色谱  2019, Vol. 37 Issue (7): 766-772     DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.01032   PDF    
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王玉娇
刘通
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陈虹
花尔并
张峰
QuEChERS-气相色谱-串联质谱法快速检测茶叶中6种禁用香精成分
王玉娇1,2, 刘通2, 邓亚美2, 王嘉琦2, 陈虹2, 花尔并1, 张峰2     
1. 天津科技大学生物工程学院, 天津 300000;
2. 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所, 北京 100176
收稿日期：2019-01-21
基金项目：北京市科技计划资助（Z171100001317009）
通讯联系人：花尔并.E-mail:huarb@tust.edu.cn; 张峰.E-mail:fengzhang@126.com
摘要：建立了QuEChERS净化作为样品前处理，结合气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）同时检测茶叶中6种禁用香精成分（香豆素、侧柏酮、2-己基噻吩、反式-β-金合欢烯、p-薄荷-1，8（10）-二烯-9-乙酸乙酯和肉桂酸丁酯）的分析方法。茶叶样品用乙酸乙酯溶液萃取，涡旋振荡，离心后上清液中加入无水硫酸镁、十八烷基键合硅胶（C18）和乙二胺-N-丙基甲硅烷（PSA），涡旋，低温离心后过滤膜，以DB-5MS色谱柱分离，MS/MS于MRM模式下测定，基质曲线外标法定量。实验结果表明，6种禁用香精成分在1~200 μg/L线性范围内呈良好线性，线性相关系数（R2）均大于0.999。方法检出限0.005~1 μg/kg，定量限0.02~2 μg/kg，平均回收率82.3%~93.1%，日内、日间精密度均小于10%。该方法处理简单、快速，准确度和灵敏度高，可用于茶叶中6种禁用香精成分的检测。
关键词：气相色谱-串联质谱    禁用香精    茶叶    
Rapid determination of six banned fragrance components in tea by QuEChERS-gas chromatography-tandem mass spectrometry
WANG Yujiao1,2, LIU Tong2, DENG Yamei2, WANG Jiaqi2, CHEN Hong2, HUA Erbing1, ZHANG Feng2     
1. College of Bioengineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300000, China;
2. Institute of Food Safety, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China
Foundation item: Beijing Municipal Science and Technology Project (No. Z171100001317009)
Abstract: QuEChERS purification was established as a sample pretreatment method and combined with gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) for the simultaneous detection of six banned fragrance components in tea (coumarin, thujone, 2-exylthiophene, trans-beta-acacene, p-mentha-1, 8(10)diene-9-ethyl acetate, and butyl cinnamate). Tea samples were extracted with ethyl acetate and subjected to whirlpool oscillation, following which anhydrous magnesium sulfate, primary secondary amine (PSA), and octadecylsilyl silica gel (C18) were added to the supernatant. After centrifugation, the supernatant was filtered over a membrane and separated on a DB-5MS column. The six compounds were determined by GC-MS/MS in MRM mode, and quantified by a matrix-matched external standard method. The six banned flavor compounds exhibited good linearity over the range of 1-200 μg/L, and the linear correlation coefficients (R2) were greater than 0.999. The limits of detection were 0.005-1 μg/kg and the limits of quantification were 0.02-2 μg/kg, the average recoveries were 82.3%-93.1%, and the intra-day and inter-day RSDs were each less than 10%. The method is simple, rapid, accurate, and sensitive, and can be used for the simultaneous detection of six banned fragrance components in tea.
Key words: gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS)     banned flavor     tea    

茶叶饮品被誉为世界三大饮料之一, 我国是世界产茶大国, 其产量和销量位居前列。目前一些茶叶生产厂家受经济利益驱动, 将香精成分添加至茶坯中, 改善和增强茶叶的香气。研究表明, 部分香精成分具有一定的毒性, 比如香豆素具有致癌性, 会导致肝退化与坏死、血管变化与海绵状血管瘤, 而侧柏酮具有神经毒性, 影响人类的身体健康[1-4]。还有一部分香精成分因为没有确切的毒理报道而被认为对人体具有潜在威胁, 因此我国食品安全管理部门、美国食品药品管理局、欧洲食品安全局(EFSA)以及国际食用香料工业组织(IOFI)等对可用于食品的香精化学成分和含量都做出了明确限定[5]。我国食品安全国家标准GB 2760-2014《食品添加剂使用标准》中规定茶叶不得添加香精香料, 但是目前茶叶中外加香精的检测方法十分欠缺。香豆素、侧柏酮、2-己基噻吩、反式- β -金合欢烯、p-薄荷-1, 8(10)-二烯-9-乙酸乙酯和肉桂酸丁酯只能以天然生成的形式存在于某些食品, 禁止作为添加剂用于茶叶。然而由于这6种禁用香精成分都是具有特定清香和芳香气味的挥发性化合物, 建立快速、准确的禁用香精成分检测方法, 对于保障茶叶质量安全和促进行业发展意义重大。

香精主要由挥发性化合物组成, 用于食品中香精成分的定量和定性检测方法主要有气相色谱法(GC)[6]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[7-9]和气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[10-12]等。在复杂基质多组分分析时, 气相色谱法存在灵敏度低和检测限高的缺点; GC-MS技术采用选择离子监测(SIM)模式对化合物进行确认, 基质复杂的样品基质干扰大, 易出现假阳性结果。GC-MS/MS是在GC-MS的基础上增加了二级质谱信息, 因此选择性和抗干扰能力更强, 定量更准确[13, 14]。QuEChERS技术基于吸附原理, 将吸附剂直接加入样品提取液中, 使之通过涡旋振荡与基质干扰物充分接触, 将干扰物吸附在吸附剂上, 达到样品净化的目的[15-17]。近年来, QuEChERS技术以其操作简单、快速、高效、成本低廉等优点得到迅速发展, 在食品领域得到了广泛应用。

目前, 针对这些香精的研究报道较少。谭丽容等[18]运用气相色谱-质谱法检测了薄荷香精中的限用物质反-2-己烯醛、α -己基肉桂醛、香豆素。周思等[19]运用固相萃取-气相色谱-质谱法测定了植物饮料中测柏酮等9种植物毒素。其余化合物尚未见报道。本文采用QuEChERS前处理技术, 同时结合GC-MS/MS技术, 建立了针对茶叶中香豆素、侧柏酮、2-己基噻吩、反式- β -金合欢烯、p-薄荷-1, 8(10)-二烯-9-乙酸乙酯和肉桂酸丁酯的检测方法。其中, QuEChERS技术操作简单、快速、高效、成本低廉; GC-MS/MS灵敏度高, 稳定性好, 定性定量准确, 抗基质干扰强。该法可为茶叶中禁用香精的精准测定提供技术支持。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

美国Agilent 7000C GC-MS/MS; GC配有7890A自动进样器、多模式进样口和DB-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m), 数据采集由MassHunter完成; VORTEX KB-3涡旋振荡器(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司); 3-30K高速冷冻离心机(德国Sigma公司)。

6种禁用香精标准品:侧柏酮(thujone)、2-己基噻吩(2-hexylthiophene)、香豆素(coumarin)、肉桂酸丁酯(butyl cinnamate)、p-薄荷-1, 8(10)-二烯-9-乙酸乙酯(p-menthol-1, 8(10)-diene-9-ethyl acetate)(纯度＞96%, 购自日本TCI公司), 反式- β -金合欢烯(trans-beta-acacene, 纯度＞98%, 购自美国ChromaDex公司), 乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、丙酮(英国Fisher Scientific公司), 乙二胺-N-丙基甲硅烷(PSA, 德国Sigma-Aldrich公司)、石墨化碳黑粉末(GCB, 德国CNW Technologies GmbH)、十八烷基键合硅胶(C18, 美国Agilent公司)、无水硫酸钠(成都市科龙化工试剂厂)。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液的配制:准确称取6种香精标准品(10.0±0.1) mg, 分别置于10 mL容量瓶中, 加入少许乙酸乙酯, 混匀, 待标准品溶解再加入乙酸乙酯, 定容至10 mL, 可得1 g/L的储备液, 在-20 ℃冰箱中保存待用。

分别精密移取6种香精的标准储备液100 μ L至10 mL容量瓶中, 用乙酸乙酯稀释并定容至10 mL, 可得10 mg/L混合标准溶液, 于4 ℃冰箱中保存待用。

1.3 样品前处理

准确称取茶叶样品1 g, 置于50 mL离心管中, 加入15 mL乙酸乙酯, 涡旋1 min混匀, 离心(25 ℃, 8 000 r/min)5 min。将上清液15 mL加入第二个50 mL离心管中, 然后加入10 mg无水硫酸镁、5 mg C18和5 mg PSA, 涡旋1 min, 低温离心5 min, 用0.22 μ m尼龙滤膜过滤后上机检测。

1.4 基质标准曲线的制备

分别称取不含目标物的空白茶叶样品1 g(精确至0.01 g), 按1.3节方法进行预处理。用基质提取液稀释标准溶液, 以峰面积(Y)为纵坐标对各被测组分的质量浓度(X, μ g/L)为横坐标作图, 绘制基质标准曲线。

1.5 GC-MS/MS条件

色谱条件:色谱柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μ m), 进样口温度250 ℃, 不分流进样; 进样量1.0 μ L; 载气为氦气(≥99.999%), 流量1.0 mL/min。升温程序:初始温度40 ℃, 保持1 min, 以30 ℃/min升到220 ℃, 保持2 min。

质谱条件:色谱-质谱接口温度280 ℃; 电子轰击(EI)离子源; 电子能量70 eV; 多反应监测模式(MRM); 溶剂延迟4 min。

2 结果与讨论
2.1 色谱条件的考察

气相色谱的升温条件是非常重要的参数。从初始温度40 ℃上升到220 ℃, 本实验考察了20、30、40 ℃/min 3种升温速度时的情况。当升温速度为40 ℃/min时, 香豆素和反式- β -金合欢烯的保留时间相近, 难以分开。20和30 ℃/min两种升温速度均可实现6种化合物的良好分离, 为节约时间, 最终选择升温程序为30 ℃/min。

2.2 质谱条件的考察

三重四极杆质谱条件的优化一般包括母离子、子离子以及碰撞能量等参数。在MRM参数优化过程中, 先通过全扫描模式选取质荷比较大且相对丰度比较高的特征碎片作为母离子, 然后将母离子进一步裂解, 选取2个或3个碎片离子作为子离子, 然后对每一对母离子/子离子以响应信号大小为依据优化碰撞能量。表 1为所有目标化合物优化后的母离子、子离子和碰撞能量的信息。图 1为6种化合物的MRM色谱图。

表 1 6种化合物的保留时间和质谱参数 Table 1 Retention time and MS parameters of the six compounds

图 1 6种禁用香精化合物的MRM色谱图 Fig. 1 MRM chromatograms of the six banned flavor compounds
2.3 QuEChERS前处理条件的优化
2.3.1 提取溶剂的选择

为了确定合适的提取溶剂, 实验以空白茶为基质, 在30 μ g/kg的加标水平下, 分别以正己烷、乙腈、乙酸乙酯、丙酮为提取溶剂, 比较6种目标物的提取效率, 结果如图 2所示。当使用正己烷为提取溶剂时, 6种化合物的回收率普遍偏高, 回收率在170.85% ~227.0%之间; 当使用乙腈为提取溶剂时, 2-己基噻吩的回收率只有50.89%, 而反式- β -金合欢烯的回收率高达171.23%;使用丙酮为萃取剂时, 除了p-薄荷-1, 8(10)-二烯-9-乙酸乙酯回收率在正常范围内(82.42%), 其余5种化合物回收率偏低, 在38.33% ~71.58%之间; 但当使用乙酸乙酯时, 回收率全部在77.67% ~99.42%之间, 可满足检测要求, 故最终选择乙酸乙酯为最佳提取溶剂。

图 2 提取溶剂对6种禁用香精化合物回收率的影响(n=3) Fig. 2 Effect of the extraction solvent on the recoveries of the six banned flavor compounds (n=3)
2.3.2 提取溶剂体积的选择

如图 3所示, 以乙酸乙酯为提取溶剂, 以加标水平30 μ g/kg的空白茶叶为基质, 以回收率为指标, 考察不同提取溶剂体积(3、5、8、10、15和20 mL)对各目标物提取效率的影响。随着提取溶剂体积的增大, 目标物的回收率增加; 当提取溶剂体积为10 mL时, 回收率基本趋于稳定。为了确保回收率的稳定, 最后选择15 mL作为提取溶剂的用量。

图 3 提取溶剂体积对6种禁用香精化合物回收率的影响(n=3) Fig. 3 Effect of the volume of extraction solvent on the recoveries of the six banned flavor compounds (n=3)
2.3.3 净化方法的选择

茶叶的基质复杂, 含有色素、碳水化合物、茶多酚、脂类化合物等杂质。PSA、C18、GCB是QuEChERS前处理方法中常用的吸附剂。PSA可通过极性吸附作用、阴离子交换作用去除多酚、脂类等极性较强的杂质。C18对脂肪的去除效果明显。GCB主要用于吸附色素。本实验考察了分别加入10 mg GCB、10 mg C18和10 mg PSA, 或5 mg PSA+5 mg C18吸附剂时的回收率。实验结果如图 4所示:C18对目标化合物吸附性较强, 回收率在72%以下; 当使用GCB和PSA为净化材料时, p-薄荷-1, 8(10)-二烯-9-乙酸乙酯的回收率较低, 分别为70.01%和74.40%;当同时使用PSA和C18时, 净化效果最好, 化合物的回收率在93.52% ~105.82%之间。另外, 吸附剂用量是影响前处理净化效果和回收率的重要因素。如果使用量小, 净化效果不明显; 如果使用量大, 净化效果明显但回收率低, 不能满足检测要求。通过实验最终确定PSA用量为5 mg, C18用量为5 mg。

图 4 净化材料对6种禁用香精化合物回收率的影响(n=3) Fig. 4 Effect of the purification material on the recoveries of the six banned flavor compounds (n=3)
2.3.4 无水硫酸镁用量的优化

无水硫酸镁作为脱水剂具有强大的吸水能力, 与水结合后放出热量, 有利于目标物的提取。如无水硫酸镁用量过少, 会造成吸水不充分; 其用量过多, 会导致回收率偏低。因此有必要考察无水硫酸镁的用量。在提取过程中, 分别考察了5、10、20、30和40 mg无水硫酸镁时的回收率, 其他条件不变。结果如图 5所示, 10 mg硫酸镁能完全去除样品中的水, 提取回收率较合理; 随着硫酸镁用量的增加, 回收率逐渐降低。因此, 最终选择无水硫酸镁的用量为10 mg。

图 5 硫酸镁用量对6种禁用香精化合物回收率的影响(n=3) Fig. 5 Effect of the amount of magnesium sulfate on the recoveries of the six banned flavor compounds (n=3)
2.4 基质效应的考察

基质效应普遍存在于痕量物质的分析过程中, 并会给定量结果造成影响。本实验以基质匹配标准曲线与纯溶剂标准曲线斜率之比来确定基质效应(ME)[20]:

(1)

其中, Ss是基质匹配曲线的斜率, Sm是标准曲线的斜率。当-50%＜ME＜50%时, 该化合物的基质效应不明显。当ME＜-50%或ME＞50%时, 该化合物的基质效应明显。实验结果如表 2所示, 6种香精化合物中除了侧柏酮和2-己基噻吩, 其余化合物均表现出一定的基质效应。因此在实际检测时, 为保证结果准确, 采用基质匹配标准曲线对化合物进行定量分析。

表 2 6种禁用香精化合物的基质效应 Table 2 Matrix effects (ME) of the six banned flavor compounds
2.5 方法验证
2.5.1 检出限、定量限和线性范围

配制6种化合物的基质标准溶液(1~200 μ g/L), 以峰面积(Y)为纵坐标, 质量浓度(X, μ g/L)为横坐标, 绘制标准曲线。6种化合物在1~200 μ g/L范围内呈良好的线性关系, 其线性相关系数(R2)均大于0.999。在空白样品中分别添加一系列浓度的混合标准溶液, 进行前处理和测定, 以3倍信噪比确定方法的检出限(LOD), 以10倍信噪比确定方法的定量限(LOQ)。如表 3所示, 各化合物的检出限和定量限分别在0.005~0.1 μ g/kg和0.02~2 μ g/kg范围内, 表明该方法可以满足复杂基质中痕量物质检测的要求。其中侧柏酮和香豆素的定量限分别是0.02 μ g/kg和1 μ g/kg, 比文献[18, 19]报道中GC-MS的检测下限(2.4 μ g/kg和30 μ g/kg)大幅降低, 表明本方法有效地降低了茶叶中其他杂质和基质背景的干扰, 具有更高的检测灵敏度。

表 3 6种禁用香精化合物的线性范围、相关系数、检出限和定量限 Table 3 Linear ranges, correlation coefficients (R2), limits of detection and limits of quantitation of the six banned flavor compounds
2.5.2 回收率和精密度

取空白茶叶样品1 g, 分别添加3个水平(1、2、4倍定量限)的标准储备液, 进行加标回收试验, 每个水平做6次平行, 计算平均回收率和日内、日间精密度。结果如表 4所示, 6种化合物的平均回收率是82.3% ~93.1%, 日内精密度在1.4% ~4.1%之间, 日间精密度在2.3% ~6.5%之间。

表 4 6种禁用香精化合物在茶叶中的添加回收率、日内精密度和日间精密度(n=6) Table 4 Recoveries, intra-day precisions and inter-day precisions of the six banned flavor compounds spiked in tea (n=6)
2.5.3 实际样品检测

针对10个市售的茶叶样品, 用本文建立的方法进行检测。结果如表 5所示, 2-己基噻吩、p-薄荷-1, 8(10)-二烯-9-乙酸乙酯、反式- β -金合欢烯、香豆素、肉桂酸丁酯5种化合物在实际样品中均未检出, 而侧柏酮则在其中的8个样品中检出, 含量最高达到268.225 μ g/kg(色谱图见图 6)。我国目前尚未有茶叶中侧柏酮含量的限量标准。欧盟法规EC 1334/2008条例中规定, 青蒿生产的饮料中侧柏酮含量不得高于0.5 mg/kg(不含酒精饮料)和35 mg/kg(含酒精饮料), 非青蒿生产的饮料中侧柏酮含量不得高于10 mg/kg(含酒精饮料)。侧柏酮有可能是茶叶样品中的内源性天然成分, 有必要对其来源开展进一步研究。

表 5 10个实际样品的检测结果 Table 5 Determined results of ten real samples

图 6 阳性样品的色谱图 Fig. 6 Chromatogram of a positive sample
3 结论

本文利用QuEChERS技术同步提取和净化茶叶样品, 结合GC-MS/MS建立了快速测定茶叶中6种禁用香精成分的分析方法。方法学评价和实际样品检测结果表明, 该方法操作简便, 灵敏度高, 净化效果较好, 可用于茶叶中多种禁用香精的检测。

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