Alpert^[1]于1990年首次提出亲水作用色谱(HILIC)的概念。HILIC的固定相表面通常键合极性基团, 流动相则一般由60%~95%的乙腈和水或者缓冲溶液混合组成^[2], 解决了极性化合物在正相色谱(NPLC)中溶解度差、在反相色谱(RPLC)中保留弱的难题, 且流动相中高含量的有机溶剂使得其非常适合与质谱联用^[3]。由于HILIC在分离极性化合物上独到的优势, 近年来其在药物化学、糖原组学、蛋白质组学、代谢组学、环境科学、农业和食品化学等领域的应用愈加广泛^[4]。

亲水固定相的研究是亲水色谱研究的核心内容。而高性能色谱固定相的研制更是促进亲水色谱发展的关键。亲水色谱固定相的键合相种类非常丰富, 商家提供的商品化亲水色谱柱以及各种学术报道和文献中出现的亲水作用色谱材料种类层出不穷^[4-6]。目前在亲水作用色谱柱中应用比较广泛的有未衍生化硅胶、醇基、氰基、氨基、糖类、酰胺、聚(琥珀酰亚胺)等键合固定相^[7-9]。这些固定相的制备和研究极大促进了HILIC的发展和应用。

两性色谱固定相是亲水色谱固定相中比较特殊的一种, 由于其表面同时含有带正负电荷的基团, 极大地增强了固定相的极性, 在分离极性化合物上有独特的优势^[10]。通常制备两性固定相是在色谱硅胶表面通过化学反应同时引入含正负电荷的基团, 而正负电荷在硅胶表面的空间排布以及带电基团的种类对固定相的色谱行为将产生决定性的影响^[11-13]。

如图 1所示, a、b为早期出现的两性固定相构型^[14-18]。a构型最经典的代表是磷酸胆碱型两性固定相, 其正负电荷分布与硅胶表面垂直, 近端为带负电的膦酸基团, 远端为季铵盐基团。硫代甜菜碱型两性固定相则是b构型的典型, 其近端为带正电的季铵盐基团, 末端为带负电荷的磺酸根。近年来, 类似构型的两性固定相也相继出现, 如Qiao等^[4]合成的咪唑磺酸根两性固定相、Armstrong等^[11]制备了3-P, P-二苯基磷-丙基磺酸根型两性固定相。这些两性固定相在极性化合物的分离上取得了很好的效果, 其中咪唑磺酸根两性固定相在分离胞嘧啶时理论塔板数可以达到100000 plates/m。这些两性固定相表面的带电基团都有较强的离子交换能力, 一般情况下很难通过调节流动相的pH值去改变固定相本身的带电情况。

图 1

Fig. 1

图 1 两性固定相构型示意图 Fig. 1 Immobilized patterns of zwitterionic stationary phases X+: positively charged groups; Y-: negatively charged groups.

Shen等^[19]制备了如图 1c所示的一种新构型的两性固定相, 他们通过点击化学反应将半胱氨酸引入到硅胶表面, 其正负电荷排布与硅胶表面平行, 可以与分析物充分地接触。这种固定相的表面是具有弱离子交换能力的羧基和氨基, 可以通过改变流动相的酸碱度来调节固定相的带电状态, 这使固定相在分离带电化合物时可以更加灵活地调整流动相条件来达到想要的分离选择性, 进一步扩大了这种固定相的应用范围。他们将这种固定相应用在碱性化合物、多肽和多聚糖的分离上, 效果显著。

在本课题组的早期工作中, 通过对氨基键合硅胶进一步改性, 在其表面引入磷酸基团, 制备了一种如图 1d构型的两性固定相, 并将其成功应用在有机酸、核苷以及水溶性维生素的分离中^[20]。由于这份工作中无法定量地调节氨基与磷酸基团的比例, 尝试将不同比例的氨基和巯基的硅烷偶联剂键合到硅胶表面, 再利用巯基与乙烯基膦酸之间的点击化学反应将膦酸基团引入到硅胶表面, 制备了一种可调节正负离子比例的两性亲水色谱固定相。通过元素分析表征了固定相的成功合成, 并通过N、P元素的质量分数确定氨基与膦酸基团的比例。选取一系列经典的极性小分子, 考查了分析物在固定相上的保留机理。最后通过比较核苷、水溶性维生素、碱性化合物、苯甲酸这几类标准物质在3种色谱柱上的保留行为来对比3种不同电荷比例的固定相的分离选择性与色谱性能。结果表明, 对于不同的分析物, 3种固定相表现出完全不同的分离选择性和色谱行为。表明此类固定相在极性化合物的分离上具有良好的应用前景。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Vario EL Ⅲ Universal CHNOS型元素分析仪(德国Elementar公司); 比表面及孔径分析仪(北京精微高博科学技术有限公司); 1200型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)。

球形硅胶(直径5 μm, 孔径10 nm, 比表面积300 m²/g, 日本DAISOGEL公司); 维生素(B1、B2、B3、B3-amide、B6、B12)、乙烯基膦酸、克伦特罗、核苷与碱基、2, 2′-偶氮二异丁腈(AIBN)、茶碱、黄连素、普鲁卡因、药根碱购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司; γ-巯丙基三乙氧基硅烷(MPTS)、N-β-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(NAPTS)购自武大有机硅新材料公司; 乙腈、甲醇、丙酮、甲苯、乙酸、乙酸铵、苯甲酸类物质购自上海国药试剂。以上试剂均为分析纯。实验所用蒸馏水均采用Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)纯化。

1.2 实验条件

1.2.1 固定相的制备

如图 2所示, 首先按3种不同反应物比例制备了同时键合有巯基与氨基的固定相(mercapto-amino based stationary phases, MAS)。将5 g活化硅胶分散于30 mL甲苯中, 按表 1中的投料比加入所需反应物, 在N₂保护下于110 ℃回流反应24 h后过滤, 洗涤后真空干燥过夜。取5 g制得的MAS-1、MAS-2和MAS-3分别分散于100 mL无水甲醇中, 加入1 g乙烯基膦酸(过量)与30 mg AIBN, 于60 ℃下机械搅拌回流反应24 h。分别用甲苯、乙醇、水和丙酮洗涤3次后, 于60 ℃真空环境下干燥过夜, 即得氨基膦酸键合硅胶(amino-phosphate-based stationary phases, 分别命名为APS-1、APS-2和APS-3)。

图 2

Fig. 2

图 2 两性硅胶固定相氨基膦酸键合硅胶(APS)的合成过程 Fig. 2 Synthesis procedure for the zwitterionic silica stationary phases (amino-phosphate-based stationary phases, APS) MAS: mercapto-amino based stationary phases; MeOH: methanol; AIBN: 2, 2′-azobis (2-methylpropionitrile).

表 1 (Table 1)

表 1 3种MAS固定相的制备反应投料比 Table 1 Reaction ratios for the preparation of three mercapto-amino based stationary phases (MAS) MAS Silica/g N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine/g (3-Mercaptopropyl)triethoxysilane/g n(NAPTS):n(MPTS) MAS-1 5 1.60 1.72 1:1 MAS-2 5 0.91 2.45 1:2.5 MAS-3 5 0.64 2.75 1:4

表 1 3种MAS固定相的制备反应投料比 Table 1 Reaction ratios for the preparation of three mercapto-amino based stationary phases (MAS)

1.2.2 色谱柱的填装

以甲醇作为淋洗剂, 异丙醇为匀浆剂, 用装柱机在50 MPa的压力下填装30 min, 将所得的不同离子比例的两性固定相填装入150 mm×4.6 mm的不锈钢色谱柱中。

1.2.3 色谱条件

色谱分离均在安捷伦1200 HPLC系统上进行。流动相为不同比例的有机溶剂与缓冲盐溶液的混合物, 过滤与超声脱气处理后使用。流动相流速为1 mL/min; 柱温为30 ℃; 检测波长为254或230 nm。所有的色谱测量均重复3次以上。

2 结果与讨论

2.1 材料表征

首先对反应前活化硅胶以及合成的不同基团比例的MAS与APS材料进行了孔径及比表面分析的对比。如表 2所示, 同反应前的活化硅胶相比, MAS与APS材料的比表面、平均孔径都明显减小, 表明相关的基团已成功键合到硅胶表面。为了进一步表征固定相的成功合成, 对活化硅胶、MAS以及APS进行了元素分析, 其中C、N元素的含量通过元素分析仪检测, P元素含量通过钼蓝法测得。如表 2所示, MAS中C与N的含量在反应后明显增加, 表明氨基已成功引入到硅胶表面。APS中P元素的含量较MAS中的含量明显增加则表明膦酸基团已通过乙烯基与巯基之间的点击化学反应成功键合到硅胶表面。由于乙烯基膦酸和巯基之间的反应效率不可能达到100%, 所以不能完全准确地通过改变反应物比例来控制最终APS固定相材料中正负电荷的比例, 但仍可以通过测定APS中N与P的质量分数来确定氨基与膦酸基团的摩尔比。表 2根据测得的N与P的质量分数列出了APS固定相填料中实际的氨基与膦酸基团的比例。综上, 氨基与膦酸基团已成功引入到硅胶固定相的表面。

表 2 (Table 2)

表 2 孔结构与元素分析结果 Table 2 Pore structure and elemental analysis results Sample Specific surface/(m2/g) Average pore size/nm w(C)/% w(N)/% w(P)/% n(-NH2):n(-PO(OH)2) Silica 303 10.2 ND ND ND ND MAS-1 201 9.0 8.817 1.230 ND ND MAS-2 212 9.1 8.872 0.684 ND ND MAS-3 215 9.1 8.901 0.481 ND ND APS-1 190 8.5 8.760 1.222 0.649 2.08:1 APS-2 205 8.7 8.738 0.676 1.071 1:1.43 APS-3 207 8.6 8.764 0.473 1.494 1:2.85 ND: not detected.

表 2 孔结构与元素分析结果 Table 2 Pore structure and elemental analysis results

2.2 固定相的色谱行为研究

2.2.1 流动相中乙腈含量对分析物保留的影响

分析物在固定相上的保留与流动相组成息息相关^[21]。保持流动相中缓冲盐的浓度和pH值不变, 考察了流动相中乙腈含量对常见极性化合物在固定相上保留的影响。以APS-1色谱柱为例, 如图 3所示, 选取烟酰胺、胞嘧啶、腺苷、尿苷、胞苷、脱氧胞苷为分析物, 保持流动相中乙酸铵缓冲盐浓度为50 mmol/L, pH值为6.5, 调节流动相中乙腈含量从70%至90%。这些极性分析物在色谱柱上的保留随着流动相中乙腈含量不断增大而逐渐增强, 表现出典型的亲水保留特征。

图 3

Fig. 3

图 3 乙腈含量对分析物在APS固定相上保留因子(k)的影响 Fig. 3 Effects of acetonitrile content on the retention factor (k) of tested analytes on the APS stationary phases

长期以来亲水色谱的溶质保留机理存在着一定程度的争议。主流的观点认为在分离过程中, 极性固定相的表面会吸附流动相中的水分子, 使得固定相的表面形成水层, 约4%~13%的硅胶孔体积会被水分子占据。溶质分子会在水层与流动相之间达到分配平衡^{[1, 22, 23]}。该观点认为溶质的保留因子与流动相水含量之间存在这样的关系式:

(1)

其中k为溶质分子的保留因子, k_w为仅用乙腈为流动相时溶质的保留因子, φ为流动相中水的含量, S为lg k对φ线性拟合时的斜率。

另一种观点则为正相色谱中常见的吸附机理^{[24, 25]}。这种理论认为极性分析物与极性固定相之间存在着一种吸附与解析的过程。这种观点早期不被大家所接受的原因是:通常正相色谱中流动相是不含水的, 因为水的极性比较大, 会迅速占据吸附位点导致分析物的保留减弱。而亲水色谱的流动相中含有较多的水分子, 如果分析物是通过吸附作用于固定相上的话会被水分子迅速替换掉。然而随着对HILIC保留机理的研究越来越深入, 越来越多的文献^[19-21]报道氢键作用、偶极矩作用以及静电作用均能与溶质分子产生吸附作用。因此仍有不少人认同HILIC中的吸附机理。该观点中保留因子与流动相中水含量的关系式:

(2)

其中n是固定相表面单位面积上溶质分子与水分子的物质的量之比。

近年来有相关色谱工作^[26]对于HILIC的保留机理提出了一种新的理论, 该理论认为在亲水色谱中, 分析物在固定相表面所吸附的水层与流动相之间存在着分配作用, 而由于固定相结构的复杂性, 极性分析物与固定相表面之间的静电作用以及氢键作用也不可避免, 导致了分析物在固定相上是多重保留机理, 分析物的保留因子与流动相中水的含量存在如下的关系:

(3)

其中a在一定条件下为常数, m₁同式(1)中的-S, m₂同式(2)中的n。

依照这3种模型采用多重回归分析考察了分析物在3种不同离子比例的固定相上的保留和水含量之间的关系, 进一步探讨固定相的保留机理。表 3列出了分析物在APS-1、APS-2、APS-3色谱柱上的保留随流动相中水含量的关系, 采用3种理论模型进行多重回归分析得到相关系数。从表中可以看出, 对于3种色谱柱而言, 模型(3)的相关系数最接近1。表明极性化合物在3种色谱柱上的保留是多重保留机理而不是单纯的分配或者吸附机理。

表 3 (Table 3)

表 3 分析物在3种APS色谱柱上的保留与流动相中水含量根据方程(1)、(2)和(3)拟合的相关系数(r) Table 3 Correlation coefficients (r) of fitting the equations (1), (2) and (3) for the retention of the tested analytes vs. water content of the mobile phase on the three APS-columns Test solute r (APS-1) r (APS-2) r (APS-3) Eq. (1) Eq. (2) Eq. (3) Eq. (1) Eq. (2) Eq. (3) Eq. (1) Eq. (2) Eq. (3) Nicotinamide 0.9498 0.9488 0.9980 0.9792 0.9978 0.9993 0.9717 0.9986 0.9990 Cytosine 0.9760 0.9967 0.9973 0.9724 0.9996 0.9994 0.9699 0.9997 0.9998 Adenosine 0.9971 0.9818 0.9992 0.9947 0.9855 0.9973 0.9841 0.9963 0.9983 Uridine 0.9955 0.9848 0.9995 0.9865 0.9947 0.9983 0.9785 0.9983 0.9990 Cytidine 0.9814 0.9965 0.9999 0.9630 0.9999 0.9999 0.9646 0.9996 0.9998 2′-Deoxycytidine 0.9849 0.9955 0.9994 0.9809 0.9970 0.9989 0.9745 0.9991 0.9993 Eq.: equation.

表 3 分析物在3种APS色谱柱上的保留与流动相中水含量根据方程(1)、(2)和(3)拟合的相关系数(r) Table 3 Correlation coefficients (r) of fitting the equations (1), (2) and (3) for the retention of the tested analytes vs. water content of the mobile phase on the three APS-columns

2.2.2 流动相pH值对分析物保留的影响

流动相酸碱度可以改变溶质分子与固定相的带电情况, 从而对分析物的保留行为产生非常重要的影响^[27]。固定流动相中乙腈含量为80%, 乙酸铵缓冲盐浓度为100 mmol/L。选取苯甲酸、水杨酸、维生素B3、维生素B1、克伦特罗、烟酰胺为探针分子, 对比了这些分析物在3种固定相APS-1、APS-2、APS-3上的保留随着pH从3.5~6.5的变化趋势。如图 4所示, 在APS-1上, 苯甲酸(pK_a=4.2)所带负电荷随着pH从6.5~3.5逐渐减少, 与带正电荷的固定相之间的静电吸引逐渐减弱, 故其保留时间逐渐减小。另一种酸性物质水杨酸的保留时间变化趋势则与之完全相反, 这是由于随着流动相的pH值逐渐降低, 水杨酸的分子内氢键被逐渐破坏, 与固定相之间的氢键作用逐渐增强, 故保留增强。VB3有着特殊的结构, 表面含两个可电离基团叔氨基(pK_a=3.0)与羧基(pK_a=3.8)。当pH从6.5变至3.5时, VB3从带负电荷慢慢转变成带正电荷, 与其在固定相上的保留先增强再减弱的行为是一致的。这3种物质在APS-2和APS-3上的保留变化趋势非常相似, 都随着pH值降低保留逐渐增强。这是由于在此条件下, 带负电荷的固定相与分析物均随着pH值降低所带负电荷逐渐减少, 静电排斥力减弱。其中例外的是苯甲酸在APS-2与APS-3上的保留在pH为3.5时急剧减弱, 这是由于苯甲酸pK_a为4.2, 在pH为3.5时多数以电中性分子状态存在, 极性大大减小, 与固定相之间的亲水作用减弱。APS-2与APS-3上碱性物质VB1与克伦特罗随着pH值降低、保留减弱则是由于固定相所带负电荷逐渐减少使其与分析物之间的静电吸引力减弱。VB1与克伦特罗在APS-1上保留较弱, 保留时间几乎不变。中性物质烟酰胺的保留则在APS-1、APS-2、APS-3这3种固定相上几乎不随pH改变而变化。

图 4

Fig. 4

图 4 流动相缓冲液pH值对分析物在3种APS固定相上k的影响 Fig. 4 Effect of buffer pH in the mobile phase on k of tested solutes on the three APS columns Mobile phase: acetonitrile (ACN)-100 mmol/L ammonium acetate (80:20, v/v). VB: vitamin B.

2.2.3 流动相盐浓度对分析物保留的影响

流动相中缓冲盐的存在能极大地影响分析物的保留^[28]。固定流动相中乙腈的含量为80%、缓冲盐pH值为6.5, 调节缓冲盐浓度为5、25、50、75、100 mmol/L。对比了苯甲酸、水杨酸、VB3、VB1以及克伦特罗等5种极性分析物在APS-1、APS-2、APS-3固定相上的保留随盐浓度变化的趋势, 如图 5所示。对于APS-1而言, 盐浓度的增加削弱了带正电荷的碱性物质VB1、克伦特罗与带正电的固定相之间的静电排斥力, 导致其保留随盐浓度增大而逐渐增强。反之, 酸性物质(苯甲酸、水杨酸以及VB3)的保留因子均随盐浓度增加而减小, 则是由于盐浓度的增加削弱了分析物与固定相之间的静电吸引作用。而在APS-2与APS-3上, 膦酸基团占主导地位, 故其在实验条件中带负电荷, 与APS-1恰好相反, 所以分析物在APS-2与APS-3上的保留随盐浓度的变化趋势与APS-1截然相反。分析物在APS-2与APS-3上的保留行为变化趋势类似, 但是由于所键合基团的比例不同, 故其在两种色谱柱上的保留因子随盐浓度变化的幅度也存在一定差异。

图 5

Fig. 5

图 5 流动相中盐浓度对分析物在3种APS固定相上k的影响 Fig. 5 Effect of buffer concentration in the mobile phase on k of the tested solutes on the three APS columns Mobile phase: ACN-ammonium acetate (80:20, v/v, pH 6.5).c: buffer concentration, mmol/L.

2.3 固定相分离选择性对比

为进一步对比APS-1、APS-2、APS-3这3种固定相的色谱性能, 探讨两性固定相中不同的基团比例对固定相分离选择性的影响, 选取了核苷、水溶性维生素、有机酸、碱性物质这几类常见极性化合物为分析物, 在相同的色谱条件下对比了这些分析物在3种色谱柱上的分离情况。

核苷是核酸的主要组分, 在细胞内具有非常显著的生理功能, 近年来更是作为肿瘤过程的潜在生物标志物, 在生物化学分析中愈发引起重视^[5]。它们同时也是亲水固定相色谱评价的常见标准品。如图 6a为3种APS固定相对9种核苷和碱基的分离图。从图中可以看出, APS-1能提供最佳的分离效果和峰形, 美中不足的是胸苷和2′-脱氧腺苷在同一时间出峰。APS-2则在此色谱条件下能较好地分离这些核苷类物质。而APS-3的分离效果不甚理想。

图 6

Fig. 6

图 6 (a) 核苷类物质、(b)水溶性维生素、(c)有机酸及(d)碱性物质在APS-1、APS-2、APS-3色谱柱上的分离 Fig. 6 Separation of (a) nucleosides, (b) water-soluble vitamins, (c) organic acids and (d) basic compounds on APS columns a. Mobile phase: ACN-water (85:15, v/v). Peak Nos.: 1. thymidine; 2. 2′-deoxyadenosine; 3. adenosine; 4. 2′-deoxycytidine; 5. uridine; 6. cytidine; 7. 2′-deoxyguanosine; 8. guanosine; 9. inosine. b. Mobile phase: ACN-50 mmol/L ammonium acetate (80:20, v/v, pH 6.5). Peak Nos.: 1. nicotinamide; 2. VB6; 3. VB2; 4. VB1; 5. VB3; 6. VB12. c. Mobile phase: ACN-50 mmol/L ammonium acetate (85:15, v/v, pH 4.0). Peak Nos.: 1. anthranilic acid; 2. 4-nitrobenzoic acid; 3. benzoic acid; 4. 4-hydroxybenzoic acid; 5. 2-bromobenzoic acid. d. Mobile phase: ACN-50 mmol/L ammonium acetate (85:15, v/v, pH 4.0). Peak Nos.: 1. theophylline; 2. berberine; 3. jateorhizine; 4. procaine; 5. clenbuterol.

维生素是一类非常重要的微量有机物质, 在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。水溶性维生素极性适中, 常作为亲水评价的探针分子^[29]。试验选取了烟酰胺、VB1、VB2、VB3、VB6、VB12 6种水溶性维生素为分析物, 对比了它们在3种APS色谱柱上的分离效果。如图 6b所示, 3种固定相都对水溶性维生素有较好的分离效果。而由于固定相的极性以及带电情况不同, 6种水溶性维生素的保留时间存在着一定的差异。VB6在研究条件下带正电荷, 故其在带负电荷的APS-2与APS-3色谱柱上保留时间更长。而VB3在流动相中带负电荷, 与带正电荷的APS-1固定相产生静电吸引导致保留增强, 与带负电荷的APS-2与APS-3产生静电排斥导致保留减弱。

苯甲酸及其衍生物是一类非常重要的工业原料及医药中间体, 选取5种苯甲酸类物质进一步考察3种APS固定相的表面带电情况及其对酸性物质的分离选择性。如图 6c所示, 由于苯甲酸在此色谱条件下带负电荷, 与带负电荷的APS-2与APS-3固定相产生静电排斥, 保留大大减弱, 所以几种苯甲酸类物质集中在前几分钟出峰。而APS-1对于这类苯甲酸物质有着极佳的分离选择性和峰形。因此在分离酸性物质时, APS-1是更佳的选择。

碱性药品在日常生活中应用非常广泛, 选取常见的5种碱性物质作为分析物来对比3种APS固定相对碱性物质的分离选择性。如图 6d所示, 碱性物质由于带正电荷, 在带正电的APS-1固定相上保留极弱。APS-2与APS-3提供了更佳的分离选择性。反常的是带负电荷更多的APS-3固定相对于碱性化合物的分离选择性反而不如APS-2, 推测是分析物的保留不仅与固定相的带电情况有关, 在很大程度上也与固定相的极性有关, APS-3固定相的极性没有APS-2大, 导致对于这几种碱性物质的保留较弱。

结果表明, 这3种不同基团比例的APS色谱柱在核苷、水溶性维生素、有机酸、碱性物质等4类常见化合物的分离中表现出不同的分离选择性。因此可以根据实际应用中分析物的带电特性来选择合适离子比例的APS固定相, 表明固定相具有良好的应用潜力。

2.4 固定相稳定性和重现性的考察

进一步考察了固定相的稳定性与重现性。首先分别用pH值为2和9的溶液持续浸泡所制备的固定相24 h后装柱, 并选取腺苷和胞苷为分析物, 与不经过处理的APS-1色谱柱对比了保留因子与柱效。

如表 4所示, 在经过pH为2的酸性溶液与pH为9的碱性溶液浸泡后的固定相上, 腺苷与胞苷的保留因子与柱效和未处理的APS-1色谱柱无明显差异。表明固定相具有良好的稳定性。

表 4 (Table 4)

表 4 APS色谱柱稳定性考察 Table 4 Investigation of the stability of APS columns Column Conditions Adenosine Cytidine k N/(plates/m) k N/(plates/m) APS-1 acid treatment for 24 h 0.81 59000 2.20 70000 alkali treatment for 24 h 0.81 59500 2.18 71000 initial column 0.83 59800 2.21 70300 APS-2 acid treatment for 24 h 1.11 45600 3.57 51000 alkali treatment for 24 h 1.09 45300 3.55 51400 initial column 1.08 44700 3.59 50500 APS-3 acid treatment for 24 h 1.14 39100 2.50 52700 alkali treatment for 24 h 1.12 39100 2.49 53100 initial column 1.12 38700 2.52 53300 N: theoretical plate numbers.

表 4 APS色谱柱稳定性考察 Table 4 Investigation of the stability of APS columns

接着对所合成的不同批次的固定相的色谱重现性进行了考察。以核苷类物质为分析物, 对比了它们在不同批次的APS固定相上的保留因子、柱效以及色谱峰的对称性。如表 5所示, 不同批次间的APS固定相的色谱行为几乎一致, 证明了固定相具有良好的重现性。

表 5 (Table 5)

表 5 3种色谱柱不同批次间的色谱数据 Table 5 Chromatographic data for different batches of the three types of columns Column Batch Thymidine 2′-Deoxycytidine 2′-Deoxyguanosine k N/(plates/m) fAS k N/(plates/m) fAS k N/(plates/m) fAS APS-1 1 0.45 61100 0.90 1.35 80000 0.99 3.57 62000 1.03 2 0.45 60500 0.88 1.33 79000 0.97 3.55 63000 1.01 3 0.44 60700 0.89 1.35 80100 0.97 3.54 62500 1.01 APS-2 1 0.25 45000 0.84 1.49 55000 0.90 4.19 40700 0.88 2 0.25 44500 0.85 1.47 54700 0.91 4.18 39900 0.86 3 0.23 44000 0.84 1.47 55000 0.91 4.18 40100 0.88 APS-3 1 0.32 53000 0.91 1.25 40600 0.85 3.65 30400 0.83 2 0.33 53300 0.92 1.25 41300 0.83 3.66 31000 0.85 3 0.34 52900 0.89 1.23 41100 0.83 3.66 31100 0.82 fAS: symmetry factor.

表 5 3种色谱柱不同批次间的色谱数据 Table 5 Chromatographic data for different batches of the three types of columns

3 结论

本研究利用混合配体的方法在活化硅胶表面引入不同比例的氨基和巯基, 并进一步利用巯基与乙烯基膦酸之间的点击化学反应, 成功制备了可调节正负离子比例的两性亲水色谱固定相。成功表征后通过研究流动相中乙腈含量、缓冲盐pH值及缓冲盐浓度等因素对探针分子在固定相上保留的影响, 表明亲水模式下极性分析物在固定相上是多重保留机理。对比核苷、水溶性维生素、碱性化合物、苯甲酸这几类标准物质在3种色谱柱上的保留行为, 结果表明, 对于不同性质的分析物, 3种固定相表现出不同的分离选择性和色谱行为。可以灵活调节正负基团的比例来满足不同的分离需求, 证明了固定相拥有良好的应用前景。而由于多步反应中反应效率的限制, 无法完全准确地控制引入硅胶表面正负基团的比例, 这也将是今后工作中力争解决的问题。

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