超高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆中盐酸氨溴索及其制剂的生物等效性评价


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贺美莲¹, 郭常川², 冷佳薇², 张迅杰², 咸瑞卿², 巩丽萍², 石峰², 姜玮³

1. 山东大学药学院, 山东济南 250012;
2. 山东省食品药品检验研究院, 山东济南 250101;
3. 山东大学化学与化工学院, 山东济南 250100

收稿日期：2018-07-23

基金项目：国家自然科学基金（81573606）

通讯联系人：郭常川, Tel:(0531)81216561, E-mail:gcc007@163.com; 姜玮.Tel:(0531)88362588, E-mail:wjiang@sdu.edu.cn

摘要：采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术，建立了快速、简单、灵敏的测定人血浆中盐酸氨溴索含量的方法，并用于盐酸氨溴索人体生物等效性预试验研究。取50 μL血浆样品，采用蛋白沉淀法处理，以盐酸氨溴索-d5为内标。采用Waters XBridge BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，2.5 μm），以0.1%（v/v）甲酸水-含0.1%（v/v）甲酸的甲醇为流动相，在0.4 mL/min流速下进行梯度洗脱。采用电喷雾电离（ESI）源以正离子模式进行MRM检测。结果显示，盐酸氨溴索在2~400 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数（r）为0.998，准确度为97.1%~108.7%，精密度为1.0%~5.6%。将该方法用于6名健康受试者口服盐酸氨溴索受试制剂和参比制剂30 mg后血药浓度的测定，结果显示二者相对生物利用度为（102.3±14.8）%，血药浓度-时间曲线下面积（AUC_0-t、AUC_0-∞）和最大血药浓度（C_max）的90%置信区间均在80.0%~125.0%范围内，两种制剂生物等效。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱生物等效性盐酸氨溴索人血浆

Determination of ambroxol hydrochloride in human plasma by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and bioequivalence evaluation of its preparation

HE Meilian¹, GUO Changchuan², LENG Jiawei², ZHANG Xunjie², XIAN Ruiqing², GONG Liping², SHI Feng², JIANG Wei³

1. School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250012, China;
2. Shandong Institute for Food and Drug Control, Jinan 250101, China;
3. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shandong University, Jinan 250100, China

Abstract: A rapid, simple and sensitive ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) method was developed for the determination of ambroxol hydrochloride in human plasma, and bioequivalence of its preparation was evaluated. The 50 μL-plasma sample was treated with methanol for protein precipitation, while ambroxol-d5 was used as an internal standard (IS). The separation was carried out on a Waters XBridge BEH C18 column (50 mm×2.1 mm, 2.5 μm) by gradient elution at a flow rate of 0.4 mL/min, with 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution and methanol containing 0.1% (v/v) formic acid as the mobile phases. The analyte was detected using an electrospray ionization source in positive ion multiple reaction monitoring (MRM) mode. The calibration curves were linear in the range of 2-400 ng/mL (r=0.998). The intra- and inter-run accuracies were 97.1%-108.7%, the intra- and inter-run precisions were 1.0%-5.6%. The method was applied to the determination of the plasma concentration of the six healthy subjects after the oral administration of 30 mg of test and reference preparations. The bioavailability was (102.3±14.8)%. The 90% confidence intervals of the test preparation's pharmacokinetic parameters were 80.0%-125.0% of the reference preparation's corresponding parameters. Thus, it is proved that the test preparation and reference preparation are bioequivalent.

Key words: ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) bioequivalence ambroxol hydrochloride human plasma

盐酸氨溴索, 化学名为反式-4-[2-氨基-3, 5-二溴苄基)-氨基]环己醇盐酸盐, 是常用的祛痰药, 1991年在我国上市^{[1, 2]}。盐酸氨溴索可以溶解痰液, 润滑呼吸道, 并促进肺表面活性物质的分泌和纤毛运动, 临床上用于治疗支气管哮喘和慢性支气管炎^[3-5]。有报道^[6]表明氨溴索具有葡糖基神经酰胺酶活性和减少细胞中氧化应激标志物的作用, 显示氨溴索可能具有治疗帕金森症的潜力。

现有的盐酸氨溴索的生物分析方法包括液相色谱法^{[7, 8]}、毛细管电泳法^[9]和液相色谱-串联质谱法^[10-18]等。生物样品分析具有取样量少、分析物浓度低以及含内源性物质干扰的特点^[19]。因此, 液相色谱-串联质谱法以其选择性好、灵敏度与准确度高、前处理方法简单的优势成为最为常用的分析盐酸氨溴索生物样品的方法。但是现有的方法仍存样品前处理过程复杂^[10-12]、检测时间长^{[13, 14]}、血浆用量大^{[11, 13, 15-17]}等问题。例如王国才等^[15]采用液相色谱-质谱法测定氨溴索的血药浓度, 血浆用量为100 μL, 对临床采血量要求较高, 降低了临床依从性。因此, 有必要开发一种血浆用量少、快速、灵敏且前处理简单的新方法, 以满足人血浆中盐酸氨溴索定量分析的需求。

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)测定人血浆中盐酸氨溴索含量的方法。该方法快速、灵敏, 血浆用量少。将该法用于6名健康受试者的生物等效性预试验, 可为正式生物等效性试验提供数据参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Triple Quad 5500超高效液相色谱-串联质谱系统(美国AB SCIEX公司), 配有Analyst 1.6.2积分软件; 3K15台式高速冷冻离心机(德国Sigma公司); MDF-U5412N医用低温箱(日本松下公司); Milli-Q Advantage A10超纯水器(美国Millipore公司)。

盐酸氨溴索标准品(纯度＞99.0%, 中国食品药品检定研究院); 盐酸氨溴索-d5标准品(纯度100%, 加拿大TLC公司); 甲醇、甲酸、N, N-二甲基甲酰胺(DMF)(色谱纯, 德国默克公司)。受试制剂:盐酸氨溴索分散片(规格:30 mg, 批号:1724284, 烟台东诚大洋制药有限公司); 参比制剂:盐酸氨溴索片(商品名Surbronc Expectorant^®, 规格:30 mg, 批号:161853, 德国Boehringer Ingelheim制药有限公司)。

1.2 标准溶液的配制

准确称取盐酸氨溴索标准品10.50 mg, 用10.48 mL DMF溶解, 配制成质量浓度为1.0 mg/mL的标准品储备液, 于-20 ℃冰箱中保存。准确移取适量标准品储备液, 用50%(v/v)甲醇水溶液稀释并配制成适当浓度的标准工作液。准确称取盐酸氨溴索-d5标准品10.17 mg, 用10.17 mL DMF溶解, 配制成质量浓度为1.0 mg/mL的内标储备液, 再用50%(v/v)甲醇水稀释至25 ng/mL, 作为内标工作溶液, 于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 样品前处理

精密移取50 μL血浆样品, 加入50 μL内标工作溶液后, 加入400 μL甲醇沉淀蛋白质, 涡旋5 min, 于4 ℃以14 000 r/min离心10 min, 取上清液, 待分析。

1.4 对照样品的制备

对照1:取空白血浆380 μL, 分别加入盐酸氨溴索标准溶液20 μL, 配制成含4.0、150.0和300.0 ng/mL盐酸氨溴索的血浆样品, 按1.3节描述处理; 对照2:将空白血浆按1.3节描述处理后, 配制含盐酸氨溴索4.0、150.0和300.0 ng/mL的基质样品; 对照3:含4.0、150.0和300.0 ng/mL盐酸氨溴索的50%(v/v)甲醇水溶液。

1.5 分析条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱:XBridge BEH C18柱(50 mm×2.1 mm, 2.5 μm); 柱温:40 ℃; 流动相:(A)0.1%(v/v)甲酸水溶液和(B)含0.1%(v/v)甲酸的甲醇溶液; 流速:0.4 mL/min; 进样量:2 μL。梯度洗脱程序见表 1。

表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program

1.5.2 质谱条件

离子源:电喷雾电离(ESI)源, 正离子模式; 离子源温度:500 ℃; 检测模式:多反应监测(MRM)模式; 离子化电压:5 500 V; 入口电压(EP): 10 V; 碰撞室出口电压(CXP): 19 V。盐酸氨溴索:监测离子对, 379.0/263.8;碰撞能量(CE), 25 V; 去簇电压(DP), 70 V。盐酸氨溴索-d5:监测离子对, m/z 384.0/263.8; CE, 30 V; DP, 110 V。

1.6 临床试验方案

筛选6名健康成年受试者, 身体质量指数(BMI)为19~26 kg/m², 无病史, 且体格检查、心电图、胸片、实验室项目及其他相关检查均正常或无临床意义的异常。受试者均自愿参加本次临床试验, 理解研究程序且已签署知情同意书。

采用单剂量双周期双顺序交叉试验设计, 6名受试者随机分为两组。第Ⅰ周期, 3名受试者进食高热量、高脂餐后, 口服受试制剂盐酸氨溴索分散片30 mg, 另3名受试者进食高热量、高脂餐后, 口服参比制剂盐酸氨溴索片30 mg, 7天后交叉给药进行第Ⅱ周期研究。

两周期试验分别于给药前(0 h)和给药后0.33、0.67、1.0、1.33、1.67、2.0、2.33、2.67、3.0、4.0、5.0、7.0、8.0、10.0、12.0、24.0和48.0 h采集静脉全血4 mL, 置于预冷的乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K₂)抗凝管中, 于4 ℃以3 000 r/min离心10 min, 所得血浆样品储存于-60 ℃超低温冰箱中, 用于测定血浆中盐酸氨溴索的含量。

1.7 数据处理和统计分析

使用DAS 2.0软件处理血药浓度数据并计算药动学参数, 使用Winonlin 6.2软件进行统计分析。主要药动学参数经对数转换后以多因素方差分析(ANOVA)进行显著性检验, 然后用双向单侧t检验和计算90%置信区间的统计方法评价和判断受试制剂和参比制剂之间的生物等效性。

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 标准曲线

取空白血浆190 μL, 加入10 μL不同浓度的盐酸氨溴索标准溶液, 使样品中盐酸氨溴索的质量浓度分别为2.0、6.0、20.0、50.0、100.0、200.0、320.0和400.0 ng/mL, 按1.3节所述进行样品前处理, 经UHPLC-MS/MS方法测定。采用Analyst软件自动积分, 回归方程以盐酸氨溴索与盐酸氨溴索-d5的色谱峰面积之比为纵坐标(y), 以血浆中分析物的质量浓度为横坐标(x, ng/mL), 采用加权(W=1/x²)最小二乘法, 得到的标准曲线为y=0.049 4x+0.007(n=8), 其相关系数(r)为0.998, 相对标准偏差(RSD)均在规定范围之内, 说明盐酸氨溴索在2.0~400.0 ng/mL范围内线性良好, 据此计算得到的药物浓度准确可靠。

定量限为标准曲线的最低点, 并满足信噪比S/N＞10。图 1a为盐酸氨溴索在定量限(2 ng/mL)水平下的选择离子色谱图, 盐酸氨溴索的保留时间为1.30 min, 盐酸氨溴索-d5的保留时间为1.29 min, 并得到较好的峰形与响应值。图 1b为空白血浆样品的色谱图, 并与图 1a进行比较, 发现空白血浆样品的色谱图中没有干扰峰出现, 说明方法对分析物及内标的定量没有影响。图 1c为受试者服用氨溴索4 h后的血浆样品提取离子色谱图, 结果表明该方法在用于实际血浆样品测定时, 保留时间没有发生漂移。

图 1 (a) 加标(2 ng/mL)血浆样品、(b)空白血浆样品和(c)受试者服用氨溴索4 h后血浆样品的提取离子色谱图 Fig. 1 Extract ion chromatograms of (a) a spiked plasma sample (2 ng/mL), (b) a blank plasma sample and (c) a plasma sample after administration of ambroxol hydrochloride tablets for 4 h

2.1.2 准确度与精密度

配制含盐酸氨溴索定量限(2.0 ng/mL)和低、中、高(4.0、150.0、300.0 ng/mL)水平的质控样品各6份, 按1.3节描述进行前处理并测定了3个分析批, 考察批内、批间准确度和精密度。结果显示, 4个水平的质控样品批内准确度为97.1%~108.7%, 批间准确度为99.0%~106.9%;批内精密度为1.0%~5.6%, 批间精密度为3.7%~5.1%(见表 2)。表明该方法准确度和精密度均良好。

表 2 盐酸氨溴索在不同加标水平下的准确度与精密度 Table 2 Accuracies and precisions of the ambroxol hydrochloride under different spiked levels

2.1.3 选择性、基质效应和提取回收率

选择6批来自不同受试者的空白基质, 分别配制成空白基质样品以及定量限水平的样品。其中, 空白基质样品中干扰组分的响应强度均低于分析物定量限响应强度的3%, 并低于内标响应强度的1%。说明该方法具有较好的选择性, 能够区分分析物和内标与基质中的干扰组分。

基质效应的考察通过计算基质因子来评价。基质因子为基质存在下目标物的响应峰面积与纯溶液中目标物响应峰面积的比值, 即对照2样品与对照3样品中盐酸氨溴索峰的面积之比。计算得到分析物的基质因子为95.4%, 说明该方法的基质效应不影响盐酸氨溴索的定量分析。

实验考察分析物在低、中、高3个水平下的提取回收率, 结果分别为98.0%、98.3%和99.3%, 内标的提取回收率为97.1%。说明该方法回收率较高, 结果较为准确。

2.1.4 稳定性

考察了不同条件下放置的样品中氨溴索的含量, 包括储备液和工作溶液室温放置12 h、血浆样本5次冻融循环、处理过的样品在室温放置6 h及在自动进样器中放置24 h, 并计算其与新鲜制备样品中氨溴索含量的比值, 分别为101.2%、106.3%、98.2%、93.6%和103.8%, 表明盐酸氨溴索在上述条件下均能保持稳定。

2.2 血浆中的盐酸氨溴索的测定

采用本文方法测定6名受试者口服受试制剂及参比制剂后的血药浓度, 以时间为横坐标、测定的血药浓度为纵坐标, 分别绘制受试制剂及参比制剂的盐酸氨溴索血药浓度-时间曲线(见图 2)。

图 2 受试者单剂量口服盐酸氨溴索片的血药浓度-时间曲线(n=6) Fig. 2 Plasma concentration-time curves of ambroxol hydrochloride tablets in subjects after a single oral dose (n=6)

用DAS 2.0软件计算两种盐酸氨溴索片剂的药动学参数, 结果见表 3。由血药浓度-时间曲线下面积(AUC_0-t、AUC_0-∞)计算出每个受试者的相对生物利用度, 结果受试制剂对参比制剂的相对生物利用度为(102.3±14.8)%。将AUC_0-t、AUC_0-∞和最大血药浓度经对数转换后, 采用双向单侧t检验及90%置信区间法评价两种片剂的生物等效性。受试制剂的AUC_0-t、AUC_0-∞和C_max的90%置信区间分别为参比制剂相应参数的91.2%~115.5%、91.1%~115.6%、88.1%~116.9%, 均在80.0%~125.0%范围内。结果表明, 本研究中盐酸氨溴索受试制剂和参比制剂在人体内的吸收速度和程度无显著性差异, 具有生物等效性。

表 3 受试制剂与参比制剂的主要药动学参数比较(n=6) Table 3 Comparison of main pharmacokinetic parameters of test preparation with reference preparation (n=6)

3 结论

本文建立了UHPLC-MS/MS测定人血浆中盐酸氨溴索含量的方法, 并应用于人体生物等效性预试验。该方法具有灵敏度高、选择性好、基质效应小的优点。在试验过程中, 受试者均未有临床意义的药物不良反应出现。本试验为盐酸氨溴索分散片的生物等效性研究提供了数据参考, 为正式试验奠定了基础。

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