

2.5.5 稳定性

取玛卡片基质的检出限加样溶液, 分别在1、4、12、24、48 h进样, 上述100种对照品在48 h内均可检出, 稳定性良好。

另两种化合物sildenafil chlorosulfonyl (No. 49)和tadalafiloxo impurity (No. 100)在溶液中即使放置在-20 ℃保存, 稳定性也极差, 故未列入方法学考察中。且目前国内外均未有检出上述两种化合物的报道, 本文仅将其化合物信息及碎片离子列出作为参考。

2.6 实际样品的测定

用本方法在2016年3月~2018年3月期间对1 414批市售样品以及某涉案专项样品进行检测, 在共计458批样品中发现非法添加行为; 共检出西地那非及相关功效化合物19种, 总检出次数464次(见表 4)。并有29批次样品同时添加多种化合物, 其中14批样品存在同时添加其他功效类别情况, 如添加对乙酰氨基、布洛芬、利多卡因等。另外发现2个化合物疑似新型PDE-5抑制剂衍生物, 按照2.5节进行碎片归属。确认其中一个为sildenafil impurity 12 (No. 102), 并将其纳入本方法; 另一化合物的精确相对分子质量为419.148 1, 推测结构式为C23H21N3O5, 疑似氨基他达拉非的衍生物, 正在进行结构确证工作。

表 4 1414批实际样品的测定结果 Table 4 Detection results of the 1414 batches of real samples
3 结论

本研究针对代表性的食品(含保健食品)基质, 建立了超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱定性筛查102种西地那非及其相关功效类非法添加化合物的方法。该方法操作简便、灵敏、准确, 为目前国际上检测化合物覆盖面较广的非法添加物质检测方法, 即将转化为国家食品补充检验方法作为检测标准进行广泛应用。

本文旨在通过高分辨质谱的定性筛查, 及时、有效地发现市场中的非法添加行为及新的添加趋势动态。该方法既可以作为非法添加检测初筛的广谱筛查方法; 又可作为低分辨质谱可疑检测结果的确证方法使用。目前, 该方法已多次用于市局及公安委托的涉案应急检测, 可实现广谱筛查, 有效服务监管, 为打击非法添加、保障食药安全提供了有力的技术支持。

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