酵素及酵素食品来自日本天然健康的食品概念, 国内引用其调节新陈代谢的功能, 宣称酵素食品具有通便减肥的功效[1, 2]。网络上酵素食品主要有果冻、糖果、蜜饯和饮料等, 经发展已成为新兴的畅销减肥产品。由于市场利润巨大, 减肥类非法添加药物层出不穷[3-10]。2019年初, 本实验室对宣称通便减肥的酵素食品进行风险监测, 检出一种减肥类非添新成分, 经确证为“匹可硫酸钠”。
匹可硫酸钠(sodium picosulfate)CAS号10040-45-6, 别名匹克硫酸钠, 相对分子质量481.41, 分子式C18H13NNa2O8S2, 结构式见图 1, 白色或几乎白色结晶粉末, 无嗅无味, 易溶于水、微溶于甲醇[11, 12]。匹可硫酸钠是一种缓泻药, 可用于各种形态的便秘, 不良反应包括恶心、下痢、肠胃道反应等[13, 14]。匹可硫酸钠及其制剂已在欧美、日本批准使用, 复方匹可硫酸钠颗粒于2018年10月在国内获批, 归属化学药物管理。我国食品添加剂目录、新资源食品名单均未收入匹可硫酸钠, 因此不能作为食品原料使用。匹可硫酸钠在国内认知程度较低, 有可能成为新型的减肥类非法添加药物。
目前, 减肥类非法添加药物的检测研究较多[3-10], 以液相色谱-质谱联用法为主流, 检测成分已达几十种, 但均未包含匹可硫酸钠。关于果冻、软糖、蜜饯基质的研究较少, 而食品中匹可硫酸钠的检测方法基本处于空白。减肥类药物多为脂溶性成分, 前处理基本采用甲醇[4-10]、乙腈[3]对样品进行简单提取。匹可硫酸钠为钠盐, 水溶性极佳, 脂溶性差, 采用有机溶剂提取高蛋白基质时会被包埋而影响提取。本实验室曾以文献方法[3, 10]测定奶昔中的匹可硫酸钠, 回收率低于20%, 不符合定量要求。另一方面, 针对片剂、胶囊剂的前处理方法不适用于果冻、软糖。匹可硫酸钠在果冻、软糖中的添加过程, 可能是配成水溶液与温热的果冻液、糖液混合, 再冷却成型, 因此匹可硫酸钠可分散于食品内部。样品的有效溶散是提取关键, 而有机溶剂对样品中的食用胶有变性作用[15, 16], 不利于溶散过程。因此, 检测高蛋白、胶质型酵素食品中匹可硫酸钠, 必须建立新的前处理方法。
本实验室对市场上酵素食品的摸查结果表明, 近四成产品检出匹可硫酸钠, 非法添加情况十分严峻。本文针对匹可硫酸钠, 开发了一种适用于果冻、软糖、蜜饯、固体饮料等酵素食品的检测方法, 弥补当前检测方法的空白, 为监管提供技术支撑手段。
LC-20ADXR高效液相色谱仪(日本岛津公司); Triple Quad 5500三重四极杆串联质谱仪(配ESI)(美国Sciex公司); 涡旋振荡器(德国IKA公司); 恒温水浴箱(德国Julabo公司); 超声提取器(昆山市超声仪器有限公司); 固相萃取装置(美瑞泰克科技有限公司); 超纯水机(美国Millipore公司)
匹可硫酸钠标准品(纯度96%, 加拿大TRC公司); 乙腈、甲醇(色谱纯, 美国Holly公司); 乙酸铵、氨水(含量25% ~28%)、无水乙醇、三氯乙酸(分析纯, 广州化学试剂厂); 聚酰胺柱(1 000 mg/6 mL, 美国Thermo公司)。氨水-70%乙醇混合溶液:量取100 mL氨水与900 mL 70%(v/v)乙醇水溶液混匀。1%三氯乙酸溶液:称取10 g三氯乙酸溶于1 000 mL水中。
152批次酵素食品收集于风险监测任务、飞行检查和科研网购。提取考察实验用样品采用阴性样配制, 均一化称量后, 果冻、软糖高温熔融时加入少量标液, 放冷备用; 蜜饯、固体饮料加入少量标液, 放置半小时后备用。
准确称取10 mg匹可硫酸钠标准品, 用水配成1 000 mg/L的标准储备液, 4 ℃下保存3个月。准确量取适量标准储备液, 用水配成5 mg/L的标准使用液, 4 ℃下保存2周。取适量标准使用液, 用水配成匹可硫酸钠质量浓度为5~500 μg/L的标准曲线溶液, 临用新配。
取适量样品, 采用捣碎、剪碎、研磨等方式充分粉碎或混合均匀后备用。
果冻、软糖:准确称取1 g样品于50 mL离心管中, 加入40 mL水, 80 ℃下水浴至样品溶解, 取出放冷至室温, 转移至50 mL容量瓶, 用5 mL水洗涤离心管, 洗涤液并入同一容量瓶, 加入5 mL 1%三氯乙酸溶液, 用水定容至50 mL, 待净化。
蜜饯:准确称取1 g样品于50 mL离心管中, 加入40 mL水, 超声提取20 min, 提取液和残渣转移至50 mL比色管, 用5 mL水洗涤离心管, 洗涤液并入同一比色管, 加入5 mL 1%三氯乙酸溶液, 用水定容至50 mL, 待净化。
固体饮料:准确称取1 g样品于50 mL离心管中, 加入25 mL水, 涡旋分散, 80 ℃下水浴10 min, 取出放冷至室温, 8 000 r/min下离心5 min, 上清液转移至50 mL容量瓶。加入20 mL水重复提取一次, 合并两次上清液。于上清液中加入5 mL 1%三氯乙酸溶液, 用水定容至50 mL, 待净化。
若上述待净化液浑浊, 可取适量在8 000 r/min下离心5 min, 取上清液备用。
用10 mL水预先活化聚酰胺柱。取10 mL待净化液于柱内, 待净化液流尽后, 依次用10 mL水、10 mL 70%(v/v)甲醇水溶液洗涤, 15 mL氨水-70%乙醇混合溶液洗脱, 收集洗脱液于80 ℃下水浴蒸发至近干, 用水定容至5 mL, 过0.22 μm微孔滤膜, 待测。若匹可硫酸钠浓度超出线性范围, 可用水适当稀释。
色谱柱:Thermo Accucore RP-MS(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm, 美国Thermo公司); 流速:0.3 mL/min, 乙腈-10 mmol/L乙酸铵(15：85, v/v)等度洗脱。柱温35 ℃, 进样量5 μL。
采用ESI源, 正离子扫描, 多反应监测(MRM)模式检测; 电喷雾电压5 500 V, 离子源温度550 ℃; 雾化气压力:3.447×105 Pa, 气帘气压力2.759×105 Pa, 碰撞气压力6.207×104 Pa。匹可硫酸钠采集参数:定量离子对m/z 438.2/183.9, 去簇电压(DP)120 V, 碰撞能(CE)40 V; 定性离子对m/z 438.2/278.2, DP 120 V, CE 28 V。
匹可硫酸钠为新发现的非法添加成分, 需进行确证实验。采用Q Exactive高分辨质谱(美国Thermo公司)采集有证标准品和可疑样品中匹可硫酸钠色谱峰的质谱信息。色谱图中, 可疑样品检出与标准品保留时间一致的色谱峰; 一级质谱图中, 正离子模式下标准品母离子精确质量数为438.030 15, 样品为438.030 18, 两者质量偏差小于0.000 05;在二级图谱中有3个相同的碎片离子。上述结果表明, 两者为同一物质, 检出成分确证为匹可硫酸钠。
匹可硫酸钠水溶性极好, 宜采用水或与水混溶的溶剂提取, 选取水、甲醇和乙腈进行比对。参考果冻、蜜饯、固体饮料常用的提取方式[15-17], 选择水浴和超声进行比较。提取溶剂与提取方式相互组合, 形成6种方式, 考察对应的提取效果, 结果见图 2。结果表明:(1)采用水-水浴提取时, 4种基质的回收率均大于98%; (2)含有乙腈的组合对各种基质提取均不理想; (3)甲醇对软糖的提取较差; (4)果冻、软糖、固体饮料采用水浴提取优于超声, 蜜饯两者提取的效果相当。分析原因, 甲醇、乙腈使软糖变性、固体饮料结块, 导致目标物包埋, 不利于提取。常温下软糖、果冻溶解不完全, 含淀粉、奶精的固体饮料呈稀糊状, 不利于目标物分散。进一步优化发现, 蜜饯在提取时已充分剪碎, 被水浸泡存在吸水发胀问题, 超声较水浴的发胀程度小, 所以蜜饯更适于采用超声提取。
80 ℃是溶解果冻、软糖常用的温度。在该温度下, 果冻、软糖在水中溶散, 水稀释了样品中食用胶的浓度, 即使恢复至常温亦不会再次成胶[15, 16]。上文制得的果冻、软糖和固体饮料提取液在80 ℃下水浴1小时, 考察匹可硫酸钠的热稳定性。对于质量浓度为100 μg/L的加标提取液, 水浴前后测得的峰面积比值为0.98~1.03, 可以认为匹可硫酸钠溶液在80 ℃下加热1 h仍稳定。
综上, 果冻、软糖、固体饮料采用水-水浴提取, 蜜饯采用水-超声提取。
奶昔、代餐等固体饮料含大量蛋白, 需加入沉淀剂除去。参考乳制品常用的蛋白沉淀剂[18-20], 考察亚铁氰化钾-乙酸锌、乙腈和三氯乙酸的效果。加入沉淀剂后, 回收率依次为61%、19%和98%, 三氯乙酸最佳。进一步考察, 三氯乙酸有调节溶液酸度的作用。各基质提取液pH为2~7, 加入一定量三氯乙酸溶液后, pH值稳定在2~3, 有利于后续净化。因此, 在提取液中加入三氯乙酸可起到沉淀蛋白和稳定提取液pH值的作用。
果冻、软糖的胶质和蜜饯的盐会在分析过程中堵塞色谱柱, 污染质谱, 影响结果的准确性, 必须进行净化。提取液为水溶液, 采用固相萃取较合适, 选择HLB、MCX、聚酰胺(PA)进行考察。设定的吸附量参考收集到的阳性样品中含量的最高值。当样品中匹可硫酸钠的含量为4 000 mg/kg, 取样1 g、稀释倍数50、上样量为10 mL时, 吸附总量为800 μg。MCX吸附率约34%, HLB和PA吸附率约100%。但HLB对目标物和杂质的吸附能力相当, 30%(v/v)甲醇水溶液淋洗时会发生共流出。PA对目标物和杂质的吸附有差异, 在70%(v/v)甲醇水溶液淋洗下杂质被洗出而匹可硫酸钠仍被保留。因此, 选择PA作为吸附剂。
匹可硫酸钠利用磺酸基, 通过氢键与聚酰胺结合, 在酸性和中性下暴露的磺酸基有利于吸附, 碱性时氢键被破坏从而被洗脱, 这是提取液pH 2~3有利于吸附的原因。依次用10 mL的水、30%(v/v, 下同)甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液等溶剂进行洗脱。结果表明, 上述中性溶液均不影响PA对匹可硫酸钠的吸附, 随甲醇体积比的升高, 洗脱杂质的能力增强。因此, 选择水洗去水溶性杂质, 70%甲醇水溶液洗去有机杂质。
当淋洗溶剂为碱性时, PA对匹可硫酸钠解吸附, 依次用不同体积比(1：99、5：95、10：90和20：80)的氨水-70%乙醇混合溶液进行解吸, 洗脱体积分别为5、10、15和20 mL时的洗脱效果见图 3。结果表明, 当洗脱体积为15 mL时, 各溶液回收率均达到80%。氨水-70%乙醇混合溶液(10：90, v/v)的回收率为97%, 满足实验要求。若洗脱液中氨水和乙醇的比例大, 则直接测定时有明显的溶剂效应, 应蒸发除去后用水复溶, 获得洁净的样品溶液。
需要注意, 尼龙是聚酰胺纤维, 不可使用尼龙滤膜过滤样品溶液。经考察, 聚醚砜(PES)和聚四氟乙烯(PTFE)不吸附目标物, 均可使用。一般情况下, PES适用于水溶液, PTFE适用于水溶液和有机溶液。
果冻、软糖、蜜饯中使用的人工合成着色剂被本方法提取, 但不能在净化过程中除去, 需考察色素共存的影响。在加标提取液中加入柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝等常用色素, 结果表明, 1.0 g/kg色素共存时, 匹可硫酸钠回收率达98%, 不受影响。
美国药典[12]采用乙腈-磷酸盐缓冲液体系测定匹可硫酸钠原料药, 此条件在液相色谱-质谱上不适用, 缓冲盐用10 mmol/L乙酸铵替代。更换缓冲盐后, 色谱峰略有拖尾, 但随C18色谱柱填料粒径的减小, 柱效的提高使峰形大有改善。因此, 采用100 mm×2.1 mm规格的亚三色谱柱, 乙腈-10 mmol/L乙酸铵作为流动相。
文献[21]采用正离子模式检测匹可硫酸钠及其代谢物, 因此在正离子模式下优化质谱条件。用蠕动泵以5 μL/min的流速连续注射100 μg/L的匹可硫酸钠标准溶液于ESI源中, 进行一级、二级质谱扫描, 二级图谱见图 4。选择响应强度高、基线噪音低的m/z 438.2/183.9、438.2/278.2为监测离子对, 并在MRM模式下优化离子对的去簇电压、碰撞能等参数。
采用常用的有机溶剂甲醇、乙醇和乙腈, 以有机相体积分数为0%、10%、20%、30%、40%、50%、70%和100%的混合水溶液, 分别配制100 μg/L匹可硫酸钠标准溶液, 考察溶剂效应。实验结果表明, 当有机溶剂在30%或以下时, 匹可硫酸钠的响应值无明显差异; 当有机溶剂高于30%时, 随其体积分数的增加, 响应值明显下降。因此, 上机溶剂的有机相需控制在30%以下, 采用水配制标准溶液最佳。
基质效应由基质中共提取物干扰和目标化合物竞争电离所致。为评价基质效应, 本研究使用4种基质的空白基质溶液配制质量浓度为5~500 μg/L的系列溶液, 对质量浓度与峰面积进行线性回归, 将回归方程斜率代入公式(基质效应=(1-溶剂标准曲线的斜率/基质匹配标准曲线的斜率)×100%)计算基质效应, 负值表示基质抑制, 正值表示基质增强, 绝对值越大则效应越强[22]。果冻、软糖、蜜饯和固体饮料的基质效应依次为-7.8%、-4.0%、-9.8%和-8.7%, 属于较弱的基质抑制, 可不采取手段进行校正。
用水分别配制质量浓度为5、10、50、100、250、500 μg/L的系列标准溶液, 以峰面积(y)对质量浓度(x, μg/L)进行线性回归, 回归方程为y=2 696.01x+1 994.60, 相关系数(r)为0.999 9。结果表明匹可硫酸钠在5~500 μg/L内呈良好的线性关系。
向阴性样品中添加不同水平的标准溶液, 按取样1 g, 稀释25倍计算, 信噪比(S/N)≥3时, 匹可硫酸钠质量浓度为2 μg/L, 方法检出限为0.05 mg/kg; 信噪比S/N≥10时, 匹可硫酸钠质量浓度为5 μg/L, 方法定量限为0.125 mg/kg, 可满足非法添加检验的要求。
糖果、软糖、蜜饯和固体饮料4种基质差异较大, 均需进行考察。在各基质中进行1倍、2倍、10倍定量限3个水平的加标回收试验, 每个水平平行测试6次(n=6), 结果见表 1。匹可硫酸钠在各基质中的回收率为89.2% ~111.8%, 相对平均偏差(RSDs)为2.5% ~10.4%, 结果良好。
按本方法测定酵素食品152批次, 在58批次样品中检出匹可硫酸钠, 阳性率为38.2%, 具体检出情况见表 2。匹可硫酸钠标准溶液及典型样品提取定量离子流色谱图见图 5。匹可硫酸钠在果冻、软糖、蜜饯和固体饮料中均有检出, 除去少数含量极低的样品, 各基质中检出含量的最低值和最高值相差4~20倍, 含量波动较大, 安全风险较高。
本文建立了高效液相色谱-串联质谱测定酵素食品中匹可硫酸钠的方法。目标物采用水作为提取溶剂, 经水浴或超声提取, 聚酰胺净化。方法的线性范围、检出限、回收率和精密度满足非法添加检测要求, 特别适合果冻、软糖、蜜饯和固体饮料基质酵素食品中匹可硫酸钠的定性、定量分析, 灵敏度高、抗干扰能力强, 准确可靠。该方法能弥补现时酵素食品中匹可硫酸钠的检测空白, 有一定的实用意义。
2019,
Vol. 37 Issue (12): 1331-1336 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.05035 
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2019,
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