性激素类药物, 包括天然性激素和具有类似生物活性的半合成或全合成化合物, 其结构母核多为环戊烷多氢菲, 根据作用可分为雌激素、孕激素和雄激素。雌激素可减轻绝经期综合征的症状, 也可用于治疗痤疮及老年性骨质疏松[1]; 有文献[2]报道, 雌激素对老年人具有增强记忆力的作用。孕激素在临床上多用于避孕, 可与雌激素合并用药用于绝经期后替代治疗[3]。雄激素具有同化蛋白质的作用, 能促进骨骼肌发育[4]和骨质合成[5], 以及治疗男性性功能减退。随着年龄的增长, 性激素分泌水平降低, 人体表现出代谢减慢、脂肪增加、记忆力和精力减退、植物神经系统紊乱、骨质疏松、糖尿病高血脂等疾病加重的症状[6]。在临床上, 补充性激素类药物有严格的适应证和禁忌证, 擅自不合理地摄入性激素, 会引起内分泌失调、新陈代谢紊乱，以及增加罹患癌症的风险[7]。
近年来, 随着保健品市场的迅速发展, 出现了许多祛除斑痕、改善更年期症状、延缓衰老、增强体力的保健品。一些不法商贩为了追求经济利益, 非法添加性激素类药物, 消费者服用这些药物会严重扰乱机体正常代谢, 危害身体健康, 长期服用甚至危及生命安全。因此, 应建立测定保健品中非法添加性激素类药物的方法。
目前国内有关保健食品中性激素类药物测定的报道较少, 多为气相色谱-质谱法[8, 9]和液相色谱-质谱法[10-12], 前者的样品前处理需要衍生化[8, 9], 操作复杂, 耗时长; 后者涉及的样品种类[10]或化合物种类[11]较单一, 且离子源均采用ESI源[10-12], 未考虑离子化方式对化合物响应的影响。本研究采用固相萃取方法处理样品, 以大气压化学电离(APCI)为离子化方式, 建立了超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS)同时测定保健食品中14种性激素类药物的方法, 并检测了部分市售保健食品。所建方法前处理步骤简单高效, 稳定性好, 灵敏度高, 适用性好, 对保健食品中性激素类药物非法添加的判定提供了重要的参考价值, 为监督机构及消费者提供了技术依据, 也促进保健食品市场的进一步规范化。本研究采用APCI作为离子化方式, 可对其他研究工作中测定结构类似化合物时离子源的选用给予一定参考。
Ultimate 3000-TSQ Quantiva型超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪(美国赛默飞世尔科技公司), 配有APCI源和TraceFinder定量处理软件; HC-3018R型高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司); Milli2Q型超纯水器(美国Millipore公司); MS105、ME204E型电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)。
乙腈和甲醇(色谱纯, 德国Merck公司); 氯化钠(分析纯, 国药集团化学试剂有限公司); Oasis HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL, 美国Waters公司)。
对照品:己烯雌酚(diethylstilbestrol, 纯度99.9%)、醋酸氯地孕酮(chlormadinone acetate, 纯度100%)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate, 纯度99.2%)、炔诺酮(norethindrone, 纯度99.4%)、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate, 纯度99.6%)、米非司酮(mifepristone, 纯度99.5%)、甲基睾丸酮(methyltestosterone, 纯度100%)、雌三醇(estriol, 纯度97.4%)、己酸羟孕酮(hydroxyprogesterone caproate, 纯度99.8%)均购自中国食品药品检定研究院; 甲烯雌醇醋酸酯(melengestrol acetate, 纯度99.5%)、醋酸羟孕酮(hydroxyprogesterone acetate, 纯度99%)、孕酮(progesterone, 纯度99%)、睾丸酮(testosterone, 纯度99%)均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司; 甲炔诺酮(norgestrel, 纯度99%)购自美国Sigma-Aldrich公司, 14种性激素类药物的化学结构式见图 1。用甲醇分别配制14种性激素类药物的标准储备液, 于4 ℃冰箱冷藏保存; 分别取标准储备液适量, 配制成质量浓度约为0.01~100 μg/L的混合标准工作液。
样品为片剂, 需先研成细粉; 样品为胶囊, 需先取其内容物研成细粉.
称取处理过的样品1.0 g(精确至0.0001 g), 置于50 mL离心管中, 加入饱和氯化钠溶液3 mL(液体样品加入3 mL饱和氯化钠溶液后, 再加入0.5 g氯化钠), 涡旋5 min, 加入3 mL乙腈, 涡旋3 min, 超声提取20 min, 于-18 ℃以8000 r/min的转速离心5 min, 取乙腈层(上层); 于下层中再加入3 mL乙腈, 同法处理, 合并两次提取得到的乙腈层, 于45 ℃水浴氮气吹干, 用3 mL甲醇-水(30:70, v/v)溶解残渣, 待净化。
依次用3 mL甲醇、3 mL水活化HLB固相萃取柱, 将处理好的样品上样后, 依次用3 mL水、3 mL甲醇-水(40:60, v/v)淋洗, 再用6 mL甲醇洗脱, 收集洗脱液, 于45 ℃水浴氮气吹干, 用乙腈-10 mmol/L乙酸铵水(30:70, v/v)溶液溶解并定容至1 mL, 待测。
色谱柱:Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm); 柱温:35 ℃; 流动相:A为10 mmol/L乙酸铵水溶液, B为乙腈; 流速:0.2 mL/min。梯度洗脱程序:0~5 min, 25%B; 5~18 min, 25%B~60%B; 18~22 min, 60%B; 22~24 min, 60%B~90%B; 24~29 min, 90%B; 29~32 min, 90%B~25%B; 32~39 min, 25%B。进样体积:5 μL。
电离方式:APCI; 扫描模式:正离子/负离子; 检测方式:选择反应监测(SRM)模式; 电晕电流:4 μA(正模式)、10 μA(负模式); 鞘气流速:4.87 L/min; 辅助气流速:3.41 L/min; 反吹气流速:1.5 L/min; 离子传输管温度:350 ℃; 蒸发温度:300 ℃。
14种性激素类药物的保留时间及其他质谱参数见表 1。
液相色谱-质谱仪使用的离子源为大气压离子(API)源, 根据离子化原理分为3种, 电喷雾电离(ESI)源的原理是在流动相添加剂的帮助下, 化合物在溶液中形成带电离子, 进入ESI源, 在雾化气和高温蒸发作用下, 带电液滴逐步脱溶剂形成化合物的气态离子, ESI源适用于极性化合物的分析, 应用范围最广[13]; APCI源是在电晕放电作用下, 雾化气氮气和气化的流动相溶剂发生反应, 生成预反应离子, 预反应离子与溶剂分子反应生成反应离子H3O+和OH-, 反应离子以质子转移的方式与化合物分子反应, 形成离子, 这一过程均在气相状态中完成, 所以要求化合物易挥发, 热稳定, 适合中低极性化合物的分析[14]; 大气压光电离(APPI)源是利用紫外灯或激光的照射使气相中带有共轭双键的化合物选择性电离, 适合弱极性和非极性化合物的分析[15]。在食品药品等检测领域, ESI源应用最为广泛, 其次为APCI源, 其可作为ESI源的重要补充[14]。有研究[16]表明, 相对APCI源, 采用ESI源时的基质效应更为显著。国内已有的性激素检测类研究多采用ESI作为离子化方式[10-12], 鲜少有APCI源用于性激素类药物的检测。
在对14种性激素类药物结构进行分析时发现, 由于性激素类药物多具有含有稠环的甾体母核结构, 符合APCI源适合中低极性小分子化合物的分析特性。有文献[17, 18]报道, 采用APCI源测定雌激素和脱氢表雄酮时的基质效应更小, 离子化效率更高。本实验取1.1节配制的混合标准工作液, 分别用ESI源和APCI源进行分析, 检出限以3倍S/N计算。结果发现, 其中雌三醇、己烯雌酚、米非司酮在采用ESI源测定时的检出限较低, 甲烯雌醇醋酸酯在采用ESI源和APCI源测定时的检出限相同, 其余10种性激素类药物在采用APCI源测定时的检出限较低。分析化合物结构可知，米非司酮含有一个叔氨基, 具有较强的亲质子能力; 雌三醇和己烯雌酚均含有酚羟基, 具有较强的去质子能力, 因此这三者采用ESI源测定时响应更好。而其他大多数性激素类药物缺少类似的极性基团, 在采用ESI源测定时响应较差。综合考虑, 选择APCI源同时测定14种性激素类药物。各待测化合物选择反应监测色谱图见图 2。
由于保健食品多以动植物为原料, 基质较为复杂, 在采用液相色谱-质谱法分析时, 可能污染离子源, 或对化合物检测产生干扰。因此需要对提取后的样品进行净化。有研究[10]采用酸性氧化铝固相萃取柱和C18固相萃取柱依次净化样品, 过程较复杂, 重现性不佳。陈才军等[11]比较了NH2固相萃取柱、氧化铝固相萃取柱和HLB固相萃取柱在测定雌激素时的净化效果, HLB固相萃取柱明显优于前二者; 徐英江等[19]证实HLB固相萃取柱对大部分含雌激素样品的净化效果和回收率优于硅藻土-硅胶(SLH)固相萃取柱和Carb-NH2(石墨化炭黑-氨基串联)固相萃取柱。HLB固相萃取柱的吸附剂为N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物, 是一种亲水亲脂平衡的全能型反相吸附材料, 其pH值适用范围宽为0~14[20], 对极性和弱极性化合物均可保留, 并且具有水可润湿性, 柱床不容易干涸[21]。近年来HLB固相萃取柱越来越多的运用于食品[22, 23]、保健食品[20, 24]、农兽药残留[25, 26]和环境监测[27, 28]的分析中。结合文献[11, 19], 本实验采用HLB固相萃取柱作为净化柱, 将混合标准溶液用水稀释至适宜浓度, 上样, 采用体积分数为10%~100%的系列甲醇水溶液分别洗脱, 收集洗脱液, 按1.2.1节方法进行处理, 测定不同体积分数的甲醇作为洗脱液时性激素类药物的回收率, 结果见图 3。实验表明, 采用10%~40%(v/v)甲醇水溶液作为洗脱液时, 14种性激素类药物的回收率均为0, 采用50%~100%(v/v)甲醇水溶液作为洗脱液时, 14种性激素类药物的回收率随着甲醇体积分数的增大逐渐增大。因此, 选择40%(v/v)甲醇水溶液作为淋洗液, 100%(v/v)甲醇水溶液作为洗脱液, 可在不影响待测化合物回收率的前提下, 最大程度的去除提取液中的极性杂质, 净化基质。
在空白样品中加入混合标准溶液, 按1.2.1节描述处理, 分别取净化前和净化后的样品残渣, 用乙腈-10 mmol/L乙酸铵水(30:70, v/v)溶液溶解并定容至1 mL, 对其进行全扫描, 得到总离子流色谱图(见图 4)。可以看出, 净化后, 保留时间在3 min之前的极性较强的部分杂质被去除, 减少了对质谱的污染, 且背景噪声降低, 待测化合物的信噪比增强。
取1.1节配制的混合标准工作液, 以目标化合物定量离子的峰面积(Y)为纵坐标, 质量浓度(X, μg/L)为横坐标, 以1/x2为权重回归标准曲线(见表 2)。结果表明, 14种性激素类药物在各自的线性范围内呈现良好的线性关系, 相关系数(r)均大于0.996。检出限和定量限分别以3倍和10倍S/N计算, 结果表明，检出限为0.0990~2.09 μg/kg, 定量限为0.495~5.23 μg/kg(见表 2)。
在空白样品中加入低、中、高3个水平的混合标准溶液, 按1.2.1节样品前处理方法, 进行加标回收率的测定(n=6)。结果表明, 保健食品中14种性激素类药品的平均加标回收率为65.8%~118.8%, RSD均≤8.7%(见表 3)。
在空白样品中加入混合标准溶液, 按1.2.1节方法进行处理后, 分别保存0、2、4、8、12和24 h, 测定不同时间点14种性激素类药物的含量(见图 5)。结果发现, 在24 h内, 14种性激素类药物的稳定性良好, 其含量变化小于7.8%。
按照建立方法对不同渠道购买的不同品种多个批次保健食品(共计35批)进行分析。结果表明, 2批样品检出睾酮11.7~21.0 μg/kg; 1批样品检出孕酮36.4 μg/kg, 其余均未检出。
本实验建立了超高效液相色谱-大气压化学电离-三重四极杆质谱(UPLC-APCI-MS/MS)测定保健食品中14种性激素类药物的方法。方法灵敏度高, 前处理较简便, 回收率良好, 适合固体类保健食品和液体类保健食品中性激素类药物的检测, 同时也为其他样品中性激素类药物检测方法的建立提供参考。
2019,
Vol. 37 Issue (6): 626-633 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2018.12039 
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