增塑剂是一种在塑料制品生产过程中广泛使用的助剂, 能增加塑料制品的柔韧性, 使其易于加工, 常见的增塑剂主要为邻苯二甲酸酯类。增塑剂与塑料之间并不形成共价键, 因而随着时间的推移, 很容易从塑料制品里析出。因增塑剂具有良好的脂溶性, 食用油更加容易受到增塑剂的污染。根据文献^[1-4]报道, 多地的食用油中邻苯二甲酸酯类增塑剂的检出率均较高。污染来源可能为油料作物种植过程中引入^[5], 或者食用油生产过程中通过与塑料制品接触引入^[6]。

邻苯二甲酸酯类增塑剂具有类雌激素作用, 干扰人体的内分泌, 与男性不育^[7]、女性稽留流产^[8]以及女童性早熟^[9]均有关系。欧盟指令2007/19/EC与我国国家标准GB 9685-2016中规定的邻苯二甲酸酯类增塑剂均不得用于生产接触脂肪性食品的材料或制品。作为邻苯二甲酸酯类增塑剂的替代品, 对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHT)和偏苯三甲酸三(2-乙基己基)酯(TEHTM)越来越受到重视。现有的动物实验^{[10, 11]}未发现对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯有明显的致癌和影响生育的作用, 但尚缺乏对人体影响的数据。有实验^[12]表明偏苯三甲酸三(2-乙基己基)酯可影响细胞周期、代谢过程和氧化活性, 从而产生肝毒性。塑料中的对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯^[13]和偏苯三甲酸三(2-乙基己基)酯^[14]在脂溶性溶剂中均能析出, 故食用油中被污染的可能性较大, 需要进行关注。

现已报道的对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和偏苯三甲酸三(2-乙基己基)酯的检测方法主要应用对象是体液^[15]和模拟浸出物^{[16, 17]}, 食品中报道^[18-24]较多的是针对邻苯二甲酸酯类增塑剂的检测, 缺少非邻苯二甲酸酯类增塑剂的检测方法。食品中邻苯二甲酸酯类物质的检测主要是气相色谱-质谱和气相色谱-串联质谱仪技术, 也有报道使用高效液相色谱-串联质谱技术^[18]和超临界流体色谱技术^[19]进行检测。不含油脂的样品前处理多使用正己烷进行提取^[20], 因邻苯二甲酸酯类增塑剂脂溶性较强, 使得含油脂的样品前处理变的较为复杂。食用油中邻苯二甲酸酯的检测早期普遍使用凝胶柱色谱(GPC)进行前处理^[21], 但是该方法较为费时, 溶剂消耗量大, 同时因为洗脱溶剂最终浓缩几十甚至上百倍, 使溶剂中的增塑剂本底被富集, 从而影响检验。近几年较常使用的前处理方法为乙腈提取, 固相萃取法^{[22, 23]}或分散固相萃取法^[24]净化, 需要注意的是, 净化耗材有引入增塑剂的可能, 需要对每批净化耗材的本底进行考察。另外, 如气液微萃取^[25]等新的前处理技术近些年也被报道, 虽然前处理过程大大简化, 但因需要使用特殊装置, 短时间内难以普及。本文报道一种使用气相色谱-串联质谱测定食用油中对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和偏苯三甲酸三(2-乙基己基)酯的方法, 方法前处理简便、灵敏度高, 可以为食品生产质量控制以及食品安全风险评估提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

TSQ 8000 Evo气相色谱-三重四极杆质谱联用仪(美国Thermo Fisher公司); hp-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)(美国Agilent公司); Vortex-Genie 2涡旋混匀器(美国Scientific Industries公司); 超声波清洗器(英国Prima公司); Allegra X-15R台式冷冻离心机(美国Beckman公司); 玻璃离心管(使用前用超纯水洗净, 并于250 ℃下烘烤2 h, 冷却后使用)。

对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(纯度98.2%, 德国Dr. Ehrenstorfer公司); 偏苯三甲酸三(2-乙基己基)酯(纯度98%, 加拿大TRC公司); 乙腈(色谱纯, 德国Merck公司); 中性氧化铝(国药集团); C18粉末、N-丙基乙二胺(PSA)粉末(CNW公司); 硅胶基键合氧化锆(Z-sep粉末)(美国Supelco公司); 食用大豆油(购于武汉市场)。

1.2 样品前处理

准确称取0.5 g食用大豆油样品于玻璃离心管中, 加入5 mL乙腈, 涡旋混匀, 超声提取15 min, 在4 ℃以3 000 r/min的速度冷冻离心5 min, 上层清液转移至另一干净玻璃离心管中。再加入5 mL乙腈, 重复提取一次, 合并两次提取液。将两次提取液混合均匀, 于-20 ℃条件下冷冻2 h, 取出后立即在4 ℃以3 000 r/min的速度冷冻离心5 min, 移取适量上清液于玻璃进样小瓶中, 上机分析。

1.3 校准溶液的配制

准确称取标准物质各10.00 mg, 用乙腈定容至100 mL, 得质量浓度为100 mg/L的标准储备液。

准确移取5 mL标准储备液, 用乙腈定容至100 mL, 得质量浓度为5 mg/L的标准中间溶液。移取10~1 000 μL的标准中间溶液至盛有0.5 g空白样品的玻璃离心管内, 得质量浓度为0.1~10.0 mg/kg空白加标样品, 按1.2节方法进行前处理, 得标准工作溶液。

1.4 分析条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱为hp-5MS毛细管柱; 载气为氦气(纯度大于99.999%); 载气流速为1.2 mL/min; 进样口温度为300 ℃, 不分流进样, 进样量为1 μL; 升温程序为60 ℃保持1.0 min, 以40 ℃/min升温至220 ℃, 保持1.0 min, 再以10 ℃/min升温至300 ℃, 保持6.0 min。

1.4.2 质谱条件

离子源为电子轰击离子源(EI); 离子源温度为280 ℃; 接口温度为300 ℃; 采用选择反应监测(SRM)模式, 离子对参数见表 1。

表 1 (Table 1)

表 1 2种化合物的保留时间和质谱参数 Table 1 Retention time and mass parameters for the two compounds Compound Retention time/min Quantitative analysis Qualitative analysis Parent ion/product ion (m/z) Collision energy/eV Parent ion/product ion (m/z) Collision energy/eV Di-2-ethylhexyl terephthalate (DEHT) 11.95 261.2/149.1 10 261.2/121.1 20 Tris (2-ethylhexyl) trimellitate (TEHTM) 17.21 305.2/193.1 15 305.2/165.1 25

表 1 2种化合物的保留时间和质谱参数 Table 1 Retention time and mass parameters for the two compounds

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 色谱条件的优化

对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和偏苯三甲酸三(2-乙基己基)酯均为弱极性化合物, 故选择弱极性的hp-5MS毛细管柱进行分离。色谱条件优化的主要目的是在获得良好化合物峰形的基础上尽量缩短分析时间, 最终确定的色谱条件见1.4.1节。

2.1.2 质谱条件的优化

质谱采用选择反应监测模式进行数据采集, 用仪器自带的AutoSRM功能对离子对进行选择和优化。还考察了离子源温度对化合物响应的影响, 发现在200~300 ℃间, 两种化合物的响应均随离子源温度的升高而显著上升(见图 1), 即提高离子源温度可以显著提升方法的灵敏度。考虑到过高温度会缩短离子源组件的使用寿命, 最终选择离子源温度为280 ℃。

图 1

Fig. 1

图 1 在不同离子源温度下10 μg/L标准溶液中2种化合物的峰面积 Fig. 1 Peak area of the two compounds in 10 μg/L standard solution at different ion source temperatures

2.2 实验本底的控制

增塑剂因在塑料制品中广泛被使用, 在检测过程中要严格防止样品被污染, 实验中尽可能使用玻璃器皿, 器皿使用前用超纯水洗净, 并于250 ℃下烘烤2 h。每次实验至少进行一次空白实验, 即除不加入样品外, 其余步骤与样品完全相同处理, 以考察样品处理过程是否遭到污染。

2.3 前处理条件的优化

2.3.1 提取条件的选择

为了便于后续处理, 提取溶剂需选择不与油脂互溶的有机试剂, 对甲醇和乙腈进行了比较, 发现两者提取效果差异不大, 但两种增塑剂在乙腈作为溶剂进样时的响应均大于甲醇, 故选择乙腈作为提取溶剂。比较了10 mL乙腈一次提取和分两次提取的差异, 发现对于对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯, 两次提取可获得较好的回收率, 而偏苯三甲酸三(2-乙基己基)酯两次提取的回收率只有70%, 且与一次提取相比, 回收率增加幅度不大。故选择10 mL乙腈分两次提取。

2.3.2 冷冻除脂时间选择

处理油脂样品时, 提取溶剂中溶解的脂类物质可能会对检测产生干扰, 同时可能污染仪器。食用油中的脂肪酸甘油三酯等脂类物质低温条件下在乙腈中的溶解度降低而析出, 达到除脂的目的。准确移取1 mL冷冻除脂后的上清液于已称重的玻璃试管内, 用氮气吹干, 并于烘箱中100 ℃烘至恒重, 测得的质量减去空玻璃试管的质量, 计算出脂类物质的质量。考察了不冷冻、-20 ℃下冷冻1 h、冷冻2 h和冷冻过夜(16 h)的除脂效果(如图 2所示), 发现冷冻1 h后1 mL乙腈中的未挥发物质量明显降低, 冷冻2 h的效果好于冷冻1 h的结果, 但是继续延长冷冻时间效果没有明显改变, 故选择-20 ℃下冷冻2 h用于除脂。

图 2

Fig. 2

图 2 不同冷冻时间的除脂效果比较 Fig. 2 Comparison of degreasing effects at different freezing times

2.3.3 净化的选择

对于冷冻除脂后的样品, 考察了中性氧化铝、C18、PSA和Z-sep作为净化剂进行分散固相萃取净化的效果。在选定的仪器条件下, 比较未净化与净化后的加标样品总离子流色谱图, 发现在两个化合物的出峰位置未见明显的干扰(见图 3)。同时比较了未净化与不同净化剂净化后的回收情况, 为了避免基质效应的影响, 各组均采用相同净化手段的空白基质标样进行定量检测, 结果表明未净化组回收率相对较好(见图 4)。对于增塑剂这类环境中广泛存在的物质的检测, 保证检测过程不受污染最为重要, 净化虽然可以使样品更干净, 延长衬管的使用寿命, 但可能会增加污染的机会。对利弊进行权衡, 最终选择不对冷冻除脂后的样品再进行净化。

图 3

Fig. 3

图 3 不同净化方式下的样品总离子流图 Fig. 3 Total ion chromatogram of samples by different purification methods a. non-purification; b. neutral alumina; c. C18; d. Primary secondary amine (PSA); e. zirconia on silica (Z-sep).

图 4

Fig. 4

图 4 净化方式对回收率的影响 Fig. 4 Effects of purification methods on the recoveries

2.4 标准曲线配置方法的选择

实验测得对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和偏苯三甲酸三(2-乙基己基)酯的基质效应(基质效应=基质标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率)分别为1.43和1.45, 具有明显的基质增强效应。从ChemSpider查得对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和偏苯三甲酸三(2-乙基己基)酯的油水分配系数(lg P)值分别为9.55和12.80, 说明两者的亲脂性较强, 特别是偏苯三甲酸三(2-乙基己基)酯, 通过两次提取回收率仍小于80%。综上原因, 采用空白样品加入不同浓度标准物质同步处理的方式制得标准曲线, 以便更准确的定量。

2.5 线性范围、检出限与定量限

按照本文1.3节配制校准溶液, 在0.005~0.5 mg/L范围内, 对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和偏苯三甲酸三(2-乙基己基)酯的质量浓度(x, 单位mg/L)与对应的峰面积(y)均呈良好的线性关系。以不同浓度空白加标样品定量与定性离子对均满足3倍信噪比确定方法的检出限, 以定量与定性离子对均满足10倍信噪比确定方法的定量限(见表 2)。

表 2 (Table 2)

表 2 方法检出限(LOD)、定量限(LOQ)与线性关系 Table 2 Limits of detection (LODs), limits of quantification (LOQs), and linear relationships of the method Compound LOD/ (mg/kg) LOQ/ (mg/kg) Regression equation r2 DEHT 0.03 0.1 y=5341x+12900 0.9995 TEHTM 0.03 0.1 y=11160x+64230 0.9964 y: peak area; x: mass concentration, mg/L.

表 2 方法检出限(LOD)、定量限(LOQ)与线性关系 Table 2 Limits of detection (LODs), limits of quantification (LOQs), and linear relationships of the method

2.6 回收率与重复性

如表 3所示, 在空白大豆油中添加0.1、0.3、1.0 mg/kg的对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和偏苯三甲酸三(2-乙基己基)酯进行回收实验, 每个添加水平重复测定5次。2种化合物的回收率为81.04% ~108.31%, 相对标准偏差为0.70% ~9.91%。

表 3 (Table 3)

表 3 不同添加水平下的回收率与相对标准偏差(RSD)(n=5) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) at different spiked levels (n=5) Compound 0.1 mg/kg 0.3 mg/kg 1.0 mg/kg Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% DEHT 81.04 0.70 91.29 9.91 108.31 4.48 TEHTM 103.43 2.72 99.54 9.82 104.37 7.66

表 3 不同添加水平下的回收率与相对标准偏差(RSD)(n=5) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) at different spiked levels (n=5)

2.7 实际样品检测

对购于湖北市场的8份不同品种、不同工艺和不同包装材料的食用油进行检测, 8份样品中均未检出对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和偏苯三甲酸三(2-乙基己基)酯(见表 4)。

表 4 (Table 4)

表 4 不同市售瓶装食用油2种增塑剂检出情况 Table 4 Detection of the two plasticizers in different bottled edible oils on sale Sample name Process Container DEHT TEHTM Sesame oil 1 pressing glass ND ND Sesame oil 2 aqueous extraction glass ND ND Sesame oil 3 aqueous extraction glass ND ND Peanut oil pressing PET ND ND Soybean oil 1 leaching PET ND ND Soybean oil 2 leaching PET ND ND Soybean oil 3 leaching PET ND ND Soybean oil 4 leaching PET ND ND ND: no detection; PET: polyethylene terephthalate.

表 4 不同市售瓶装食用油2种增塑剂检出情况 Table 4 Detection of the two plasticizers in different bottled edible oils on sale

3 结论

通过优化仪器条件与前处理条件, 建立了同步测定食用油中两种非邻苯二甲酸酯类增塑剂的方法。采用乙腈提取, 于-20 ℃冷冻除脂净化, 用气相色谱-三重四极杆串联质谱检测技术, 简便、准确地测定了食用油中对苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和偏苯三甲酸三(2-乙基己基)酯。

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