高效液相色谱仪(HPLC)是分析化学领域应用最广、发展最快的分析仪器之一。随着生命科学的发展, 在蛋白质组学、代谢组学、脂质组学等领域, HPLC被越来越多地应用于生物组织的分析研究[1-3]。纳升液相色谱系统是分析生物样品的常用工具, 通过使用更细内径的色谱柱和流体管路, 可以有效降低系统中样品的扩散, 提高分析的质量灵敏度, 且能够直接与质谱仪联用[4-6]。
纳升液相色谱系统的使用流速通常在每分钟几百纳升, 如此低的流速难以通过常规输液泵直接实现[7]。利用三通将常规输液泵输出的流速进行分流是实现纳升流速最常用的方法, 分流比由两条支路的阻力比决定, 且与阻力比呈倒数[8]。尽管能够通过较大的分流比实现较低流速的输出, 但由于系统阻力会随着流动相组成、色谱柱性质、温度等发生变化, 使分流流速不稳定, 并且对于梯度洗脱模式来说, 阻力小的一端排出的大量流动相难以回收再利用, 造成流动相的浪费[9]。因此, 研制无分流输液的纳升梯度泵对系统的构建及应用具有重要意义。
商品化纳升梯度输液泵主要有两种结构设计[10, 11], 一种是泵腔串联的连续输液泵结构, 另一种是利用多个切换阀控制流动相流动路径的注射泵结构, 二者都利用高精度电机和流速反馈控制保证输液精度。但前者的结构中有多个单向阀结构, 稳定性较差, 后者的结构中有多个切换阀机构, 成本较高且控制流程复杂。基于其他物理性质驱动液体的输液泵也可实现纳升流速的输送。Zhou等[12]利用载流的电渗现象驱动流动相, 研制了一种双元电渗梯度泵, 最大输出流速为490 nL/min, 最大输出压力可达40 MPa。朱玉川等[13]利用稀土超磁致伸缩材料在磁场中可发生形变的现象发明了一种超磁致伸缩液压泵, 其优点在于输出流速低, 机械结构简单, 但目前尚无实际应用的报道。基于液体受热膨胀驱动流动相流动的原理, Tao等[14]构建了一种能够实现梯度洗脱的热膨胀泵, 在500 nL/min流速条件下, 流速重复性的RSD为4%, 色谱保留时间重复性的RSD为2%, 将膨胀介质水的温度从25 ℃提高至95 ℃时, 输液压力可达100 MPa。本课题组[15]基于物质发生固液相变时体积改变的现象发明了一种相变输液泵, 其输液流速低至100 nL/min, 最大耐压可达80 MPa。上述几种输液泵虽然能够以纳升级流速输送流动相, 但系统的稳定性, 控制的复杂程度均制约其进一步的应用。
本文利用高精度直驱电机和一个高压两位十通切换阀构建了一种单程直驱超高压纳升泵, 简称纳升泵, 对其输液性能进行了评价, 并构建了一套能够用于蛋白质组学研究的纳升液相色谱系统。
纳升泵(自构建), P230Ⅱ高压恒流泵(大连依利特分析仪器有限公司), 两位六通阀C72X-6696EH(配5 μL定量环)、两位十通阀C82X-6670EUD(瑞士VICI公司), nF-1500微纳流量计(大连依利特分析仪器有限公司), K2501紫外检测器(20 nL检测池, 德国Knauer公司), LTQ XL质谱仪、Q Exactive质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)。
末端锥形的C18毛细管分离柱(150 mm×75 μm, 5 μm)、C18捕集柱(30 mm×150 μm, 5 μm)(中国科学院大连化学物理研究所1810组提供)。甲酸、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、胰蛋白酶(Trypsin, bovine pancreas)、牛血清白蛋白(BSA)均为分析纯, 购自美国Sigma公司; 丙酮、碳酸氢铵均为分析纯, 购自天津科密欧公司。乙腈(色谱纯)购于德国Merck公司, 蛋白质质量浓度为0.25 g/L的Hela细胞蛋白质提取液由中国科学院大连化学物理研究所1810组提供。超纯水(Milli-Q, 德国Millipore公司)。
BSA酶解液:取1 mg BSA溶于1 mL 50 mmol/L碳酸氢铵溶液中, 配置成1 g/L的BSA溶液。将1 mL BSA溶液(1 g/L)置于90 ℃水浴中热变性15 min, 然后加入8 μL 1 mol/L DTT, 在56 ℃水浴中反应1 h, 之后避光加入20 μL 1 mol/L IAA, 避光静置40 min, 最后加入40 μL 1 g/L trypsin(酶与蛋白质的质量比为1:25), 在37 ℃水浴下反应10 h。反应结束后, 加1 μL甲酸终止酶解, 即得到质量浓度为1 g/L的BSA酶解液。
Hela细胞蛋白质酶解液:将1 mL 0.25 g/L Hela细胞蛋白质提取液置于90 ℃水浴中热变性15 min, 然后加入8 μL 1 mol/L DTT, 在56 ℃水浴中反应1 h, 之后避光加入20 μL 1 mol/L IAA, 避光静置40 min, 最后加入40 μL 1 g/L trypsin(酶与蛋白质的质量比为4:25)在37 ℃水浴下反应16 h。反应结束后, 加1 μL甲酸终止酶解, 即得到质量浓度为0.25 g/L的Hela细胞蛋白质酶解液。
纳升泵出口与nF-1500微纳流量计相连, 流动相A、B均为纯水, 分别设定A、B泵头的流速为50、100、150、200、300、500、700和1 000 nL/min, 测试实际的输液流速, 计算实际流速与设定流速的偏差以及瞬时流速稳定性的RSD值。
用丝堵堵住纳升泵的出口, 流动相A、B均为纯水, 同时设置A、B泵头的流速为5 μL/min进行升压, 监控并记录两泵头平均压力随时间的变化情况。
纳升泵出口直接与K2501紫外检测器的检测池相连, 流动相A为纯水, 流动相B为0.6%(体积分数, 下同)丙酮水溶液。线性梯度测试条件:0~2 min, 100%A; 2~32 min, 100%A~100%B; 32~50 min, 100%A。台阶梯度测试条件:0~5 min, 5%B; 5~15 min, 20%B; 15~25 min, 35%B; 25~35 min, 50%B; 35~45 min, 65%B; 45~55 min, 80%B; 55~65 min, 95%B; 65~80 min, 5%B。流速:500 nL/min, 检测波长:254 nm。
基于捕集柱进样的纳升液相色谱系统如图 1所示。进样系统由两个切换阀组成, 两位六通阀处于虚线位时样品进入定量环, 处于实线位时样品从定量环被P230Ⅱ输送至下一个切换阀。两位十通阀采用双捕集柱结构, 虚线位时右捕集柱进行样品富集及在线除盐, 左捕集柱进行样品洗脱, 实线位时两个捕集柱状态交换。由纳升泵对富集样品后的捕集柱进行梯度洗脱, 并在C18毛细管分离柱上进行进一步分离, 最后进入质谱进行检测。
分析BSA酶解液的条件如下。利用两位六通阀手动进样1 μg BSA酶解液, 捕集流速为3 μL/min, 捕集时间为10 min。捕集结束后切换十通阀, 由纳升泵对捕集柱进行梯度洗脱。捕集流动相与纳升泵梯度洗脱的流动相A相同, 为98%水+2%乙腈+0.1%甲酸, 流动相B为98%乙腈+2%水+0.1%甲酸。分离梯度条件为:0~30 min, 5%B~40%B; 30~40 min, 80%B; 40~45 min, 80%B~5%B; 45~60 min, 5%B。流速为500 nL/min。用LTQ XL质谱仪检测。
质谱检测条件:扫描范围为m/z 400~1 800, 正离子扫描模式, 喷雾电压为1.5 kV, 毛细管加热温度为200 ℃, 归一化碰撞能量为35%。
数据库检索方法:质谱采集的原始文件通过pXtract转换后, 用Mascot(2.4.0版, MatrixScience公司)软件对序列进行检索。参数设置:母离子质量容差为0.5 Da; 碎片离子质量容差为1 Da; 蛋白质水解酶为Trypsin; 最多允许2个漏切位点; 固定修饰为carbamidomethyl (C); 可变修饰为oxidation (M)和acetyl (protein N-term)。
分析Hela细胞蛋白质酶解液的条件如下。Hela细胞蛋白质酶解液的进样量为1.25 μg。捕集条件同BSA。分离梯度条件为:0~50 min, 5%B~25%B; 50~65 min, 25%B~45%B; 65~70 min, 45%B~80%B; 70~80 min, 80%B; 80~90 min, 5%B。流速为600 nL/min。用Q Exactive质谱仪检测。
质谱检测条件:扫描范围为300~2 000 m/z, 正离子扫描模式, 喷雾电压为2.0 kV, 毛细管加热温度为250 ℃, 归一化碰撞能量为35%。
数据库检索方法:质谱采集的原始文件利用Proteome Discoverer ver.2.1.1.21进行数据库检索。参数设置:母离子质量容差为20 ppm (10-6); 碎片离子质量容差为20 mDa; 蛋白质水解酶为Trypsin; 最多允许2个漏切位点; 固定修饰为carbamidomethyl (C); 可变修饰为oxidation (M)和acetyl (protein N-term)。
为了实现纳升流速下的稳定输液, 选用了一种高精度直驱步进电机作为泵头内柱塞杆的驱动机构。设计了一种专用夹头[16], 将电机与柱塞杆刚性连接, 无其他传动机构, 因此电机的运动精度能够直接表现为柱塞杆的运动精度。电机的运动精度为每脉冲0.032 μm, 最大推力为300 N, 选用直径2 mm的柱塞杆时, 理论上输液精度为0.1 nL/脉冲, 最大压强为95.5 MPa。纳升泵的整体设计基于注射泵的结构, 图 2为结构示意图, 图 3为装置实物图。泵头上只设置一个流动相出入口, 取消了传统的单向阀结构, 输液与吸液的状态切换通过两位十通阀实现。十通阀的4个孔用丝堵堵住, 其余6个孔通过管路分别与两个溶剂瓶、两个压力变送器以及混合三通的两个入口相连。
当纳升泵对外输液时, 两个泵头输出的流动相经过各自的压力变送器进入两位十通阀, 并通过十通阀的内部通道进入混合三通。由于此状态下连接两个溶剂瓶的管路在两位十通阀处与丝堵相通, 因此溶剂瓶及管路中的液体不会自发流动。当纳升泵吸液时, 两位十通阀切换状态, 此时A、B溶剂瓶的管路在两位十通阀处分别与A、B压力变送器相通, 泵头内由于柱塞杆向后运行形成了负压, 使溶剂瓶中的流动相被吸入泵头中, 实现对泵头流动相的补充, 完成吸液。同时, 与混合三通入口相连的两个管路在十通阀处与丝堵相通, 因此能够在一定程度上减小混合三通出口外系统的压力突变, 防止因系统压力突变引起的色谱柱柱床损伤。
通常情况下, 梯度输液泵需要在两相接触的三通之后连接混合器以提高混合效果, 但在纳升流速条件下, 常规的混合器结构均会带来明显的梯度延迟, 甚至可能因为混合体积过大, 导致无法实现准确的梯度输液。本文所研制的纳升泵采用三通直接混合的方式, 以三通的中心作为混合区域, 利用流动相的分子扩散和局部涡流实现纳升流速下的流动相混合, 减小了梯度延迟。
常规的毫升级流速测量可使用质量法或体积法, 即测量一段时间内流出的液体质量或体积来计算输出流速, 但对于纳升级的流速来说, 这两种方法均不适合。实验所用的流速测量装置是一种基于温度传感的瞬时微流量计, 与常规的质量法或体积法不同, 这种流量计能够以较高的采样频率测量流体的瞬时流速, 因此更适合用来测试输液泵纳升级输出流速的准确性和稳定性[17]。在不同的设定流速下, A、B泵输出的实际流速、相对误差以及稳定性RSD值如表 1所示。测试结果表明, 实际流速与设定流速的线性相关性良好, 决定系数(R2)达到0.999 98。流速的相对误差优于1.71%, 在常用流速500 nL/min条件下的相对误差低于1%。流速稳定性RSD值均优于2.83%, 在常用流速500 nL/min条件下的RSD值低于0.7%。说明所构建的纳升泵瞬时输液流速偏差小, 稳定性好, 可以满足纳升级恒流输液的要求。
通常实验所用的毛细管色谱柱背压一般都在20 MPa以下, 但为了提高分离效率和分离度, 使用更细粒径的亚2 μm填料装填毛细管柱或装填更长的毛细管柱是常用的手段, 这会使色谱柱背压显著提高, 因此需要输液泵也能提供较高的输液压强。纳升泵的压力测试结果如图 4所示。从图中可以看出, 随着柱塞的不断运动, 系统的压力逐渐升高, 最终达到压力变送器的最大测量值100 MPa。由于电机的额定参数一般会留出20%左右的余量以防止电机在超负荷下工作造成损坏, 因此实测的最大输液压强高于理论计算值。此外, 泵头取消了单向阀结构, 无需考虑阀球阀座超高压下的密封性问题, 中心的两位十通阀同样具有100 MPa以上的耐压能力, 保证了所构建纳升泵的系统密封性良好, 满足超高压下使用的需求。
梯度洗脱是液相色谱常用的分离方法, 主要有线性梯度和台阶梯度两种模式。对输液泵进行梯度测试能够反映输液泵梯度输液的准确性、梯度变化的均匀性和梯度延迟。
纳升泵梯度测试的结果如图 5所示。图 5a中, 线性梯度3次测试的重复性良好, 梯度线性阶段变化均匀。在流动相比例开始发生变化时, B相的流速极低, 只有每分钟几纳升的瞬时流速, 但梯度曲线中并未发现梯度突变, 这表明低比例下B相的输液流速基本能够均匀变化, 进一步验证了直驱电机的运动精度能够满足纳升流速输液的需求。梯度延迟体积大约在0.7 μL左右, 这部分体积可能是由混合三通的混合处、三通至检测池的连接管路、接头等共同组成。采用流动相比例分段变化的台阶梯度可以得到输液泵的梯度准确性信息, 在图 5b的台阶梯度测试结果中, 根据各台阶的平均信号值, 计算得到梯度比例偏差在1%以内(见表 2)。
BSA是蛋白质组学研究中最常用的评价物质, 多用来评价蛋白质酶解效率或分析装置的性能[18, 19]。根据图 1构建纳升液相色谱系统, 将1 μg BSA酶解液进样分离, 得到一级谱的基峰色谱图。如图 6所示, 从图中可以看出色谱峰的分布比较均匀, 从9 min至37 min均有肽段被检测出来。数据库检索结果表明, 图 6中BSA的蛋白质序列覆盖率可达45%, 与文献[18, 19]结果相当。
Hela细胞是一种宫颈癌细胞, 广泛应用于肿瘤研究、分子生物学研究或细胞培养研究。因其细胞内的蛋白质种类繁多, 可用于评价蛋白质提取方法、酶解方法、蛋白质组分析方法或质谱仪器的性能[20, 21]。将1.25 μg Hela细胞蛋白质酶解液进样分离, 得到如图 7所示的一级谱基峰色谱图。对质谱采集数据进行数据库检索, 共匹配到2 809个蛋白质, 与文献[20, 21]中鉴定的数目相当。通过BSA酶解液与Hela细胞蛋白质酶解液的分离分析结果可以发现, 所构建的纳升液相色谱系统能够应用于蛋白质组学的分析研究中。
利用高精度直驱步进电机和两位十通阀研制了一种能够以纳升流速进行梯度输液的色谱输液泵。通过流速准确性和稳定性测试, 表明该纳升泵能够以极高的流速精度进行纳升流速稳定输液, 梯度偏差低于1%, 流速准确性和稳定性均可达到商品化仪器的水平。纳升泵的耐压能够达到100 MPa, 可用于纳升超高效液相色谱系统中。进一步利用该纳升泵构建纳升液相色谱系统, 通过对BSA酶解液和Hela细胞蛋白质酶解液进行分离分析和鉴定, 得到与文献报道结果相近的序列覆盖率和蛋白质鉴定数目。说明所研制的纳升输液泵能够满足蛋白质组学、代谢组学等领域应用的输液要求。
2019,
Vol. 37 Issue (5): 558-564 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2018.12024 
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2019,
Vol. 37 Issue (5): 558-564 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2018.12024 PDF