高效液相色谱-荧光法测定多囊卵巢综合征患者血浆中吲哚类物质


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	韩润川

	班艳娜

	甄乾娜

	周莹

	张晓清

	丁敏

韩润川¹, 班艳娜², 甄乾娜³, 周莹¹, 张晓清¹, 丁敏¹

1. 重庆医科大学检验医学院, 临床检验诊断学教育部重点实验室, 重庆 400016;
2. 重庆医科大学附属第一医院生殖健康与不孕症专科, 重庆 400016;
3. 重庆医科大学附属第一医院内分泌科, 重庆 400016

收稿日期：2019-05-23

基金项目：重庆市教育委员会科学技术研究青-项目（2018-9-76）；重庆市研究生科研创新项目（CQCYS17137）

通讯联系人：丁敏.Tel:(023)68485239, E-mail:dingmin@cqmu.edu.cn

摘要：建立了一种同时测定血浆吲哚类物质（吲哚丙酸、吲哚乙酸、吲哚与3-甲基吲哚）的高效液相色谱-荧光法（HPLC-FLD）。以液-液萃取法进行样本预处理，采用Shim-pack VP-ODS色谱柱（150 mm×4.6 mm，4.6 μm）分离，流动相为15 mmol/L磷酸二氢钠溶液-甲醇（42：58，v/v），柱温为30℃，流速为0.8 mL/min。吲哚丙酸、吲哚乙酸、吲哚与3-甲基吲哚在各自范围内线性关系良好。该方法的日内与日间相对标准偏差均小于6.31%，平均回收率为97.5%~107.0%。利用该方法对多囊卵巢综合征（PCOS）患者（n=61）与作为对照的正常育龄期女性（n=25）的血浆样本进行测定，结果发现PCOS患者血浆吲哚类物质显著高于对照组，其中吲哚是PCOS的危险因子和潜在的诊断标志物。该方法操作简便，灵敏度高，适用于临床检测和实验室研究。

关键词：高效液相色谱-荧光法多囊卵巢综合征吲哚类物质血浆

Determination of indoles in plasma of polycystic ovarian syndrome patients by high performance liquid chromatography-fluorescence detection

HAN Runchuan¹, BAN Yanna², ZHEN Qianna³, ZHOU Ying¹, ZHANG Xiaoqing¹, DING Min¹

1. Key Laboratory of Clinical Laboratory Dignostics(Ministry of Education of China), School of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China;
2. Reproductive Health and Infertility Department the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China;
3. Endocrinology Department, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

Foundation item: Youth Project of Science and Technology Research Program of Chongqing Education Commission of China (No. 2018-9-76); Graduate Innovation Foundation of Chongqing (No. CQCYS17137)

Abstract: A new method was established for the determination of indoles (indole (IND), 3-methylindole (3-MI), indolyl-3-acetic acid (IAA) and indolyl-3-propionic acid (IPA)) in plasma by high performance liquid chromatography-fluorescence detection (HPLC-FLD). The analytes were separated simultaneously on a Shim-pack VP-ODS column (150 mm×4.6 mm, 4.6 μm) using 15 mmol/L sodium dihydrogen phosphate solution and methanol (48:52, v/v) as the mobile phases. The column temperature was 30 ℃, and the flow rate was 0.8 mL/min. The calibration curves of IND, 3-MI, IPA and IAA showed good linear relationships. The intra-day and inter-day relative standard deviations (RSDs) for the analytes were both less than 6.31%. The average recoveries of the analytes in plasma were 97.5%-107.0%. The method was successfully applied to the analysis of indoles in the plasma of healthy women of reproductive age (n=25) as controls and patients with polycystic ovarian syndrome (n=61). The results showed that the concentrations of indoles in the plasma were significantly different between the two groups, and IND was found to be a risk factor and a potential diagnostic biomarker for polycystic ovarian syndrome (PCOS). The method is simple, sensitive and suitable for use in clinical testing and laboratory research.

Key words: high performance liquid chromatography-fluorescence detection (HPLC-FLD) polycystic ovarian syndrome (PCOS) indoles plasma

多囊卵巢综合征(PCOS)是常见于育龄期女性的内分泌系统疾病, 发病率在育龄期妇女中高达10%^[1]。PCOS患者易发生糖代谢紊乱, 患2型糖尿病的风险是健康人的5~10倍。30% ~35%的PCOS患者会出现糖耐量受损, 65% ~70%的患者伴发胰岛素抵抗^{[2, 3]}。而机体糖代谢紊乱, 尤其是胰岛素水平升高, 会促进血液中雄激素水平升高, 使PCOS患者发生卵巢功能障碍^{[4, 5]}。目前, PCOS的诊断主要依据稀发排卵或无排卵、高雄激素血症及卵巢多囊性改变。但高雄激素血症并不是确诊PCOS的必备条件, 有15% ~20%的PCOS患者未见雄激素升高, 并且在确诊PCOS时, 还需排除非典型性肾上腺皮质增生、柯兴综合征、分泌雄激素的卵巢肿瘤等引起雄激素升高的疾病^[6]。因此, 需要寻找PCOS新的实验室诊断标志物。

吲哚丙酸(indolyl-3-propionic acid, IPA)、吲哚乙酸(indolyl-3-acetic acid, IAA)、吲哚(indole, IND)与3-甲基吲哚(3-methylindole, 3-MI)是色氨酸在肠道菌群作用下的代谢产物, 即细菌代谢物^{[7, 8]}。吲哚类物质, 作为肠道菌群和人体细胞间重要的信号分子^[9], 通过体内的氧化应激, 肠道炎症反应和激素分泌等途径参与人体生理功能调节^[10]。IND可刺激肠道细胞调节胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide 1, GLP-1)的释放^[11], GLP-1是一种葡萄糖浓度依赖的具有降糖作用的肠源性激素, 可以提高机体对葡萄糖的敏感性^[12]。IPA是IND的细菌代谢产物, 可以保护胰岛细胞, 促进胰岛素的释放, 被认为是2型糖尿病的保护性因子^[13]。吲哚类物质调节机体的糖代谢功能, 而糖代谢紊乱是PCOS的特征性症状及发病诱因^[14]。但目前尚无研究报道吲哚类物质在PCOS中的作用。因此, 检测PCOS患者血浆中吲哚类物质, 不仅有助于阐明肠道菌群与PCOS的关系, 也为寻找PCOS新的诊断标志物和治疗靶点提供方向。

目前, 血浆吲哚类物质的检测方法主要采用高效液相色谱-荧光法和超高效液相色谱-质谱法^{[15, 16]}。同时检测人血浆中IPA、IAA、IND和3-MI等吲哚类物质的方法尚未见报道。本研究建立一种快速、灵敏的高效液相色谱-荧光法用于人血浆吲哚类物质(IAA、IPA、IND和3-MI)的同时检测, 并采用所建方法测定PCOS患者与健康育龄期女性血浆中吲哚类物质, 以阐明其在PCOS患者中的变化, 并探究吲哚类物质在PCOS中的潜在诊断价值。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1100 LC型高效液相色谱仪(配有G123型荧光检测器); Shim-pack VP-ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm, 4.6 μm); Milli-Q超纯水过滤装置(美国Millipore公司); HIMAC-15低温台式离心机、SAVANT ISS110真空离心浓缩仪(美国Thermo公司); SB-3200超声波清洗器(上海必能信超声有限公司); ZWY-100H恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造公司); GM-0.33隔膜真空泵(天津津腾有限公司)。

IPA、IAA、IND和3-MI标准品(纯度99.9%, 美国Sigma公司); 甲奈酚标准品(纯度99.0%, 北京百灵威科技有限公司); 甲醇(色谱纯, 美国Tedia公司)。

分别称取一定量的IPA、IAA、IND、3-MI和甲奈酚标准品, 用流动相(15 mmol/L磷酸二氢钠溶液-甲醇(42：58, v/v)分别配制IAA(0.2 mol/L)、IPA(0.1 mol/L)、IND(0.1 mol/L)、3-MI(0.1 mol/L)和甲萘酚(5.0 g/L)标准储备液, 分装保存于-20 ℃。使用前用流动相稀释至所需浓度。

1.2 实验条件

1.2.1 样本采集及预处理

患者61例, 均经过病史询问、性激素测定与超声检查, 确诊为PCOS患者。同时选择健康育龄期女性25例作为对照组, 两组样本均来自重庆医科大学第一附属医院。本研究获得重庆医科大学伦理委员会的批准和受试者的知情同意。抽取受检者空腹静脉血2 mL, 置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中, 低速离心后取血浆于-20 ℃保存。

取血浆300 μL, 加入10 μL 5 mg/L甲萘酚溶液(内标)和600 μL乙醚, 涡旋混匀后, 在摇速为250 r/min的摇床作用下振荡18 min, 于4 ℃以13 300 g离心5 min, 取上清液, 真空离心旋干后, 加入90 μL 15 mmol/L磷酸二氢钠溶液-甲醇(42：58, v/v)复溶, 涡旋5 min, 取上清液50 μL进样分析。

1.2.2 HPLC条件

色谱柱:Shim-pack VP-ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm, 4.6 μm); 柱温:30 ℃; 流动相:15 mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH 4.6)-甲醇(42：58, v/v); 流速:0.8 mL/min; 进样量:50 μL。荧光检测波长程序设置:0~6.00 min, 激发波长(λ_ex)和发射波长(λ_em)分别为282 nm和352 nm; 6.01~9.00 min, λ_ex和λ_em分别为274 nm和340 nm; 9.01~14.00 min, λ_ex和λ_em分别为282 nm和352 nm。

1.2.3 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学处理。首先对数据进行正态性分布检验, 若不符合正态分布, 则采用秩和检验分析两组间差异, 结果以中位数与四分位间距(inter-quartile range, IQR)表示; 若数据符合正态分布, 则使用Student’s t-检验分析两组间差异, 结果以平均值±标准差(x±s)表示。采用受试者工作曲线(receiver operation characteristic curve, ROC)寻找最优的诊断阈值(cut-off值), 评价其诊断的灵敏度和特异性。采用Logistic回归分析探讨引发疾病的危险因素。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的确定

本实验的待测物IAA、IPA、IND和3-MI以及选取的内标都具有自然荧光, 为了提高方法的灵敏度, 通过Agilent 1100 LC色谱工作站分别对各待测物进行荧光光谱扫描, 根据各待测物最佳检测波长, 设置程序化荧光检测波长。

2.2 样本预处理方法的确定

为了减少基质干扰对色谱分析的影响, 本实验分别考察了蛋白质沉淀和液-液萃取法两种预处理方法(见图 1)。与甲醇蛋白质沉淀法比较, 采用乙醚进行液-液萃取血浆样本, 内源性物质干扰较小。因此, 本实验选择乙醚进行液-液萃取, 以实现对血浆中的目标化合物的净化与富集。

图 1 血浆经不同方法预处理后的色谱图 Fig. 1 Chromatograms of plasma by different sample pretreatments IAA: indolyl-3-acetic acid; IPA: indolyl-3-propionic acid; IND: indole; 3-MI: 3-methylindole.

2.3 色谱条件的确定与优化

本实验选择甲醇和磷酸盐缓冲溶液作为流动相, 对流动相中甲醇的体积分数、缓冲液pH值及柱温进行了考察。

以血浆为样本进行分析, 甲醇体积分数为55% ~60%时, 随着甲醇体积分数的增大, 各分析物的保留时间缩短, 分离度(R)逐渐减小, 而甲醇体积分数为60%时, 内标与内源性物质的分离度小于2.0;而甲醇体积分数为55%时, 保留时间较长。故选择流动相中甲醇体积分数为58%。

通过氢氧化钠调节15 mmol/L磷酸二氢钠缓冲液的pH值，考察其对分离效果的影响(见图 2)。pH值为3.8时, IPA与IND不能有效分离(R＜2.0); pH值为5.4与6.5时, IPA与IAA不能有效分离(R＜1.5);而pH值为4.6时, 各组分均能实现有效分离。故流动相中磷酸盐缓冲液的pH值选择为4.6。

图 2 不同pH值条件下血浆样本的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of plasma samples at different pH values IS: internal standard.

考察了柱温对分析效果的影响。当柱温为25 ℃时, 保留时间较长; 柱温为35 ℃时, 3-MI的分离度减小; 而柱温为30 ℃时, 能在较短时间内实现各组分的有效分离。因此, 实验将柱温设置为30 ℃。

2.4 方法学评价

2.4.1 标准曲线及检出限

配制IAA、IPA、IND和3-MI系列浓度标准溶液, 加标至健康人混合血浆样本中, 经过样本预处理后检测。以血浆加入待测物的浓度为横坐标, 血浆中待测物峰面积与内标峰面积的比值减去空白血浆中待测物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标, 绘制标准曲线; 以信噪比(S/N)=3计算检出限, 结果见表 1。

表 1 血浆中IAA、IPA、IND和3-MI的回归方程、相关系数(r)、线性范围和检出限 Table 1 Regression equations, correlation coefficients (r), linear ranges and LODs of the IAA, IPA, 3-MI and IND in plasma

选取健康人血浆(低浓度组)和PCOS患者血浆(高浓度组), 日内重复测定5次, 连续测定5 d, 以进行日内与日间精密度考察, 结果见表 2。相对标准偏差均≤6.31%, 表明该方法精密度良好。

表 2 血浆吲哚类物质的精密度(n=5) Table 2 Precisions of indoles in plasma (n=5)

2.4.2 回收率

分别添加高、中、低3种浓度的15 μL IAA、IPA、IND和3-MI混合标准溶液至285 μL健康人混合血浆样本中, 进行加标回收试验, 结果见表 3。IAA、IPA、IND和3-MI的平均回收率为97.5% ~107.0%, 表明方法准确可靠。

表 3 血浆中吲哚类物质的加标回收率(n=3) Table 3 Recoveries of indoles spiked in plasma (n=3)

2.4.3 干扰试验

溶血、脂血、黄疸是血浆样本临床检测中常见的干扰因素^[17]。溶血标本会将细胞内容物混入血浆, 从而影响血浆样本的检测^[18], 而黄疸与乳糜颗粒会干扰检测器的光谱分析, 影响检测结果^[19]。因此需要明确干扰物质浓度对检测结果的影响。

按照美国临床实验室标准委员会(CLSI)制定的标准。用甲醇将胆红素、胆固醇及甘油三酯冻干粉标准品溶解, 配制标准溶液。取健康人混合血浆285 μL, 加入15 μL不同浓度的胆红素标准溶液, 经样本预处理后检测。分别测定加入胆红素前的血浆待测物浓度(X_C)和加入后的待测物浓度(X_T), 若干扰值(X_T-X_C)在95%置信区间内, 则说明胆红素对检测结果无显著干扰。结果表明, 血浆胆红素浓度≤36.5 μmol/L时对测定结果无影响。采用同样的方法考察血浆中甘油三酯和胆固醇对检测方法的干扰, 结果显示, 甘油三酯浓度≥2.9 mmol/L、总胆固醇浓度≥16.6 mmol/L时, 对检测有影响。因此在检测实际样本时, 出现黄疸和脂血现象可能会影响检测结果。

取健康人EDTA抗凝全血分成两份, 一份在4 ℃、2 000 g离心力下离心, 分离血浆; 另一份在-20 ℃与室温间反复冻融直至全部溶血, 均用生理盐水配制不同程度的溶血标本。一部分样本用于血红蛋白的检测, 另一部分样本经预处理后检测。结果显示, 溶血标本血红蛋白含量≤35 g/L时对测定无影响, 故在检测实际样本时应避免溶血。

2.4.4 稳定性考察

将血浆样本于-20 ℃冻存0、5、10和30 d, 在常温下解冻, 经样本预处理后测定, 计算各待测物的浓度, 以及浓度的RSD。结果表明, 各待测物RSD均小于日间RSD, 表明血浆样本在-20 ℃下至少可保存30 d。

2.5 临床应用

2.5.1 吲哚类物质含量的测定

用所建立的方法分别测定正常对照组(n=25)与PCOS患者组(n=61)血浆吲哚类物质浓度, 结果见表 4。结果显示:与对照组比较, PCOS患者血浆的IAA、IPA、IND和3-MI明显升高, 且具有统计学意义(P＜0.05)。

表 4 PCOS组和对照组血浆中IAA、IPA、IND和3-MI的浓度 Table 4 Concentrations of IAA、IPA、IND and 3-MI in plasma of the polycystic ovary syndrome (PCOS) and control groups

2.5.2 血浆吲哚类物质诊断PCOS

本实验用ROC曲线分别评价血浆吲哚类物质对PCOS的诊断效能并寻找最优诊断阈值, ROC曲线图见图 3。其中, IND的诊断效能最好, ROC曲线下面积(AUC)为0.900, 灵敏度和特异度分别为82.0%和88.0%。结果表明, IND对PCOS具有良好的诊断价值。

图 3 血浆吲哚类物质诊断PCOS的ROC曲线 Fig. 3 Receiver operation characteristic (ROC) curves of indoles for the diagnosis of PCOS

2.5.3 PCOS危险因素分析

对PCOS组和对照组中4种吲哚类物质进行Logistic回归分析, 优势比(odds ratio, OR)是反映吲哚类物质与PCOS关系的指标。当OR＞1时, 表示其与疾病发生呈正相关。结果显示, IND是PCOS发生的危险因素(OR=1.228, 95%置信区间:1.125~1.341, P＜0.001)。

3 结论

本研究建立了同时检测血浆中的IAA、IPA、IND和3-MI吲哚类物质的高效液相色谱-荧光法。本方法采用等度洗脱, 分析时间短, 灵敏度高, 样本用量少, 适用于临床与科研。该方法成功应用于分析PCOS患者和正常育龄期女性体内吲哚类物质的浓度。

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