药物及个人护理品(PPCPs)作为一类新型污染物因其在环境中的残留和潜在危害引起了各国环境学者的广泛关注[1-7]。抗生素是一类常见的PPCPs类物质, 已经被广泛用于人类和动物治疗，以及预防细菌、致病微生物感染的疾病中, 同时也被作为促生长药物广泛用于畜牧业和水产养殖业[8-11]。近年来抗生素被大量频繁使用, 在天然水体、沉积物、水生生物、土壤等环境介质中被广泛检出[12-17], 浓度水平多在痕量级别(ng/L~μg/L)。抗生素可在较低水平下对病原菌产生作用, 因此会使耐药菌在环境中被诱发和散播, 严重干扰生态环境, 进而给人类健康带来潜在风险[17-19]。
抗生素种类繁多, 目前还没有统一标准用于环境样品中多种抗生素的分析, 现有的分析方法主要包括薄层色谱法、毛细管电泳法、酶联免疫法、高效液相色谱-紫外/荧光法和高效液相色谱-串联质谱法等[20-26]。唐慧玲和尹鸿萍[20]利用薄层色谱-生物自显影联用原位技术检测农副产品中的抗生素残留, 结果表明100份样品中有72份检出抗生素残留; 王宁[21]建立了大体积样品堆积-区带毛细管电泳同时分离测定水产品中氟喹诺酮类和磺胺类抗生素的方法, 检出限为13~33 μg/L; 韩敏奇等[22]采用酶联免疫法快速检测长江原水中四环素的含量, 结果表明其含量均小于检出限; 王桥军等[23]采用固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定水中喹诺酮类抗生素含量, 4种目标化合物的检出限为0.083~0.248 g/L。上述4种方法仅能满足定性筛查, 以及定量分析种类和数量较少的环境样品中抗生素的含量。然而在实际抗生素污染监测中, 污染对象具有很大的不确定性, 因此开发多类别多种抗生素快速准确的分析方法就显得尤为重要。高效液相色谱-串联质谱法具有特异性强、灵敏度高等特点, 已经越来越广泛的应用于抗生素分析中。杨常青等[24]采用正、负离子同时扫描模式建立了固相萃取-液相色谱-串联质谱法对河流水体中4类16种抗生素的定量分析; 杜鹃等[25]建立了固相萃取-高效液相色谱-串联质谱同时检测水中6类23种抗生素的分析方法, 并将其应用于海水中抗生素残留的分析中。
本研究采用固相萃取-高效液相色谱-串联质谱技术, 建立了地表水中5类(磺胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类和青霉素类)40种抗生素同时定量的分析方法, 应用本方法对长江南京段16个地表水点位进行抗生素污染筛查。该法可为深入了解我国区域水环境中抗生素的赋存水平提供数据, 也可为环境生态风险提供参考依据。
超高效液相色谱-串联质谱仪(UPLC: 1 290 Infinity, 美国Agilent公司; MS: QTRAP 4 500, 美国AB SCIEX公司); 旋转蒸发仪(R-300, 瑞士Buchi公司); 萃取小柱(Oasis HLB, 美国Waters公司); 电子天平(AG-285, 瑞士Mettle公司); 超纯水仪(Milli-Q, 美国Millipore公司); 送风定温干燥箱(WF0-700W, 上海爱郎仪器有限公司)。
甲醇和乙腈(色谱纯, 德国Merck公司); 甲酸和氨水(色谱纯, 国药集团药业股份有限公司); 乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2)、磷酸和二氢钠磷酸(分析纯, 南京化学试剂有限公司)。
40种抗生素标准品包括(1)磺胺类(SAs):乙酰磺胺(SA)、磺胺吡啶(SNM)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲恶唑(SMX)、磺胺甲嘧啶(SMZ)、磺胺甲二唑(SMT)、苯甲酰磺胺(SBD)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺对甲氧嘧啶(SMD)、磺胺邻二甲氧嘧啶(SD)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺间二甲氧嘧啶钠(SDM)、磺胺噻唑(ST)、甲氧苄啶(TRI)、磺胺二甲异唑(SOX)和磺胺甲氧哒嗪(SPD); (2)喹诺酮类(FQs):诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)、洛美沙星(LOM)、恩诺沙星(ERX)、依诺沙星(ENX)、麻保沙星(MBX)、氟罗沙星(FLX)、氧氟沙星(OFX)和培氟沙星(PFLX); (3)四环素类(TCs):土霉素(OXY)、金霉素(CTE)、四环素(TCY)、土霉素(MET)和强力霉素(DOX); (4)大环内酯类(MAs):阿奇霉素(AZM)、罗红霉素(ROX)、螺旋霉素(SPI)、克林霉素(CLI)、克拉霉素(CLR)、林可霉素(LIN)、泰乐菌素(TLS)和红霉素(ERY); (5)青霉素类(Pen):青霉素G(PEN G)和氨苄西林(AMP), 以上均购自百灵威科技有限公司, 纯度均大于99.0%。
上述标准品均用甲醇配制成1 000 mg/L的标准储备液, 并用甲醇配制成20 mg/L的40种抗生素混合标准储备液, 于-20 ℃冰箱储存。使用时, 用甲醇稀释至所需浓度。
2018年8月, 沿长江南京段设置16个采样点(S1~S16), 采集表层(0~1 m)水体水样, 每个采样点一次性采集1 L, 置于棕色玻璃瓶中, 运回实验室。
用量筒准确移取1 L水样, 经0.45 μm玻璃纤维滤膜过滤除杂后, 添加5 mL 100 g/L的EDTA·Na2溶液, 用50%(v/v)磷酸水溶液调节pH值至3.0左右, 然后以4 mL/min的流速通过Oasis HLB小柱进行固相萃取。上样前, 依次用6 mL甲醇、3 mL超纯水、6 mL 100 g/L磷酸二氢钠溶液活化小柱。上样后, 用6 mL超纯水淋洗, 弃去淋洗液, 负压抽干30 min以上, 再依次用6 mL甲醇、6 mL 2%(v/v)氨水甲醇溶液洗脱, 且保持洗脱流速为1 mL/min。将洗脱液在旋转蒸发仪上蒸干, 用甲醇复溶至1 mL, 待HPLC-MS/MS分析。
色谱柱:ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm); 柱温:30 ℃; 流动相:A为0.2%(v/v)甲酸水溶液, B为乙腈; 流速:0.3 mL/min。流动相洗脱梯度:0~5 min, 99%A~90%A; 5~25 min, 90%A~50%A; 25~26 min, 50%A~99% A; 26~30 min, 99%A。进样体积:5 μL。
离子源:电喷雾电离(ESI)源, 正离子模式; 离子源温度:550 ℃; 多反应离子监测(MRM)模式; 离子喷雾电压:5 500 V; 气帘气(CUR)压力:35.0 kPa; 喷雾气(GS1)压力:60.0 kPa; 辅助加热气(GS2)压力:65.0 kPa。40种抗生素的其他质谱参数见表 1。
根据5类抗生素分子结构中的基团特征, 同时参考相关文献[25, 27], 最终选择ESI+模式进行扫描, 在MRM模式下进行监测。采用半自动的质谱进样方式, 将40种100 μg/L的标准储备液分别注入离子源, 流速为5 μL/min。
质谱分析单个抗生素标准物质, 选取响应最高的离子峰作为该物质的母离子(定量离子), 然后进行二级质谱分析, 对母离子进行破碎, 得到碎片离子, 选择2个合适的离子作为子离子(定性离子), 并对目标化合物的定量、定性离子对进行CE、DP、EP、CXP等质谱参数的优化。最终得到40种抗生素在多反应监测模式下的质谱参数(见表 1)。
在酸性条件下, 大部分目标抗生素在采用正离子(ESI+)模式扫描时响应较高[28]。因此本方法选择正离子模式进行监测分析, 并分别以甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.2%(v/v)甲酸水溶液作为流动相, 考察40种抗生素(100 μg/L)的色谱分离效果。结果表明, 以甲醇-水为流动相时，目标化合物的质谱响应较好, 但部分目标化合物未出峰, 而以乙腈-0.2%(v/v)甲酸水溶液为流动相时, 部分目标化合物的质谱响应明显增强。因此, 选择乙腈-0.2%(v/v)甲酸水溶液作为流动相。40种抗生素(100 μg/L)的总离子流色谱图见图 1。
由于抗生素种类较多，各类抗生素之间理化差异较大，使用单一的有机溶剂洗脱得不到较好的洗脱效果。采用Oasis HLB固相萃取柱富集抗生素样品时，常使用甲醇或2%(v/v)氨水甲醇溶液进行洗脱，文献[29-31]显示，采用12 mL甲醇洗脱时，非磺胺类抗生素的洗脱效果较好，而采用12 mL 2%(v/v)氨水甲醇溶液洗脱能提高磺胺类抗生素的回收率。因此，采用6 mL甲醇和6 mL 2%(v/v)氨水甲醇溶液依次对固相萃取柱进行洗脱，以保证各抗生素均可获得较高的回收率。
采用外标法定量, 分别配制1、2、5、10、20、50、100和200 μg/L的40种抗生素混合标准溶液, 用HPLC-MS/MS检测后, 以响应峰面积为纵坐标(y), 其质量浓度为横坐标(x, μg/L), 绘制标准曲线。结果表明, 在1~200 μg/L范围内, 目标化合物的峰面积与质量浓度呈良好的线性关系。以信噪比(S/N)≥3和S/N≥10定义仪器的检出限(LOD)和定量限(LOQ), 结果表明，40种抗生素的LOD和LOQ分别为0.001~1.252 μg/L和0.003~4.173 μg/L。对40种抗生素混合标准溶液(100 μg/L)连续测定3次, 连续测定3天, 计算日内和日间精密度, 结果见附表1(详见http://www.chrom-China.com, 下同)。
根据已有文献[28, 32], 大部分抗生素的暴露水平在ng/L~μg/L级别, 以去离子水为基底进行加标回收试验, 加标水平为20 ng/L和200 ng/L, 按照1.3节所述方法对样品进行处理, 设置3个平行样, 1个空白水样, 考察方法的回收率和精密度。结果表明, 各目标抗生素的加标回收率为41.3%~112.6%, 相对标准偏差为0.2%~14.0%(见附表1)。
与其他已有文献数据相比(见表 2), 回收率和检出限可以满足定量分析要求, 此外, 从总离子流色谱图(见图 1)可以看出, 40种抗生素在21 min内均可出峰。因此, 本方法具有灵敏、高效和可靠的优点。
使用建立的方法对长江南京段16个表层水体中的抗生素进行分析, 共检出4类13种抗生素(见表 3), 含量为2.3~739.4 ng/L, 其余抗生素含量均低于检出限(nd)。磺胺类抗生素检出磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺吡啶, 含量低于中国汉江平原主要河流[44](nd~37.4 ng/L, 均值13.4 ng/L)、黄河三角洲[45](2.2~764.9 ng/L, 均值259.6 ng/L)和鄱阳湖[46](nd~56.2 ng/L), 磺胺吡啶仅在S11采样点检出(8.3 ng/L)。喹诺酮类抗生素中恩诺沙星的检出率为100%, 含量范围为0.3 ~ 8.6 ng/L, 均值为1.1 ng/L, 低于中国汉江平原主要河流[44](nd~53.1 ng/L, 均值10.7 ng/L)的污染水平, 其中S11处的含量为8.6 ng/L, 可能存在点源污染; 依诺沙星和氧氟沙星分别仅在S8(16.4 ng/L)和S3(2.3 ng/L)检出, 其余喹诺酮类抗生素含量均低于检出限水平。四环素类抗生素仅检出强力霉素, 检出率为62.5%, 含量为nd~14.6 ng/L, 均值为6.2 ng/L, 低于中国香港的河流表层水[47](nd~82.2 ng/L, 均值27.0 ng/L)以及国内鄱阳湖[46](nd~39.7 ng/L)的水平。大环内酯类抗生素中阿奇霉素、罗红霉素、克林霉素、克拉霉素和林可霉素在水样中均有检出, 检出率顺序为克拉霉素＞克林霉素、林可霉素＞阿奇霉素＞罗红霉素, 而螺旋霉素、泰乐菌素和红霉素均未检出, 其中水样S14中克林霉素和林可霉素的含量分别为739.4 ng/L和22.0 ng/L, 整体上, 大环内酯类抗生素在长江南京段表层水中的含量显著低于江汉平原主要河流[29](95.1~2 910 ng/L)。
建立了SPE-HPLC-MS/MS同时测定水体中5类40种抗生素的分析方法。该方法操作简单, 灵敏度高, 稳定性好。
2019,
Vol. 37 Issue (5): 525-532 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2018.11016 
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2019,
Vol. 37 Issue (5): 525-532 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2018.11016 PDF