碘帕醇是一种非离子型水溶性碘造影剂, 具有良好的显影作用, 对血管壁及神经组织毒性小, 不良反应少, 性质稳定, 适用范围广, 主要用于神经放射学、血管造影术、泌尿系统造影术、CT检查中增强扫描、关节造影术、数字减影血管造影术[1-3]。美国药典(USP)40版[4]、欧洲药典(EP)9.0版[5]和日本药典(JP)17版[6]均收录了此品种。
碘帕醇分离纯化困难, 原因在于粗品中含有较多结构相似的杂质(A~K结构见图 1[5])。美国药典[4]和欧洲药典[5]都对其含量做了严格的限定。EP 9.0版[5]规定, 有关杂质A、B、C、D、E、F、G、J和K的单一杂质峰面积不得高于总峰面积的0.1%, 有关杂质H和I的峰面积之和须小于总峰面积的0.5%。关于碘帕醇的分离纯化研究报道相对较少[7, 8]。目前, 碘帕醇生产中使用大孔吸附树脂吸附法, 该方法生产周期长, 分离柱效低, 自动化程度不高, 工艺稳定性不好, 不利于产品质量的控制[9]。同时, 树脂再生还会产生大量的废水, 不利于环保。因此, 发展一种快速、稳定、高效、环保的分离纯化技术是相关生产厂家的迫切需求。
高效液相色谱法采用粒度均匀的小颗粒填料, 具有高于大孔树脂的柱效, 同时可采用自动化的仪器设备实现精确流速和在线监测。在碘帕醇的工业生产上使用这种更加先进的分离技术, 可有效提高其生产水平。本文基于HPLC技术, 分别考察了固定相种类、柱温和上样量对样品分离的影响, 并将优化后的条件放大到制备水平上, 对碘帕醇料液进行分离纯化。同时考察了各个杂质的分布和收集策略, 在保证高回收率的条件下, 获得高纯度的碘帕醇样品。
碘帕醇料液及馏分分析采用Agilent 1260 Infinity Ⅱ液相色谱系统(美国Agilent公司); 碘帕醇料液纯化采用动态轴向加压纯化系统DAC-HB50(江苏汉邦科技有限公司)。
色谱条件优化中采用的两款不同键合量C18填料均购于浙江华谱新创科技有限公司, 粒径10 μm, 孔径10 nm, 键合量(含碳量)分别为13.7%(C18-1)和11.5%(C18-2), 装填250 mm×4.6 mm的色谱柱。
碘帕醇及制备馏分分析所用乙腈和超纯水均为美国Sigma-Aldrich色谱纯溶剂。分析柱为Zorbax SB-phenyl (250 mm×4.6 mm, 5 μm), 购于美国Agilent公司。
碘帕醇料液纯化所用甲醇为工业甲醇, 水为纯化水(车间自制)。
碘帕醇料液由浙江司太立制药股份有限公司车间合成, 碘帕醇色谱纯度为86.16%。
碘帕醇料液的纯化:制备料液为碘帕醇车间生产料液, 经外标定量后测定的碘帕醇质量浓度为230 g/L。制备水平采用与分析条件优化时相同的固定相C18-1(10 μm); 称取330 g, 装填制备柱(制备柱型号为DAC-HB50, 内径为50 mm), 装填高度约270 mm。流动相A为水, B为甲醇。线性梯度洗脱:0~60.0 min, 100%A; 60.0~60.5 min, 100%A~20%A; 60.5~80.0 min, 20%A。流速:60 mL/min; 柱温:20 ℃; 检测波长:240 nm; 碘帕醇料液的进样体积:6.5 mL; 收集方式:36~60 min收集8个馏分(见表 2)。
碘帕醇料液及制备馏分中杂质的分析:采用EP 9.0版[5]规定的碘帕醇有关物质的液相色谱测定方法, 对料液和纯化后的各个馏分进行分析, 具体方法如下。Zorbax SB-phenyl色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm); 流动相A为水, B为乙腈-水(50:50, v/v)。线性梯度洗脱:0~18 min, 100%A; 18~40 min, 100%A~62%A; 40~45 min, 62%A~50%A; 45~50 min, 50%A~100%A; 50~60 min, 100%A。流速:2.0 mL/min; 柱温:60 ℃; 检测波长:240 nm; 进样体积:20 μL。
碘帕醇料液中碘帕醇有关物质的色谱图见图 2, 碘帕醇的色谱纯度为86.16%。按照文献[5]规定的相对保留时间(RRT)比对各个杂质(见表 1)。杂质I和H、K、C、J、A、E、F的色谱峰面积百分比分别为0.28%、0.11%、0.13%、0.10%、0.35%、0.40%、0.37%。另外, 色谱峰面积百分比超过0.1%的杂质还有7个, RRT分别为:0.21、0.25、0.52、2.25、2.45、2.74, 对应的色谱峰面积百分比分别为:7.86%、1.60%、0.68%、0.10%、0.11%、0.12%、0.14%。可见, 碘帕醇料液未达到杂质限量要求[5], 需对料液做进一步的纯化, 降低杂质含量。
碘帕醇是一种极性较强的化合物, 在传统C18固定相上保留较弱, 不易与杂质分离。本实验选择了两款不同键合量的C18固定相(C18-1和C18-2), 均具有良好的水浸润性, 能在纯水条件下使用[10, 11]。故实验以水作为流动相, 比较了碘帕醇在这两种固定相上的分离情况。如图 3所示, 碘帕醇在C18-1上的保留(容量因子(k)=13.11)强于C18-2(k=8.73)。因此, 实验选择C18-1作为碘帕醇料液分离纯化的固定相, 纯水作为初始流动相。此外, 使用纯水作为碘帕醇的洗脱溶剂有利于碘帕醇样品的溶解, 满足后续的放大生产要求, 也体现了经济环保的特点。
柱温是HPLC的一个重要条件, 它对k值存在明显的影响[12-14]。根据Van’t Hoff方程, 大多数溶质分子的保留会随着温度的变化而变化, 且可用公式(1)表达:
对于特定的溶质分子, A和B是独立于温度的常数, T代表温度(K)。实验考察了柱温为15、20、25和30 ℃时碘帕醇保留的变化。如图 4所示, 随着柱温的升高, 碘帕醇的保留逐渐减弱, 分离效果变差。将保留因子与柱温按式(1)进行拟合, 可得:log k=0.002 1+0.001 1/T, 线性相关系数R2=0.999 2, 结果表现出良好的线性关系。较低的柱温有利于样品的分离, 然而对于生产来说温度过低, 生产周期增长, 生产效率降低, 同时能耗也会增加。因此, 选择温度为20~25 ℃对于生产控制是较为合适的。
上样量在制备色谱中也是一个关键因素。随着上样量增加, 色谱峰变宽, 从而可能影响主峰与杂质的分离度, 降低制备样品的纯度[15, 16]。本实验在0.23~23 mg范围内考察了上样量对峰形变化的影响(见图 5)。当上样量为0.23 mg时, 主峰峰形呈现良好的对称性(对称因子为1.10)。随着上样量增加, 色谱峰向前展宽。当上样量增加到一定程度时, 前杂会与主峰发生交叉, 影响主峰纯度。因此在放大制备过程中要选择合适的上样量, 以便获取高纯度的样品。
在4.6 mm内径的分析柱上进行条件优化后, 在DAC50纯化系统上开展了放大制备实验, 制备条件见1.2节, 制备谱图如图 6所示。
碘帕醇料液在制备水平同样得到了较好的分离。为了进一步考察碘帕醇主峰(保留时间为36~60 min)与有关杂质的分离情况, 对该时间段的样品进行了分段收集, 共获得8个馏分, 直接进液相色谱检测。HPLC结果显示, 杂质K、杂质C和杂质A均未检出, 杂质I和H、杂质J、杂质E和杂质F在各个馏分中的色谱峰面积百分比与原料相比都有显著的降低(见表 2)。
54~58 min和58~60 min两个馏分中, 杂质J的色谱峰面积百分比都超过了0.1%。因此, 本文将保留时间36~54 min的馏分合并, 进行HPLC检测, 有关杂质A、B、C、D、E、F、G、J、K均未检出, 杂质I和H的峰面积百分比为0.22%(见图 7), 相关物质含量符合限量规定(杂质I和H＜0.5%, 杂质J、E、F＜0.1%)。对该馏分进行回收率计算, 结果表明碘帕醇的色谱纯度为98.97%, 碘帕醇的回收率可达93.44%。经过制备HPLC纯化, 可以在保证高回收率的条件下有效降低杂质水平。
本实验基于制备液相色谱法, 考察不同色谱固定相、柱温及上样量对碘帕醇的保留与分离的影响, 优化碘帕醇分离纯化参数, 并放大到制备水平, 考察碘帕醇的纯度及杂质分布情况, 得到了高纯度的碘帕醇样品。所得样品质量稳定可控、关键杂质指标均在合格范围内。与现有的大孔吸附树脂纯化工艺相比, 该方法具有高效、稳定、快速等特点, 而且对碘帕醇杂质的去除效果好, 回收率高, 可以为碘帕醇分离纯化生产工艺的开发提供新的思路。
2018,
Vol. 36 Issue (10): 1061-1066
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2018,
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