液液微萃取技术(liquid-liquid microextraction, LLME)是20世纪90年代Jeannot等^[1]在传统液液萃取的基础上提出的新型样品前处理技术。该技术经过多年的发展, 不断改进, 从最初的单滴液液微萃取(single drop microextraction, SDME)^[1]到中空纤维液液微萃取(hollow-fiber-protected liquid-phase microextraction, HF-LPME)^[2-4]、分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)^[5-7], 再到近年来基于可变亲水性试剂的均相液液微萃取(switchable-hydrophilicity solvent homogeneous liquid-liquid microextraction, SHS-LLME)^[8]。与传统液液萃取相比, 液液微萃取具有操作简便、萃取效率高、富集效果好、耗时少、所需有机溶剂少等优点, 属于环境友好型前处理技术。

SHS-LLME是2010年Jessop等^[8]提出的绿色高效的萃取技术, 该技术使用的萃取剂是一类可变的亲水性试剂, 主要包括二丙胺(dipropylamine, DPA)、三乙胺(triethylamine, TEA)、N, N-二甲基丁胺(N, N-dimethylbutylamine, DMBA)、N, N-二甲基环己胺(N, N-dimethylcyclohexylamine, DMCHA)等^{[9, 10]}, 它们在二氧化碳气体存在下能够与水相互溶形成均相体系。但是当体系中通入空气或者加热时, 这类亲水性试剂会转换成疏水性试剂, 实现两相分离。这是由于在CO₂存在的情况下, 可变亲水性试剂会在水中与CO₂反应生成碳酸氢盐, 形成与水相互溶的均相体系。当加热或者通入空气等其他气体的时候, CO₂容易被置换溢出, 可变亲水性试剂重新转变成疏水性试剂, 使均相体系又转变为两相体系, 实现有机相的分离, 从而完成萃取过程。该类试剂的亲水性和疏水性变换可以通过调节pH值来完成, 在短时间内形成含有无数有机小液滴的乳浊液, 实现两相的最大接触, 提高萃取效率。目前, 该萃取技术已经被应用到多个领域^[11-14]。

2′-氯地西泮属于苯二氮卓类药物, 在20世纪60年代被首次合成出来^[15], 由于它的安全问题而未被允许进行临床试验, 因此在全球范围内均未被批准作为药物来使用。它具有抗焦虑、抗惊厥、镇静和肌肉松弛等作用^{[16, 17]}。近年来该药物在网络上非法销售, 并被不法分子用来实施抢劫、强奸等犯罪活动。目前, 生物检材中2′-氯地西泮的前处理方法主要有直接过滤进样法^[18]和液液提取法^{[19, 20]}等, 主要的检测方法有液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)^[18-20]和毛细管电泳-串联质谱法(capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry, CE-MS/MS)^[21]等。

本文旨在将SHS-LLME技术应用到法庭科学领域, 并用盐酸和氢氧化钠代替CO₂调节pH值, 实现亲水性和疏水性的切换, 达到萃取的目的。最终建立SHS-LLME联合气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS), 分析尿液中的2′-氯地西泮, 并对该方法进行评价。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

Trace 1310-ISQ LT气相色谱质谱仪(美国赛默飞世尔科技); TDL-80-2B离心机(上海安亭科学仪器厂); SK-1快速混匀器(金坛市顺华仪器有限公司); 氮吹仪(上海安普科学仪器有限公司)。

1.1.2 试剂

二丙胺、三乙胺、N, N-二甲基环己胺、无水乙醇(均为色谱纯, 百灵威公司); 盐酸、氢氧化钠(均为分析纯, 上海化学试剂有限公司); 2′-氯地西泮(纯度98.4%, 挪威Chiron公司); 蒸馏水。

1.1.3 仪器条件

色谱柱:VF-5ms(30 m×0.25 mm×0.25 mm); 柱温:120 ℃, 保持1 min, 20 ℃/min升至280 ℃, 保持4 min; 载气:He; 流速:1.0 mL/min; 进样口温度:280 ℃; 进样量:1 μL, 不分流进样。离子源温度:300 ℃; 传输线温度:280 ℃; 离子源:EI; EI电压:70 eV; 扫描范围:45~450 amu; 溶剂延迟:4 min; 全扫描模式(full scan)采集总离子流色谱图。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

空白尿液由近期未服用任何药物的健康自愿者提供, 在-18 ℃的冰箱中保存, 使用前在室温下解冻。

1.2.2 均相亲水性试剂的制备

分别将DPA、TEA、DMCHA与6 mol/L HCl按照体积比1:1.4配制成均相的亲水性试剂, 每份均相亲水性试剂配制50 mL, 备用。

1.2.3 SHS-LLME微萃取过程

取2.0 mL待测样品于5 mL玻璃试管中, 首先加入1.2.2节中配制的均相亲水性试剂, 与待测样品混匀, 形成均相体系; 然后加入6 mol/L的NaOH溶液, 亲水性试剂迅速转变成疏水性试剂, 产生无数有机小液滴, 使整个体系快速形成乳浊液, 实现两相分离, 完成萃取过程。以3 000 r/min的速度离心5 min, 提取上层有机相, 在氮气流下吹干, 用50 μL无水乙醇复溶, 待测。萃取流程详见图 1。

图 1

Fig. 1

图 1 SHS-LLME萃取流程图 Fig. 1 Procedure of the switchable hydrophilictiy solvent homogeneous liquid-liquid microextraction (SHS-LLME) DMCHA: N, N-dimethylcyclohexylamine.

2 结果与讨论

在SHS-LLME微萃取过程中, 有许多参数影响着萃取效率。本文主要对HCl的用量、SHS的种类、均相SHS的用量、NaOH的用量、萃取时间等参数进行考察, 并对所建立的实验方法进行方法学评价。

2.1 实验参数考察

2.1.1 HCl的用量

多数文献^[22-25]报道是通过加入干冰的形式获得均相亲水性试剂。由于干冰不易保存, 在配制过程中存在一定困难。因此, 本文中使用HCl替代干冰制备均相亲水性试剂。按照SHS与HCl(6 mol/L)体积比分别为1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5配制。结果发现:当SHS与HCl的体积比为1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3时, SHS仍然存在分层现象, 不能形成均相体系; 当体积比达到1:1.4和1:1.5时, SHS与HCl互溶, 形成均相体系。考虑到如加入较多的HCl, 在后续的实验中就需要加入较多的NaOH进行中和。因此, 按照SHS与HCl体积比1:1.4配制均相亲水性试剂。

2.1.2 SHS的种类

亲水性试剂需要满足以下两个条件才具备可切换的性质:第一, 正辛醇/水分配系数(log K_ow)大约在1.2到2.5之间; 第二, 酸度系数pK_a大于9.5。根据资料, 显示DPA的log K_ow=1.64, pK_a=11.05; TEA的log K_ow=1.47, pK_a=10.68; DMCHA的log K_ow=2.04, pK_a=10.48; 3种试剂均具备可切换亲水性试剂的性质^[10]。因此, 本实验选取这3种亲水性试剂作为考察对象, 进行优化选择。

根据单一变量的考察模式, 在其他实验条件固定不变的情况下, 空白添加样品中分别加入300 μL 1.2.2节中配制的DPA、TEA、DMCHA均相亲水性试剂, 按照1.2.3节操作, 比较2′-氯地西泮的峰面积, 选择最佳SHS种类。结果发现, 加入TEA的样品中, 随着pH值的改变, 并未产生有机相的分离现象, 无法满足实验需要。比较DPA和DMCHA的萃取效果, 发现以DMCHA为萃取剂进行分析的样品获得的萃取效果最好, 峰面积最大。因此, 选择DMCHA为最佳亲水性试剂。

2.1.3 均相DMCHA的用量

在SHS-LLME萃取过程中, 均相DMCHA的用量直接影响着萃取效率。为了获得最佳的均相DMCHA用量, 在其他实验条件不变的情况下, 分别考察了100、200、300、400、500 μL的用量, 实验结果见图 2。随着均相DMCHA用量的增加, 2′-氯地西泮的峰面积也随之增加; 当用量达到400 μL时, 峰面积基本达到最大; 随着用量继续增加到500 μL, 峰面积基本保持在一个平衡的状态。因此本实验选取均相DMCHA的最佳用量为400 μL。

图 2

Fig. 2

图 2 均相DMCHA的体积对萃取效率的影响 Fig. 2 Efficiency of the volume of homogeneous N, N-dimethylcyclohexylamine (DMCHA)

2.1.4 NaOH的用量

在SHS-LLME萃取过程中, NaOH的主要作用是中和HCl、调节pH值。加入NaOH能使亲水性DMCHA转换成疏水性DMCHA, 实现两相分离, 完成萃取过程。因此NaOH的用量直接影响萃取效率。

在其他实验条件不变的情况下, 分别加入200、300、400、500 μL的NaOH(6 mol/L), 考察NaOH的最佳用量。实验结果表明:随着加入NaOH体积的增加, 2′-氯地西泮的峰面积也增大; 当体积增大至300 μL以后, 2′-氯地西泮的峰面积基本保持平衡。因此, 选择300 μL作为NaOH的最佳用量。

2.1.5 萃取时间

在SHS-LLME萃取过程中, 萃取时间被定义为从加入NaOH到离心前的时间间隔。在其他实验条件不变的情况下, 分别考察了不同萃取时间(1、2、3、4、5、10 min)对萃取效率的影响。结果表明, 在不同萃取时间下, 2′-氯地西泮的峰面积基本保持在一个平衡状态。这表明, SHS-LLME萃取过程短时间内就迅速达到了平衡。这是由于均相的DMCHA与样品混溶, 当加入NaOH时, HCl被迅速中和, 与此同时, 亲水性的DMCHA快速转换为疏水性的DMCHA, 形成无数有机小液滴, 使整个样品溶液变成乳浊液, 从而实现有机相与水相充分接触, 2′-氯地西泮能够在短时间内由样品中转移到DMCHA中, 快速完成萃取过程。所以, 在SHS-LLME萃取过程中, 萃取时间对萃取效率基本没有影响, 因此, 本实验选择的萃取时间为不少于1 min。

2.2 方法学评价

在最佳实验条件下, 空白尿液和空白加标尿液的总离子流色谱图见图 3, 2′-氯地西泮的保留时间为10.34 min, 定性离子为m/z 283、318、290、255, 定量离子为m/z 283。

图 3

Fig. 3

图 3 空白尿液和空白加标尿液(0.25 mg/L 2′-氯地西泮)的总离子流色谱图 Fig. 3 Total ion chromatograms of blank urine, and spiked blank urine (0.25 mg/L diclazepam)

2.2.1 工作曲线与检出限

以空白尿液为基体, 分别配制2′-氯地西泮质量浓度为0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5 mg/L的系列工作液, 按照优化的实验条件进行检测, 每个样品平行测定2次, 取平均值。以2′-氯地西泮的峰面积(y)为纵坐标, 质量浓度(x, mg/L)为横坐标绘制工作曲线。线性回归方程为y=1.86×10⁸x-1.18×10⁶, 相关系数r²=0.994 6, 线性范围为0.025~2.5 mg/L。通过3倍信噪比(S/N)得出检出限为0.007 mg/L。

2.2.2 精密度与回收率

取空白尿液, 分别配成0.05、0.25、1.0 mg/L 3个水平的工作液, 用于计算日内回收率和日间回收率。结果见表 1, 回收率为76.5%~90.3%, 日间精密度为3.6%~5.0%, 日内精密度为3.3%~6.5%。

表 1 (Table 1)

表 1 2′-氯地西泮在尿液中3个水平的加标回收率(n=6) Table 1 Spiked recoveries of diclazepam in urine samples (n=6) Analyte Spiked/(mg/L) Intraday recovery/% Interday recovery/% Diclazepam 0.05 87.9±4.7 90.3±5.0 0.25 80.6±6.5 76.5±3.9 1.0 84.9±3.3 84.3±3.6

表 1 2′-氯地西泮在尿液中3个水平的加标回收率(n=6) Table 1 Spiked recoveries of diclazepam in urine samples (n=6)

2.3 实际样品检测

采用本实验所建立的方法, 对疑似被迷奸的受害人尿液进行分析。结果, 在受害人的尿液中检出2′-氯地西泮, 同时还检出地洛西泮和劳拉西泮。总离子流色谱图和质谱图见图 4。

图 4

Fig. 4

图 4 尿液中劳拉西泮、2′-氯地西泮和地洛西泮的总离子流色谱图和质谱图 Fig. 4 Total ion chromatogram and mass spectra of lorazepam, diclazepam, and delorazepam in urine

由于2′-氯地西泮的含量低于本实验方法的定量限, 因此无法计算含量。根据Moosmann等^[16]的研究, 2′-氯地西泮在体内首先代谢为地洛西泮和洛甲西泮, 然后进一步代谢为劳拉西泮。由此可见, 本实验方法既能检测尿液中的2′-氯地西泮, 还能检测2′-氯地西泮的代谢产物, 能够满足实际案件的检验需要。

2.4 与文献方法对比

将实验结果与文献方法进行对比(见表 2), 本方法选用GC-MS进行分析, 灵敏、准确, 回收率、线性范围、灵敏度均能满足实际检验需求。

表 2 (Table 2)

表 2 本方法与文献方法的对比 Table 2 Comparison of the present method with previously reported methods Pretreatment method Analytical method Recovery/% Linear range/(μg/L) Reference Filtration LC-MS/MS 89.2-93.2 2-200 [18] LLE UHPLC-MS 84.4-99.2 0.5-1000 [19] LLE CE-MS/MS 67.5-80.5 5-600 [21] SHS-LLME GC-MS 76.5-90.3 25-2500 this work LLE: liquid-liquid extraction.

表 2 本方法与文献方法的对比 Table 2 Comparison of the present method with previously reported methods

3 结论

本工作采用SHS-LLME结合GC-MS法分析尿液中的2′-氯地西泮。以DMCHA为可切换亲水性试剂, 使用HCl和NaOH代替CO₂实现DMCHA由亲水性到疏水性的转换, 完成萃取过程。该方法操作简单、快捷、线性范围良好, 回收率和精密度均能满足检验需求, 能够运用于实际案件中2′-氯地西泮的分析检验, 为该萃取技术在法庭科学领域的应用提供参考。

参考文献

[1]	Jeannot M A, Cantwell F F. Anal Chem, 1996, 68(13): 2236. doi: 10.1021/ac960042z
[2]	Shen G, Lee H K. Anal Chem, 2002, 74(3): 648. doi: 10.1021/ac010561o
[3]	Chen X, Bai X H, Wang X, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2010, 28(12): 1144. 陈璇, 白小红, 王晓, 等. 色谱, 2010, 28(12): 1144.
[4]	Hu M Z, Lian X H, Liu H, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(11): 1145. 胡明珠, 连显会, 刘晗, 等. 色谱, 2017, 35(11): 1145.
[5]	Rezaee M, Assadi Y, Hosseini M R M, et al. J Chromatogr A, 2006, 1116(1/2): 1.
[6]	Meng L, Zhu B L, Zheng K F, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(3): 304. 孟梁, 朱彬玲, 郑可芳, 等. 色谱, 2015, 33(3): 304.
[7]	Wang X X, Li X, Xiao Y X. Chinese Journal of Chromatography, 2018, 36(3): 292. 王璇璇, 李潇, 肖玉秀. 色谱, 2018, 36(3): 292.
[8]	Jessop P G, Phan L, Carrier A, et al. Green Chem, 2010, 12(5): 809. doi: 10.1039/b926885e
[9]	Jessop P G, Kozycz L, Rahami Z G, et al. Green Chem, 2011, 13(3): 619. doi: 10.1039/c0gc00806k
[10]	Vanderveen J, Durelle J, Jessop P. Green Chem, 2014, 16(3): 1187. doi: 10.1039/C3GC42164C
[11]	Naeemullah, Tuzen M, Kazi T G, et al. Anal Methods, 2016, 8(13): 2756. doi: 10.1039/C6AY00278A
[12]	Ezoddin M, Abdi K, Lamei N. Talanta, 2016, 153: 247. doi: 10.1016/j.talanta.2016.03.018
[13]	Rameshgar J, Hasheminasab K S, Adlnasab L, et al. J Sep Sci, 2017, 40: 3114. doi: 10.1002/jssc.201700141
[14]	Lasarte-Aragones G, Lucena R, Cardenas S, et al. J Sep Sci, 2015, 38(6): 990. doi: 10.1002/jssc.201401224
[15]	Earl R, Henryk S L. United States Patent, 3136815. 1964-06-09
[16]	Manchester K R, Lomas E C, Waters L, et al. Drug Test Anal, 2018, 10(1): 37. doi: 10.1002/dta.v10.1
[17]	Babbini M, Gaiardi M, Bartoletti M. Life Sci, 1979, 25(1): 15. doi: 10.1016/0024-3205(79)90484-3
[18]	Pettersson B M, Helander A, Beck O. J Chromatogr B, 2016, 1035: 104. doi: 10.1016/j.jchromb.2016.08.047
[19]	Tomkova J, Svidrnoch M, Maier V, et al. J Sep Sci, 2017, 40(9): 2037. doi: 10.1002/jssc.v40.9
[20]	Moosmann B, Bisel P, Auwarter V. Drug Test Anal, 2014, 6(7/8): 757.
[21]	Svidrnoch M, Boranova B, Tomkova J, et al. Talanta, 2018, 176: 69. doi: 10.1016/j.talanta.2017.08.010
[22]	Boyd A R, Champagne P, McGinn P J, et al. BioresourceTechnol, 2012, 118: 628. doi: 10.1016/j.biortech.2012.05.084
[23]	Wang S, Zheng C C, Zhao J H, et al. Chem Eng Res Des, 2017, 128: 27. doi: 10.1016/j.cherd.2017.09.036
[24]	Bazel Y, Reclo M, Sandrejova J. J Anal Chem, 2017, 72(10): 1018. doi: 10.1134/S1061934817080032
[25]	Zhang S, Chen B B, He M, et al. Microchem J, 2018, 139: 380. doi: 10.1016/j.microc.2018.03.017