利用“网包法”制备高效液相色谱大环抗生素类手性固定相


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	何义娟

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何义娟, 李克丽, 李倩, 张鹏, 艾萍, 袁黎明

云南师范大学化学化工学院, 昆明 650500

收稿日期：2018-08-23

基金项目：国家自然科学基金项目（21365025）

通讯联系人：袁黎明.Tel:(0871)65941088, E-mail:yuan_limingpd@126.com

摘要：万古霉素和替考拉宁都属于糖肽类的大环抗生素，具有立体的环状结构和多个手性中心，是两种常见的手性识别材料，广泛应用于对映体的色谱手性分离分析。该文以万古霉素和替考拉宁为手性选择剂，哌嗪为单体，4，4'-二苯基甲烷二异氰酸酯（MDI）、1，6-己二异氰酸酯（HDI）和2，4-甲苯二异氰酸酯（TDI）为交联剂，通过界面聚合反应形成网状层包裹硅胶载体的方法制得6种高效液相色谱手性固定相，用于分离外消旋化合物，并与MDI直接交联万古霉素和替考拉宁在硅胶表面所得固定相进行了比较。结果表明，利用"网包法"和直接交联法制备的手性柱与商品万古霉素和替考拉宁柱之间具有互补性，均对不同的外消旋体有不同程度的拆分。

关键词：高效液相色谱手性固定相界面聚合大环抗生素

Preparation of macrocycle antibiotic chiral stationary phases by wrapping with a net in high performance liquid chromatography

HE Yijuan, LI Keli, LI Qian, ZHANG Peng, AI Ping, YUAN Liming

School of Chemistry and Chemical Engineering, Yunnan Normal University, Kunming 650500, China

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 21365025)

Abstract: Vancomycin and teicoplanin are glycopeptide macrocyclic antibiotics with three-dimensional ring structures and multiple chiral centers. They are commonly used chiral recognition materials in enantioseparation by high-performance liquid chromatography. In this study, six chiral stationary phases wrapped with a net on silica gels were prepared by interfacial polymerization using vancomycin and teicoplanin as chiral selectors, piperazine as a monomer, 4, 4'-diphenylmethane diisocyanate (MDI), 1, 6-hexamethylene diisocyanate (HDI), and 2, 4-toluene diisocyanate (TDI) as crosslinker. The fabricated chiral columns were used for enantioseparations. Compared to the crosslinked and commercial columns composed of vancomycin and teicoplanin, the columns wrapped with a net exhibited complementarity for the optical resolutions.

Key words: high performance liquid chromatography (HPLC) chiral stationary phase interfacial polymerization macrocycle antibiotic

手性是自然界中真实而普遍存在的现象, 是自然界的基本属性^[1], 手性问题涉及农业、医学、材料、食品等诸多领域^{[2, 3]}。手性药物虽有相同的理化性质, 但生物活性和药理作用等方面却存在差异, 甚至表现出截然相反的效果^[4]。例如, 左旋巴比妥酸盐抑制神经活动, 而右旋巴比妥酸盐却兴奋神经; 右旋甲状腺素钠可降低血脂, 而左旋甲状腺素钠对心脏有毒副作用^[5]。由于手性分子生物活性不同, 所以手性分离分析就显得十分重要^[6]。

界面聚合法是高分子制备中的一种常用方法, 分别将两种高活性的单体分散在互不相溶的两相中^[7], 两种单体在两相的界面处发生缩聚反应而生成高分子。常用的活性单体如多元胺、多元醇和多元酚等常溶于水相, 多元酰氯和多元异氰酸酯等常溶于有机(油)相。在膜科学及技术领域, 界面聚合法也是反渗透和纳滤等聚合物分离膜的实验室以及工业级制备的最主要方法, 尤其是以哌嗪或者间苯二胺为单体、多元酰氯或者多元异氰酸酯为交联剂制备的复合膜由于膜性能十分优良而在生产实际中广泛使用^[8-11]。

大环抗生素类化合物^[12]的相对分子质量大约在660~2 200 Da之间, 分子中包括亲水基团、疏水基团和众多的可解离基团, 其分子具有一定空间的环状结构和多个手性活性中心, 能与手性客体分子发生多种作用, 如π-π作用、包合作用、氢键之间作用、偶极-偶极相互作用、疏水作用、空间位阻作用等^{[13, 14]}。自1994年Armstrong等^[15]首次用大环抗生素作为手性选择剂应用于HPLC以来, 相继报道了替考拉宁、利福霉素B、硫链丝菌素、去甲万古霉素、瑞斯托菌素A等作为液相色谱手性固定相^[16-18]。

目前已有文献^{[19, 20]}报道将万古霉素和替考拉宁通过共价键键合在硅胶基质上制备色谱手性固定相。本文以万古霉素和替考拉宁为手性选择剂, 哌嗪为单体, 4, 4′-二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)、1, 6-己二异氰酸酯(HDI)和2, 4-甲苯二异氰酸酯(TDI)为交联剂, 通过界面聚合反应形成网状层包裹硅胶载体, 制得6种高效液相色谱手性固定相, 用于分离外消旋化合物, 并与MDI直接交联万古霉素和替考拉宁在硅胶表面所得固定相进行了分离性能的比较。研究还同时考察了色谱条件对手性色谱柱分离性能的影响。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

高效液相色谱仪配有P1201紫外检测器、P1201恒流泵、ZW1201色谱柱温箱和EC-2006型色谱工作站(大连依利特分析仪器有限公司); 纯水器(英国ELGA Lab Water公司); As3120超声波清洗仪(天津Autoscience公司); 250 mm×2.0 mm型不锈钢液相色谱空柱(美国Alltech公司); 扫描电镜(荷兰FEI Quanta 200公司); 液相色谱匀浆法装柱机(美国Alltech公司)。

替考拉宁(纯度≥90%)购于孝感深远化工有限公司; 万古霉素(纯度≥90%)购于苏州法母进出口有限公司; MDI(纯度97%)购于日本TCI公司; HDI(纯度99%)购于美国Alfa Aesar公司; TDI(纯度98%)购于山东西亚化学工业有限公司; 哌嗪(纯度99%)购于上海Adamas-beta公司; 球型硅胶YQG80(青岛美高化工有限公司); 正己烷、异丙醇、无水乙醇、甲醇、乙腈购于天津风船化学试剂科技有限公司, 所有试剂均为分析纯。所用的外消旋化合物:氧氟沙星、1, 2-二苯基乙二醇、扁桃酸、D, L-苯丙氨酸、反-1, 2-二苯基环氧乙烷、3-苄氧基-1, 2-丙二醇、特罗格尔碱、D, L-组氨酸、1-(9-蒽基)-2, 2, 2-三氟乙醇、华法林、马来酸氯苯那敏、阿替洛尔、美托洛尔、氨氯地平、氟比洛芬、吡喹酮、萘普生购于美国Fluka公司, 纯度均≥99%; D, L-天冬氨酸、D, L-丙氨酸、1, 2-二苯基乙醇酮、二氢黄酮、D, L-精氨酸、D, L-丝氨酸、D, L-赖氨酸、D, L-对羟基苯甘氨酸、D, L-脯氨酸、D, L-亮氨酸、D, L-苯甘氨酸、D, L-半胱氨酸购于美国Sigma-Aldrich试剂公司, 纯度均≥99%;联糠醛、布洛芬、盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、1, 1′-联-2-萘酚、3, 5-二硝基苯甲酰基(DNB)-亮氨酸、盐酸普萘洛尔、1-对氯苯基乙醇、D, L-缬氨酸、佐匹克隆、硫酸特布他林、奥美拉唑、酮洛芬、四米唑均购于比利时Acros公司, 纯度均≥99%。

1.2 手性固定相的制备

界面聚合反应受很多因素的影响, 例如手性选择剂和单体以及交联的量、两相溶剂的种类、化学反应时间和温度等。通过大量的界面聚合反应、成膜现象观察、膜的稳定性和机械强度试验, 筛选出以下手性固定相制备的“网包法”或交联法, 具体实验步骤如下。

1.2.1 替考拉宁手性固定相的制备

称取2.0 g替考拉宁和1.0 g哌嗪于50 mL容量瓶中配制成水溶液, 并滴加2 mL三乙胺。称取3.0 g硅胶于烧杯中, 加入上述配制的水溶液, 浸泡一段时间后将多余的液体除去, 室温下晾干; 称取1.0 g MDI于50 mL容量瓶中, 配制成正己烷有机溶液, 待硅胶刚好晾干, 加入一定量配制好的MDI正己烷溶液, 浸泡1 h。倒出多余液体, 于110 ℃烘箱中热处理15 min, 即制得CSP-A。图 1是“网包法”制备CSP-A的原理示意图。

图 1 “网包法”制备替考拉宁-4, 4′-二苯基甲烷二异氰酸酯的示意图 Fig. 1 Schematic representation of the preparation of teicoplanin-4, 4′-diphenyl-methane-diisocyanate chiral stationary (MDI) by wrapping with a net T: backbone of teicoplanin; RT: room temperature; R: alkyl.

在界面聚合法制备高分子复合膜中哌嗪是最经典的反应单体之一。由于手性剂万古霉素和替考拉宁分子结构中伯胺数量较少, 为了在硅胶表面聚合一层性能稳定的高分子膜使万古霉素或者替考拉宁能牢固地固载在硅胶的表面, 因此在图 1的反应中加入了哌嗪单体参加界面聚合反应。

同时运用上述方法以HDI作为交联单体制得CSP-C; 以TDI作为交联单体制得CSP-E; 另外, 采用直接交联法制得CSP-G, 其制备过程与CSP-A相似, 但水溶液中没有加入哌嗪。

1.2.2 万古霉素手性固定相的制备

“网包法”万古霉素手性固定相的制备过程和1.2.1节过程相似, 均采用万古霉素作为手性识别剂, 其中MDI作为交联单体制得CSP-B; HDI作为交联单体制得CSP-D; TDI作为交联单体制得CSP-F。与此同时, 采用直接交联法制得CSP-H, 其制备过程与CSP-B相似, 但水溶液中没有加入哌嗪。

1.3 手性柱的填装

液相色谱柱的填装采用高压匀浆法, 称取2.0 g制备好的手性固定相倒入23 mL正己烷溶液, 悬浮均匀, 快速倒进匀浆罐中。用正己烷:异丙醇=(9:1, v/v)为顶替液, 在40~50 MPa压力下装柱5 min, 然后将压力调至25 MPa, 保持30 min, 缓慢减至常压, 然后安装好筛板和柱头即可。

1.4 色谱条件

流动相分别为正己烷:异丙醇=9:1(v/v)、乙腈:水=6:4(v/v)、甲醇:水=6:4(v/v)、甲醇:水=2:8(v/v)、无水乙醇、高纯水和甲醇; 流速为0.1 mL/min; 检测波长为254 nm或230 nm; 柱温为25 ℃。

2 结果与讨论

2.1 手性固定相的扫描电镜表征

为了观察6种手性固定相在硅胶表面的固载情况, 取一定量的纯硅胶和6种手性固定相进行扫描电镜表征, 如图 2所示, a~g分别是纯硅胶、CSP-A、CSP-B、CSP-C、CSP-D、CSP-E和CSP-F的扫描电镜图。通过图 2a与图 2b~2g对比可知, 聚合后的硅胶表面上附着高分子聚合物, 表明成功制备了6种手性固定相。图 2a和2d中的数值分别表示纯硅胶和固定相C的直径, 随机选取了形貌较好的硅胶进行标注。

图 2 纯硅胶和6种手性固定相的扫描电镜图 Fig. 2 Scanning electronic microscopy (SEM) images of the pure silica gel and six chiral stationary phases a. pure silica gel; b. CSP-A; c. CSP-B; d. CSP-C; e. CSP-D; f. CSP-E; g. CSP-F.

2.2 手性固定相的红外表征

为了观察6种手性固定相有没有发生界面聚合反应, 分别取一定量的纯硅胶和6种手性固定相进行傅里叶红外光谱法测定, 其结果如图 3所示。图 3中1~7分别为纯硅胶、CSP-A、CSP-B、CSP-C、CSP-D、CSP-E和CSP-F的红外谱图。可以看出相比图中纯硅胶的红外谱图, 曲线2~7在1 631~1 645 cm^-1处的峰是脲基中的C=O的伸缩振动吸收峰或是缔合酰胺羰基的伸缩振动峰；2 833 cm^-1处的峰是亚甲基、次甲基的CH键伸缩振动谱带, 手性选择剂与交联剂发生了反应, 有聚合物生成。在2 200 cm^-1处无吸收峰, 说明异氰酸根N=C=O已经完全反应完。通过红外表征, 说明手性选择剂与交联剂发生了界面聚合反应, 并且在反应过程中异氰酸酯都反应完全。

图 3 6种手性固定相与纯硅胶的红外对比图 Fig. 3 IR spectra comparison of the six chiral stationary phases and pure silica gel 1. pure silica gel; 2. CSP-A; 3. CSP-B; 4. CSP-C; 5. CSP-D; 6. CSP-E; 7. CSP-F.

2.3 手性柱的手性拆分能力

为了考察10种手性柱对外消旋化合物的手性分离能力, 在一定的色谱条件下, 对一系列手性化合物进行了拆分研究。表 1是外消旋化合物的拆分数据, 图 4是部分手性化合物的拆分谱图, 试验结果表明, 制备的8种手性柱对手性化合物都具有一定的拆分能力, 并与商品柱(Chirobiotic T和Chirobiotic V)具有互补性。

图 4 10种手性柱对代表性化合物的拆分谱图 Fig. 4 Resolution spectra of typical compounds using the ten chiral columns

表 1 手性样品在10种手性柱上的拆分结果 Table 1 Resolution results of the chiral samples on the ten chiral columns

Racemate	CSP-A			CSP-B			CSP-C			CSP-D			CSP-E			CSP-F			CSP-G			CSP-H			Chirobiotic T			Chirobiotic V
Racemate	k₁′	α	R_s	k₁′	α	R_s	k₁′	α	R_s	k₁′	α	R_s	k₁′	α	R_s	k₁′	α	R_s	k₁′	α	R_s	k₁′	α	R_s	k₁′	α	R_s	k₁′	α	R_s
Ofloxacin	0.52^e	1.06^e	0.54^e	0.41^a	1.59^a	1.67^a	0.41^e	2.26^e	1.52^e	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
1, 2-Diphenylethylene glycol	-	-	-	0.36^a	1.54^a	1.57^a	-	-	-	0.44^b	1.83^b	1.03^b	0.47^a	3.37^a	2.53^a	0.30^a	1.61^a	0.98^a	-	-	-	-	-	-	0.11^g	1.41^g	0.77^g	-	-	-
D, L-Phenylalanine	-	-	-	0.65^f	2.26^f	2.54^f	0.43^b	0.76^b	0.39^b	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	2.30^g	1.59^g	1.91^g	-	-	-
trans-1, 2-Diphenylethylene	-	-	-	0.91^c	1.42^c	1.55^c	0.33^a	1.63^a	1.03^a	0.72^c	1.08^c	0.87^c	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	7.03^d	1.15^d	0.91^d	-	-	-
oxide
Troger base	-	-	-	0.92^c	1.22^c	0.98^c	0.39^b	2.89^b	2.01^b	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D, L-Histidine	-	-	-	0.68^c	1.03^c	0.73^c	0.37^b	0.85^b	0.42^b	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.71^e	1.12^e	0.46^e	-	-	-	-	-	-	-	-	-
1-(9-Fluorenyl)-2, 2, 2-	0.56^b	1.09^b	0.87^b	1.57^b	1.28^b	1.06^b	1.03^f	2.08^f	1.43^f	0.36^c	3.54^c	2.78^c	-	-	-	0.54^a	2.27^a	1.58^a	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
trifluoroethanol
Warfarin	-	-	-	0.55^b	1.07^b	0.87^b	-	-	-	-	-	-	0.39^a	1.21^a	0.87^a	0.56^e	1.21^e	0.87^e	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Chlorpheniramine maleate	-	-	-	0.43^b	1.26^b	1.39^b	-	-	-	-	-	-	0.56^a	1.07^a	0.33^a	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Atenolol	-	-	-	0.39^b	1.23^b	1.27^b	-	-	-	-	-	-	0.44^e	1.02^e	0.56^e	0.37^e	1.88^e	1.03^e	0.39^a	1.86^a	1.61^a	-	-	-	1.68^g	1.07^g	0.63^g	0.52^g	1.36^g	0.82^g
Metoprolol	-	-	-	0.48^b	1.01^b	0.88^b	-	-	-	0.43^b	1.18^b	0.89^b	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.80^g	1.09^g	0.82^g	-	-	-
Amlodipine	-	-	-	1.08^b	1.05^b	0.85^b	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	1.65^c	1.39^c	0.53^c	-	-	-	-	-	-
Ketoprofen	0.42^b	1.61^b	1.02^b	0.32^b	1.29^b	1.45^b	-	-	-	-	-	-	0.76^a	1.98^a	1.29^a	-	-	-	-	-	-	0.54^a	2.02^a	1.08^a	8.69^d	1.07^d	0.89^d	-	-	-
Naproxen	-	-	-	0.29^b	1.39^b	1.54^b	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D, L-Alanine	-	-	-	0.30^b	2.89^b	3.39^b	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	1.22^d	1.20^d	1.77^d	-	-	-
D, L-Arginine	0.30^b	0.79^b	0.45^b	0.40^b	1.31^b	1.49^b	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D, L-Serine	-	-	-	0.98^b	1.32^b	1.51^b	0.56^b	2.29^b	1.56^b	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D, L-Lysine	0.44^e	0.56^e	0.42^e	0.70^b	0.70^b	0.48^b	0.44^f	1.46^f	0.88^f	-	-	-	0.82^c	1.15^c	0.48^c	-	-	-	0.69^e	1.21^e	0.79^e	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D, L-p-Hydroxyphenylglycine	0.27^c	0.89^c	0.49^c	-	-	-	0.42^c	0.92^c	0.48^c	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	1.34^d	1.97^d	4.97^d	-	-	-
Bismuthaldehyde	0.47^b	1.32^b	0.98^b	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Dihydroflavone	0.39^b	2.32^b	1.52^b	-	-	-	-	-	-	0.39^c	2.56^c	1.46^c	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	9.96^d	1.08^d	0.95^d	-	-	-
Ibuprofen	1.33^b	1.92^b	1.18^b	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	4.45^d	1.14^d	0.97^d	-	-	-
D, L-Leucine	0.59^b	0.85^b	0.48^b	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	1.47^d	1.27^d	2.17^d	-	-	-
Praziquantel	-	-	-	-	-	-	0.39^a	3.16^a	2.25^a	-	-	-	0.87^e	2.01^e	1.39^e	0.58^a	3.43^a	2.65^a	-	-	-	0.70^e	1.69^e	1.09^e	0.41^g	1.13^g	0.63^g	-	-	-
Mandelic acid	-	-	-	-	-	-	0.62^c	1.04^c	0.78^c	0.45^e	1.04^e	0.82^e	0.53^a	1.60^a	1.01^a	-	-	-	0.40^a	3.36^a	2.32^a	0.69^b	2.19^b	1.83^a	1.48^d	1.07^d	0.54^d	-	-	-
D, L-Phenylglycine	-	-	-	-	-	-	0.46^c	0.98^c	0.45^c	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	1.55^d	1.87^d	5.19^d	-	-	-
1, 2-Diphenylethanol ketone	-	-	-	-	-	-	1.34^f	1.89^f	1.37^f	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.56^a	2.42^a	1.53^a	4.10^d	1.04^d	0.53^d	-	-	-
D, L-Cysteine	-	-	-	-	-	-	0.35^f	1.56^f	3.35^f	-	-	-	-	-	-	1.35^e	1.27^e	0.47^e	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
1, 1′-Bi-2-naphthol	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.42^b	0.85^b	0.34^b	-	-	-	-	-	-	-	-	-	7.75^f	1.54^f	0.66^f	7.40^d	1.06^d	0.58^d	-	-	-
3, 5-Dinitrobenzoyl-leucine	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.33^b	0.89^b	0.56^b	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.10^g	2.30^g	1.57^g	-	-	-
Propranolol hydrochloride	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.39^b	1.32^b	1.02^b	-	-	-				-	-	-	-	-	-	0.85^g	1.08^g	0.67^g	-	-	-
1-p-Chlorophenylethanol	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.36^f	2.29^f	1.37^f	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Flurbiprofen	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.44^e	0.52^e	0.28^e	0.39^a	1.56^a	0.95^a	-	-	-	7.82^d	1.09^d	0.79^d	-	-	-
D, L-Valine	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.52^f	1.85^f	1.22^f	-	-	-	0.71^e	1.19^e	0.75^e	-	-	-	1.29^d	1.11^d	1.63^d	-	-	-
3-Benzyloxy-1, 2-propanediol	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	1.18^c	1.39^c	0.87^c	-	-	-	-	-	-
Zopiclone	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.61^c	2.59^c	1.87^c	-	-	-	-	-	-
D, L-Valine	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.18^b	2.94^b	0.91^b	1.97^d	1.91^d	5.12^d	-	-	-
Terbutaline sulfate	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.71^e	1.22^e	0.91^e	-	-	-	0.84^g	1.21^g	1.55^g	0.34^g	1.35^g	0.67^g
D, L-Aspartate	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.69^e	1.28^e	0.45^e	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Clenbuterol Hydrochloride	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.41^a	1.23^a	0.35^a	-	-	-	0.78^g	1.06^g	0.59^g	-	-	-
Salbutamol	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	1.25^g	1.12^g	1.48^g	-	-	-
Omeprazole	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.46^g	1.33^g	0.87^g
Tetrazole	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.72^g	1.65^g	0.78^g
k₁′: retention factor; α: separation factor; R_s: resolution; -: not separated. The mobile phases are: (a) N-hexane:isopropanol=9:1 (v/v); (b) acetonitrile:water=6:4 (v/v); (c) methanol:water=6:4 (v/v); (d) methanol:water=2:8 (v/v); (e) absolute ethanol; (f) high purity water; (g) methanol.

表 1 手性样品在10种手性柱上的拆分结果 Table 1 Resolution results of the chiral samples on the ten chiral columns

在表 1中, 实验室自制的8根手性柱从CSP-A至CSP-H, 均分别以正己烷:异丙醇=9:1(v/v)、乙腈:水=6:4(v/v)、甲醇:水=6:4(v/v)、无水乙醇、高纯水为流动相, 而对于两根商品柱则采用公司推荐的流动相甲醇:水=2:8(v/v)和甲醇。从表 1中可以看出, “网包法”制备的万古霉素手性柱CSP-B、CSP-D、CSP-F分别能拆分18、10、7对外消旋体, 交联法制备的万古霉素手性柱CSP-H能拆分9对外消旋体, 万古霉素商品柱Chirobiotic V仅拆分了4对外消旋体, 因此“网包法”制备的手性柱明显优于交联柱, 而交联柱又明显优于商品柱。另外, “网包法”制备的替考拉宁手性柱CSP-A、CSP-C、CSP-E分别能拆分10、14、9对外消旋体, 交联法制备的替考拉宁手性柱CSP-G能拆分9对外消旋体, 替考拉宁商品柱Chirobiotic T能拆分开24对外消旋体, 明显地替考拉宁商品柱优于自制网包柱和交联柱, 而网包柱又好于交联柱。但从表 1中又可见, 有11对商品柱Chirobiotic T不能拆分的外消旋体, 利用自制的替考拉宁柱却又能被拆分开, 因此这些柱彼此之间具有很好的互补性。

图 4是每种手性柱分别选取的一个代表性的色谱分离谱图, 从图中可见商品柱的柱效明显高于网包柱和交联柱。产生的原因一方面是因为采用的界面聚合法在硅胶表面包裹了一层高分子, 使球形硅球表面形状有所改变, 一定程度影响了分离柱效。另一方面可能是因为在硅胶表面引入了更多的极性基团, 导致手性识别过程中的可逆性作用变差。除此之外, 柱效还与待拆分的具体手性样品的性能相关, 在报道的很多利用键合臂制备的手性固定相如Pirkle、环糊精、配体交换手性柱中, 也有较多的低柱效柱。尤其是现在研究和应用范围最广的多糖型手性固定相, 其柱效也不高。但不管怎样, “网包法”制备色谱柱还可有更多的条件和参数有待优化、其选择性和柱效还有较大的提升空间, 进一步的研究正在进行中。

2.4 不同流动相对手性柱分离外消旋化合物的影响

不同流动相对手性柱分离外消旋化合物具有不同程度的影响, 图 5显示了不同的流动相在万古霉素-MDI柱上拆分氧氟沙星、1-(9-蒽基)-2, 2, 2-三氟乙醇、氨氯地平、D, L-苯丙氨酸的色谱图。在高纯水作为流动相时这些化合物都有不同程度的分离, 甚至D, L-苯丙氨酸在高纯水流动相下分离效果更好, 表现出了这些柱子作为全水手性色谱柱的潜力。

图 5 不同流动相在万古霉素-4, 4′-二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)柱上的色谱图 Fig. 5 Chromatograms obtained using the vancomycin-MDI column with different mobile phases a. ofloxacin; b. 1-(9-fluorenyl)-2, 2, 2-trifluoroethanol; c. amlodipine; d. D, L-phenylalanine.
Injection volume: 2 μL; flow rate: 0.1 mL/min; column temperature: 25 ℃; UV detection wavelength: 254 nm. Mobile phase for line 1 in (a)-(d): high purity water; mobile phase for line 2 in (a): N-hexane:isopropanol=9:1 (v/v); mobile phase for line 2 in (b)-(d): acetonitrile:water=6:4 (v/v).

2.5 流速和进样量对手性柱分离外消旋化合物的影响

图 6a和6b分别为流速和进样量对万古霉素-MDI手性柱分离外消旋化合物的影响。随着流动相流速的增加, 分离效果逐渐变差。随着进样量的增加, 两个对映异构体的峰面积和峰高增加, 出峰的保留时间变化不大, 但峰变宽, 分离度有所下降。

图 6 万古霉素-MDI手性柱分离外消旋化合物的色谱图 Fig. 6 Chromatograms of the racemic compound separated by vancomycin-MDI chiral column a. D, L-Alanine at different flow rates; mobile phase: acetonitrile:water=6:4 (v/v); b. naproxen with different injection volumes; mobile phase: acetonitrile:water=6:4 (v/v).

3 结论

通过“网包法”成功制得了6种万古霉素和替考拉宁的手性柱, 它们对外消旋化合物表现出较好的分离能力, 将其与交联柱和商品手性柱相比较, 彼此之间具有很好的互补性。

除此之外，“网包法”作为一种新颖的手性固定相的制备方法, 还具有操作简单、反应快速等特点, 为新型手性高效液相色谱柱的制备探索了新的途径。

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