薄层色谱(thin layer chromatography, TLC)技术具有简便、经济、快速、定性和半定量检测物质的特性[1], 常用于天然产物、食品、医药和微生物[2-9]等领域的快速分离, 或作为一种样品的前处理手段与其他分析技术进行联用[10-16]。但目前普通TLC在高极性样品展开过程中效率低, 易拖尾, 其圆状点样在展开后往往出现拖尾, 变成椭径向, 甚至形成线状, 影响分离鉴定的准确性; 并且空间利用不足, 大量消耗填充剂和展开剂。以此为出发点, 为改进薄层分离技术, 提高分离鉴定的准确性, 节约资源, 保护环境, 本文提出以径向展开薄层色谱法弥补普通TLC的不足。
径向展开薄层色谱(radial thin layer chromatography, RTLC)法, 也称环形展开, 简称径向展开, 是将样品以实心径向或者环形点样在薄层板上, 流动相从中心向外环形展开, 根据色谱的分配和吸附原理对样品中复杂成分进行分离的一种色谱手段[17]。这一方法在20世纪50年代即有报道[18], 其展开时间短, 能节约薄层板; 展开剂用量少, 较普通TLC精密度高, 在相同条件下, RTLC较普通TLC的分辨率好[19], 可用于分离分析生物样品和异构体[20, 21]。20世纪80年代, 瑞士CAMAG公司研制了径向展开的专用设备[22], 国内也有学者对这一方法进行过探究, 但是这些探究都只是从表面观察RTLC的高效分离行为, 没有采用更精确的数学和测量手段对其分离效能进行量化评价, 更没有探究其分离特性的理论根源[23, 24]。
为了更好地讨论RTLC的分离效能, 在试验过程中选取氯化两面针碱(NC)作为对照品, 进行RTLC二次展开试验。NC是由芸香科花椒属植物两面针的干燥根中提取的一种生物碱[25], NC的极性很强, 在普通TLC中比移值(Rf)小, 很难展开, 往往需要采用大极性的展开剂才能展开, 而且常出现严重的斑点扩散、拖尾、斑点位置漂移等问题, 严重时甚至造成填充剂脱板。
朱砂安神丸(ZSASP)是中药复方重镇安神制剂, 由朱砂、地黄、黄连、当归、甘草这5种单方药材组成[26]。在365 nm下, 其中黄连中的小檗碱、巴马汀显黄色荧光, 药根碱显棕褐色暗斑; 在254 nm下, 有两个黄绿色荧光斑点, 为巴马汀和药根碱[27, 28]。当归在365 nm下有蓝色荧光, 在254 nm下有湖蓝色荧光, 均为阿魏酸(自然光下需用硫酸香草醛显色)[29, 30]。因ZSASP中黄连生物碱成分含量高, 酸碱和氧化等条件会使紫外与荧光减弱或淬灭, 应当避免使用显色剂, 所以在本实验设计过程中只讨论紫外下显色观察情况。
本文组装了简单的径向展开薄层色谱装置, 建立了ZSASP的径向展开薄层色谱检测法, 对其中的生物碱成分进行分离, 研究了RTLC的分离特性。对RTLC和普通TLC的分离效能进行了比对研究, 设计试验进行计算和求解。
ZF-C型三用紫外分析仪(上海康禾光电仪器有限公司); 超声波清洗机(广州市吉普超声波电子设备有限公司); ISO 9001电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)。
ZSASP(批号:16051010, 吉林市鹿王制药股份有限公司); 盐酸小檗碱原料药(CBH)、盐酸小檗碱(BH)化学对照品、盐酸药根碱(JH)化学对照品和盐酸巴马汀(PH)化学对照品均为供含量测定用, 均购自中国药品生物制品检定所; NC化学对照品(纯度98%)购自上海融禾科技发展有限公司; GF254型硅胶(3色分开)购自青岛海立信精细硅胶化工有限公司; 羧甲基纤维素钠、正丁醇、乙酸乙酯均为分析纯, 均购自天津市富宇精细化工有限公司; 氨水(分析纯, 质量分数25%)和冰乙酸(分析纯)购自天津恒兴化学试剂股份有限公司。
ZSASP提取物:取1/2丸ZSASP, 剪碎, 加入30 mL 95%(体积分数, 下同)乙醇, 超声30 min, 过滤; 向过滤后的滤渣中加入20 mL 95%乙醇, 超声20 min, 过滤; 合并滤液, 蒸干, 用甲醇溶解至5 mL。
称取适量的CBH、BH对照品、JH对照品、PH对照品和NC对照品, 分别用甲醇配制成1.5 g/L的溶液。
用溶剂系统A(正丁醇-乙酸乙酯-冰醋酸-水, 7:1:1:1, v/v/v/v)来分离BH对照品、JH对照品、PH对照品、NC对照品和ZSASP提取物; 用溶剂系统B(正丁醇-乙酸乙酯-氨水, 7:1:1, v/v/v)来分离CBH。
使用针头、橡胶塞、玻璃管等组装简单的RTLC装置。将2.5 mL注射器(直径1.0 cm)塑料外管剪开, 并将切口打磨光滑, 将其分为若干等份, 用小刀将分界处切去1~2 mm, 制成分区点样器(见图 1a)。在展开过程中, 在中心处安装一个带孔的盖子, 可以帮助减少环境因素的影响。具体的测试条件可以根据实际测试灵活变动。图 1b是RTLC的示意图。试验过程中用环状工具点出A处所指的环形斑点, 或者用毛细管点出径向斑点, 用输送工具从圆心O处向固定相上输送展开剂, 展开剂沿B处箭头所示各个方向由中心向外展开, 洗脱分离组分。
在研究平面色谱问题时, 可以假想将平面的薄层板卷成一个圆柱体, 那么关于薄层色谱的许多问题便可以借用柱色谱的理论加以解释和分析[25, 26]。
优化了溶剂系统和比例、流速等试验条件。展开剂流速的优化结果表明, 输送展开剂的针头越细, 展开剂流速越慢, RTLC的分离效果越好。此外, 降低点样量也对提高分离效率具有重要的现实意义。
ZSASP提取物经RTLC分离出了3个成分, 如图 2a所示, 通过查阅参考文献[26-29]和使用对照品进行对照, 这3个成分从内到外依次是JH、PH和BH。在该试验中, 采用玻璃圆皿制板, 展开过程中消耗展开剂1.5 mL, 溶剂前沿直径为3.8 cm, 点样圈内径为1.0 cm, 相当于在1.4 cm的距离下展开了3个成分, 具有普通TLC难以达到的极高分离效率。同时, 填充剂和展开剂的用量较普通TLC大大减少, 不但节省了时间和经费, 对实验人员和环境的保护也有一定意义。
在RTLC的实际应用过程中, 单圈径向点样很难应用, 而采用分区点样方式, 配合以径向标尺观察, 则可以提高RTLC的可行性和实用性。本文用自制分区点样器点样, 以诺和力针头(直径0.23 mm)控制展开流速, 以溶剂系统A为展开剂, 以径向玻璃皿为载体进行试验。五分区试验结果见图 2b。点样被分成了5个部分, 样品在经过RTLC后依然均匀分布, 没有发生明显的变形, 分离和展开效果良好。样品的横向长度随着展开距离的增加不断变长。结果表明, RTLC具有同时分离多个样本的潜能。
假设薄层板吸附剂的空隙率为α, 比表面积为β(β=填充剂总表面积/填充剂总体积), 薄层板厚度为h。在分配色谱中, 比移值Rf为任意时刻组分浓度最大点所跨过的固定相颗粒空隙之间的体积Vs(此时斑点移行距离为Ls)与同一时刻流动相前沿所跨过的空间体积(即流动相体积)Vm(此时展开剂移行距离为Lm)之间的比值[31]。在吸附色谱中, 用固定相的表面积(即吸附剂的表面积)Sa替代Vs来完成这一表达。保留时间和吸附平衡常数间用式(1)表达, t0为死时间, tR为组分保留时间, k为保留因子[31]。Ka为吸附色谱的吸附平衡常数, 也叫吸附系数, 其数值大小仅与吸附剂的活性、组分的性质和流动相的性质有关, 即在相同色谱条件下, 其数值为定值[31]。
在TLC中, 假设薄层色谱展开后对组分起作用的板宽为A, 则普通TLC的比移值RfL见式(2)。在RTLC中, 点样为实心圆点(忽略其半径), 样品展开半径为r1, 溶剂前沿半径为r2, RTLC的k表达式为式(3), RTLC的比移值Rfr表达式为式(4)。吸附剂颗粒半径越小, 比表面积越大, 其保留因子就越大, 分离吸附能力也相应提高。分配系数与展开距离比的二次方成正比关系。由式(4)可知, 在使用同一吸附剂且制板技术稳定的情况下, (1-α)β/α可以近似视为恒定值。假设在相同分离条件下, 对于同一物质的分离, 当RTLC和普通TLC达到等比移值时, 可得式(5)。定义斑点移动距离和流动相移动距离之比为展开位移比dr, 则普通TLC中的展开位移比drL为式(6), RTLC中的展开位移比drr为式(7)。在展开位移比相同的情况下, 可推导出RfL和Rfr存在式(8)中的关系。以Rf为纵坐标, 以dr为横坐标, 二者的关系图见图 3。
按照一般薄层分离要求, 认为当Rf在0.3~0.5之间时可以取得较好的分离效果, 在0.2~0.8之间时可以取得可接受的分离效果[31]。在图 3中, 当RfL在0.3~0.5之间时, drr在a到b之间, drL在c到d之间。因此在达到相同比移值时, RTLC拥有更低的展开位移比。在展开位移比相同时, RTLC有较大的比移值, 故RTLC在较小的移动范围内就可以达到较好的比移值, 可以让在普通TLC中比移值较小的、比较难以展开的生物碱类样品的展开斑点落在适宜的观测范围内, 即RTLC更适用于展开大极性的样品。
在实际实验中, 由于RTLC随着固定相表面积的梯度增加会导致毛细力产生梯度增大趋势, 这一趋势会弥补样品斑点的纵向扩散, 不会导致样品斑点的充分展宽。结合RTLC的特点, 对其斑点宽度和面积变化规律讨论如下。
状态一:如图 4a所示, 点样斑点半径为r, 点在圆心处作径向离心展开。当流动相前沿恰好走到斑点外半径ro位置时, 如图 4b所示, 径向斑点恰好被压缩为圆环状, 其内半径为斑点内半径ri, 则有式(9)所示的关系, 在吸附色谱中Sa等同于分配色谱中的Vs, 将式(10)和式(11)代入式(9)中得式(12)。由式(12)得式(13), 整个样品圆环斑点总面积S0为式(14)。
状态二:如图 4c所示, 当流动相前沿走到任意位置LM时, 若仅考虑压缩效应, 不考虑其他因素引起的斑点增宽, 用Li和Lo分别表示新圆环的内外半径, 则有式(15~17)。由式(17)可得式(18)。
从状态一到状态二, 原来位于ro处的样品刚好走到Lo处, 位于ri处的流动相此时已经走到了LM处, 根据式(9)中的规律可以得到式(19), 由式(19)可得式(20), 新的圆环斑点总面积S1为式(21)。
式(21)与式(14)结果一样, 这表明在RTLC中, 尽管斑点形状一直在不断径向前行变化, 但圆环斑点总面积是恒定的。
定义圆环斑点宽度W为斑点在展开方向上的展开距离最大点与展开距离最小点之间的差值[31], 则在RTLC中, 圆环斑点宽度是圆环斑点的外半径和内半径之差。设圆环斑点在某一位置时斑点内半径为ri1, 外半径为ro1, 内外半径的均值为ra1, ra1同时是此时斑点的移动距离。圆环斑点宽度为W1, 圆环斑点面积为Sx, 持续展开至另一位置时, 圆环斑点内半径为ri2, 外半径为ro2, 内外半径的均值为ra2, ra2同时是此时圆环斑点的移动距离, 圆环斑点宽度为W2, 则有:
在RTLC中, 当展开达到动态平衡时, 环面积不变, 圆环斑点宽度Wr与环半径r成反比, 随展开距离的增大, Wr将不断地减小, 同时斑点的横向长度不断增大。即假设样品点样在距圆心5 mm处, 展开后样品距圆心30 mm, 则由上述关系可知, 圆环斑点的横向长度会扩大为原来的6倍, 而圆环斑点宽度则压缩为原来的1/6, 这与RTLC所提供的色谱空间不断增大有关, 可以有效降低拖尾现象, 增大分离度(R), 使圆环斑点清晰明显, 可以在极短展开距离内实现尽可能多的化学成分的分离。
分离度是平面色谱的重要分离参数, 是相邻两斑点中心距离d与两斑点平均宽度的比值。用W1和W2表示相邻两斑点宽度, L1和L2表示相邻两斑点的移动距离, 参考文献[32]有:
在普通TLC中, 忽略斑点的扩散和拖尾, 可假设斑点宽度一致, 均为WL, 相邻两斑点距离为dL, 则其分离度RL为:
在RTLC中, 用ra1和ra2表示相邻两个圆环斑点的移动距离, 相邻两圆环斑点宽度为Wr1和Wr2, 圆环斑点距离为dn, 由式(22)和式(23)可以推知其分离度Rr为式(25):
对比可知, 当dn等于dL, 且Wr1与WL相同时, RTLC的分离度比普通TLC要大。
色谱系统的分离效能常用理论塔板数(N)或理论塔板高度来定量描述。在薄层色谱中, 可按式(26)计算[33], X是圆环斑点移动距离, Wn是圆环斑点宽度。普通TLC的理论塔板数可以直接用式(26)表示。在RTLC中, 以rx表示圆环斑点移动距离, Wx表示此时的圆环斑点宽度, S0表示圆环斑点点样面积, 由式(22)和式(26)可以得到RTLC的理论塔板数Nr, 见式(27)。
在普通TLC中, 理论塔板数和圆环斑点的移动距离平方成正比关系, 与圆环斑点宽度平方成反比; 而RTLC中, 理论塔板数与圆环斑点移动距离的4次方成正比, 与圆环斑点面积平方成反比。改进技术、减少点样量和控制点样时斑点面积的前提下, 随着斑点展开距离的增大, RTLC的理论塔板数比普通TLC要高很多。
为了验证上述理论过程, 设计了CBH、ZSASP、NC的普通TLC和RTLC试验, 采集了相关参数。结果表明, 在CBH的普通TLC试验中, 只得到了一个大的斑点, 并且伴有严重拖尾和扩散, 在CBH的RTLC中, 得到了2个斑点, 经过HPLC检测, 推测这两个斑点是BH及CBH中的相关杂质成分。在ZSASP的普通TLC和RTLC中都成功地对其中的3个生物碱成分进行了分离, 斑点从内到外依次为JH、PH和BH。
控制截距为0, 以RTLC的比移值为横坐标(x1), 以普通TLC的比移值为纵坐标(y1)进行二次数据拟合。其拟合方程为y1=0.96x12-0.71x1, R2=0.989 3。对相应的RTLC和TLC的比移值进行显著性检验数据分析, RTLC的比移值与普通TLC的比移值之间存在显著差异, 且RTLC的比移值比普通TLC的比移值要大, 即RTLC可以使原本在普通TLC中难以分离的大极性样品得到适宜的分离, 结果见表 1。
控制截距为0, 以普通TLC的分离度为横坐标(x2), 以RTLC的分离度为纵坐标(y2)进行数据拟合。其拟合方程为y2=1.55x2, R2=0.922 5。对试验中采集的ZSASP的RTLC和普通TLC数据进行统计分析表明, RTLC的分离度和普通TLC的分离度之间存在显著性差异, 且RTLC的分离度比普通TLC高, 见表 2。
为了验证2.2.2节中关于面积和圆环斑点宽度的推导过程, 设计了NC对照品的RTLC二次展开试验进行验证。这一部分试验数据采集的最理想手段应该是采用计算机图片识别方法来获取目标数据, 但是由于技术手段的限制, 采取了直接手动测量展开圆斑内径和外径的方式来计算内径和外径的移动情况、圆环斑点的宽度和面积的变化情况。并就此对第1次和第2次RTLC的圆环斑点宽度和面积进行了数据拟合和显著性检验(见表 3)。同样控制截距为0, 以第1次RTLC的圆环斑点面积(x3, 单位cm2)为横坐标, 以第2次RTLC的圆环斑点面积(y3, 单位cm2)为纵坐标, 拟合得到y3=0.95x3, R2=0.962 9。显著性检验表明, 第1次和第2次RTLC的圆环斑点宽度存在显著差异, 并且圆环斑点宽度随着展开距离的增加而被压缩了。而两次展开的圆环斑点面积并不存在显著差异, 也就是说当分离达到平衡后, 斑点的面积是不发生改变的。展开试验的结果为理论计算的结论提供了有利支持。
RTLC随着固定相表面积的梯度增加会导致毛细力产生梯度增大趋势, 使得斑点的纵向扩张能力增强, 在展开方向上的压缩增强, 很少出现拖尾, 使RTLC比普通TLC试验的清晰度和准确度更高。相同样品在相同固定相和流动相下, RTLC的分离度比普通TLC大, 拥有更高的分离效率。RTLC的比移值比普通TLC大, 更适用于大极性样品的分离鉴定。载体用量省, 展开剂用量小, 可以节约试剂成本, 并降低对试验人和环境的伤害。目前, RTLC的多样本分离已经取得了很好的效果, 但是多样本同时定性尚未取得重大突破。在分区点样展开的可行性的启发下, 多样本同时定性技术的进一步突破也将极大地扩展RTLC的应用范围, 值得进一步探索。在理论推导和试验验证中, 存在诸多的假设和取舍, 可为理论创新提供新的方法和思路。随着点样和定量等辅助技术的进一步发展, 径向薄层色谱技术将在平面色谱快速分离和样品预处理的应用方面大放异彩。
2018,
Vol. 36 Issue (10): 1045-1052
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