云南因其特殊的地理位置和气候条件而拥有丰富的野生食用菌资源, 其营养丰富、味道鲜美, 深受消费者的喜爱。然而, 在2008年11月, 德国的EUROFINS实验室[1]报道了牛肝菌中尼古丁含量超标(德国规定食用菌鲜品中的最大残留限量为0.05 mg/kg), 野生食用菌中的尼古丁受到了广泛的关注。研究[2]结果表明, 尼古丁属内源性代谢产物, 不同产地品种的食用菌中都能检出尼古丁, 且同一子实体的不同部位中尼古丁的含量差别较大。为此, 各国也纷纷为食用菌中的尼古丁规定了最大残留限量。2009年, 欧盟[3]修订了食用菌类中尼古丁的最大残留限量, 即食用菌鲜品中为0.036 mg/kg, 干燥牛肝菌为2.3 mg/kg, 除牛肝菌外的干燥野生菌为1.17 mg/kg。日本肯定列表[4]中规定了草菇中的最大残留限量为2 mg/kg。
尼古丁又名烟碱, 对生物体具有很多毒副作用, 能够使心跳加快、血压上升和精神状况改变等, 可促进血小板凝集, 造成心血管阻塞、中风等急慢性疾病[5-8]。野生食用菌的种类较多, 基质成分复杂, 尼古丁在不同野生食用菌中的含量各不相同, 常规测定方法难以达到测定要求, 因此, 目前对于野生食用菌中尼古丁测定方法的文献报道不多。Cavalieri等[9]利用QuEChERS方法对不同食用菌中尼古丁进行了测定, 但其未考虑到野生菌干样在提取前的复水性因素, 影响了最终的尼古丁提取效率; Lin等[10]利用毛细管电泳-安培检测器测定了食用菌中的尼古丁含量, 其灵敏度无法满足部分低含量尼古丁的食用菌的测定; Müller等[11]利用GC-MS/MS测定了食用菌中尼古丁的含量, 该方法操作相对简单, 但是也存在一定的基质干扰; Wang等[12]利用高通量动态微波辅助萃取, 并结合在线SPE测定了食用菌中的尼古丁含量, 得到了较好的分析效果, 但是该方法采用的技术较先进, 不利于实验室的广泛使用; 杨俊等[13]利用超高效液相色谱-串联质谱仪测定了食用菌中的尼古丁, 但是该方法采用了纯水作为提取溶剂, 提取溶液成分复杂, 不利于后续的质谱定量分析。
目前, 在野生食用菌中尼古丁测定过程中普遍存在基质复杂、提取效率低、净化效果差及灵敏度低等现象, 针对这些问题, 本研究对传统的QuEchERS方法、尼古丁的色谱和质谱条件等进行优化, 以期建立测定野生食用菌中尼古丁的高效、快速、高灵敏的超高效液相色谱-串联质谱方法。
API 5500 Q TRAP三重四极杆质谱仪(美国AB公司); 1290Ⅱ超高效液相色谱仪(美国Agilent公司); ZORBAX RRHD色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm, 美国Agilent公司); BSA224S-CW电子分析天平(德国Sartorius公司); 涡旋混匀器(美国Thermo Scientific公司); TDL-40C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。
尼古丁(纯度为99%)购买于加拿大Toronto Research Chemicals公司; 甲醇和乙腈(均为色谱纯)购买于德国Merck公司; 无水硫酸镁、NaCl、乙酸铵、氨水(均为分析纯)购买于国药集团化学试剂有限公司; 甲酸(色谱纯)、石墨化碳黑(GCB)吸附剂(45 μm)购买于美国Sigma公司; ProElut NH2、C18、N-丙基乙二胺(PSA)、Florisil填料(50 μm)均购买于中国迪马科技; 纯净水(购买于杭州娃哈哈公司)。
称取10 mg尼古丁, 用乙腈溶解后定容至10 mL, 得到1 g/L的尼古丁标准储备液, 再用乙腈稀释成不同浓度的标准溶液, 于-20 ℃下避光保存。
野生食用菌子实体, 包括其菌盖和菌柄经烘干后粉碎混匀(新鲜样品将其整个子实体匀浆混匀), 参照文献[14-17]的方法加以改进, 称取0.5 g野生食用菌干样(鲜样称取5.0 g)于离心管中, 加入2 mL水(鲜样无需加水), 涡旋1 min后静置15 min, 使样品充分润湿, 再加入10 mL氨水-乙腈(6:94, v/v)提取液, 涡旋振荡2 min后加入3 g NaCl, 涡旋混匀后以5 000 r/min的速度离心5 min, 取2 mL上清液于另一离心管中, 加入200 mg无水硫酸镁、150 mg PSA和50 mg GCB, 涡旋混合1 min后, 以5 000 r/min的速度离心2 min, 吸取1.0 mL上层提取液, 过0.22 μm有机相滤膜, 待分析。
利用乙腈和0.1%(体积分数, 下同)氨水溶液作为流动相。流速:0.2 mL/min; 柱温:35 ℃; 进样量:0.5 μL, 梯度洗脱步骤如表 1所示。
采用ESI源, 正离子MRM扫描模式, 参照文献[18-21]中相关质谱条件, 并根据本实验仪器条件进行优化, 得到相关参数如下:气帘气流速为20 L/h, 雾化气流速为55 L/h, 辅助气流速为55 L/h, 辅助加热气温度为650 ℃, 喷雾电压为5 500 V。定量离子对为m/z 163.0＞130.0, 定性离子对为m/z 163.0＞117.0, 去簇电压为80 V, 碰撞电压分别为25 V和35 V。
首先比较了利用乙腈和甲醇分别作为有机相时的色谱出峰情况。结果表明, 利用甲醇作为有机相时尼古丁存在一定的拖尾现象, 而乙腈作为有机相时的峰形较好, 无拖尾现象, 色谱图见图 1。
另一方面, 比较了流动相条件中的酸碱性对尼古丁出峰的影响, 采用乙腈作为有机相, 分别比较了甲酸-水溶液(0.1:99.9, v/v)和氨水-水溶液(0.1:99.9, v/v)的出峰效果。结果表明, 在酸性流动相条件下, 尼古丁能够被电离, 且具有较好的水溶性, 因此在反相色谱柱上的保留较差[22], 同时尼古丁在酸性条件下形成盐, 极性较大, 呈现出双峰形状, 而在碱性条件下峰形则较好, 达到了较好的色谱分离效果(见图 2)。
常见的野生食用菌主要包含新鲜样品和经烘干脱水后的干样, 对于新鲜食用菌样品, 可直接加入提取溶剂进行提取, 而对于干样, 常需要在加入提取溶剂前加入一定量的水, 以使干样润湿吸水后恢复至新鲜状态, 从而保证目标化合物在干样中的提取率与新鲜样品一致。根据欧盟[23]对于农药检测方法的要求, 对于含水量低于10%的样品, 样品称样量(g)与加水体积(mL)的比例应为1:2~1:5。因此, 本研究比较了称样量(g)与加水体积(mL)的比例分别为1:0、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6和1:7时尼古丁的提取效果。结果表明, 当不加水时, 样品无法润湿, 有机试剂难以进入样品细胞内部, 从而影响了目标化合物的提取效率。随着加水量的不断增加, 尼古丁的提取效率不断增大。当称样量(g)与加水体积(mL)的比例为1:4和1:5时, 提取效率达到最大, 其后又随着加水量的增大而降低。水相体积的不断增大使得后续NaCl饱和步骤中的饱和度不断降低, 从而减小了尼古丁在有机相中的含量。综合考虑后, 选择本试验中野生食用菌中称取0.5 g干样后加入2 mL水, 可达到较好的提取效果。
尼古丁含有一个叔胺基团和一个吡啶基团, 其pKa值分别为8.2和3.1[24], 表明尼古丁在不同的pH条件下的溶解性不同。常规情况下, 尼古丁易溶于水等大极性溶剂, 但是野生食用菌的水提物成分复杂, 不利于后续的分析测定, 因此, 本研究中首先比较了甲醇和乙腈两种常规溶剂在中性pH条件下的提取效果。结果表明这两种溶剂的提取效率较差。又分别在甲醇和乙腈提取溶剂中加入0.1%的甲酸, 提取效果仍然不好, 尼古丁由于在酸性条件下具亲水性而难以溶于有机相中。而在提取溶剂中加入0.1%的氨水可增大提取环境中的pH值, 能够有效抑制尼古丁在水中的溶解性, 使其充分溶解于有机相中。综合比较, 碱性乙腈的提取效果比碱性甲醇的提取效果好。另一方面, 比较了1%氨水、3%氨水、6%氨水、10%氨水和15%氨水-乙腈对尼古丁的提取效果。结果如图 3所示, 当氨水体积比达到6%和10%时, 提取效率达到最大(93%); 其后随着氨水比例的增大, 提取效率降低。氨水体积的不断增大, 使得提取溶剂中水相比例增大而乙腈比例减小, 影响了后续的NaCl饱和水相效果, 不利于乙腈和水相的液液萃取过程, 从而降低了尼古丁的提取效率。综上, 选取6%氨水-乙腈溶液作为提取溶剂。
选取目前常用的GCB、NH2、C18、PSA和Florisil净化填料, 分别比较了其对尼古丁的净化效果。结果表明, C18和Florisil净化填料对于尼古丁具有一定的吸附作用, 回收效果稍差(回收率为80%左右), 而NH2和PSA填料对于尼古丁的净化效果较好(回收率均为94%左右), 其次为GCB(回收率为85%左右)。如图 4所示, GCB能够有效除去提取液中的色素且不影响回收效果, 其次为PSA。鉴于野生食用菌的种类繁多, 基质复杂, 提取溶液大多含有色素及糖类物质, 如果GCB的用量过多会对尼古丁有所吸附, 而PSA对于尼古丁的吸附力较弱, 且鉴于PSA能够有效除去野生食用菌中的糖类物质, 因此, 确定将GCB和PSA作为混合填料共同对尼古丁提取溶液进行净化。
比较了GCB和PSA不同配比对于尼古丁的净化效果影响。比较了GCB和PSA分别为10 mg:190 mg、30 mg:170 mg、50 mg:150 mg、70 mg:130 mg和90 mg:110 mg的不同净化效果。结果表明, 当GCB加入量为10 mg和30 mg时, 对于提取液中的色素不能完全吸附, 加入50 mg时能够完全将提取溶液中的色素吸附, 但是当GCB的加入量继续增多时, 则会对尼古丁有一定的吸附作用, 综上, 选取GCB和PSA的添加量分别为50 mg和150 mg为优。
利用乙腈将尼古丁标准溶液稀释成不同的浓度, 测定其峰面积, 并以峰面积和相应的浓度进行线性回归; 利用野生食用菌基质进行加标并不断降低加标浓度, 当达到3倍和10倍信噪比(S/N)时所对应的加标浓度即为最低检出限和定量限。实验结果表明, 尼古丁在0.05~50.0 μg/L的范围内相关系数较好(r2=0.999 9), 定量限为0.2 μg/kg, 检出限为0.05 μg/kg。
分别以牛肝菌、羊肚菌和姬松茸为对象进行回收试验, 加标水平分别为1倍、5倍和10倍定量限, 每个水平平行试验6次。结果如表 2所示, 尼古丁的平均回收率为86.3%~96.4%, 相对标准偏差为4.4%~6.3%。
采用本方法对云南省牛肝菌、羊肚菌、姬松茸和松茸等野生食用菌样品中的尼古丁进行测定, 牛肝菌中尼古丁含量为0.038~1.011 mg/kg, 羊肚菌中尼古丁含量为0.009~0.561 mg/kg, 姬松茸中尼古丁含量为0.011~0.725 mg/kg, 松茸中尼古丁含量为0.002~0.216 mg/kg。
本文利用改进的QuEChERS方法, 系统探究了野生食用菌样品复水量与提取率的关系, 提取溶剂的选择及净化材料的选择等, 利用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱, 建立了野生食用菌中尼古丁的快速高灵敏度测定方法, 适用于目前食用菌产业中对尼古丁的快速检测工作。
2019,
Vol. 37 Issue (5): 512-517 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2018.11005 
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2019,
Vol. 37 Issue (5): 512-517 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2018.11005 PDF