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  色谱  2019, Vol. 37 Issue (12): 1343-1348     DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.08004   PDF    
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杜梨
李娜
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王翰云
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王学生
聚[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵-乙二醇二甲基丙烯酸酯整体柱固相萃取结合高效液相色谱法测定尿液中3种苯二氮类药物
杜梨1, 李娜1, 刘美琨1, 王翰云1, 张倩影2, 王曼曼1, 王学生1     
1. 华北理工大学公共卫生学院, 河北 唐山 063210;
2. 华北理工大学附属医院, 河北 唐山 063000
收稿日期：2019-08-03
基金项目：河北省自然科学基金项目（H2017209232）；河北省教育厅重点项目（ZD2018014）
通讯联系人：王曼曼.E-mail:mmwangheuu@126.com; 王学生.E-mail:xswang64@163.com
摘要：以[2-（丙烯酰氧基）乙基]三甲基氯化铵（DAC）为单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为交联剂在注射器中制备聚合物整体柱，用其固相萃取尿液中溴西泮（BRZ）、劳拉西泮（LRZ）和地西泮（DZP）3种苯二氮类药物（BZDs），并采用高效液相色谱法（HPLC）分析。实验考察了整体柱聚合时间及固相萃取条件（淋洗溶液、洗脱溶剂种类和体积）对BZDs萃取效率的影响。结果表明，仅聚合4 h得到的整体柱对BZDs吸附效率为100%。取尿液样品4 mL上样，用4 mL H2O冲洗，1 mL乙酸乙酯洗脱，采用高效液相色谱分析。在最优条件下，3种BZDs在4.0~1000 ng/mL范围内线性关系良好（r=0.999），检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分别为1.0~1.2 ng/mL和3.3~4.0 ng/mL；在10、25和50 ng/mL加标水平下回收率为81.4%~102%，日内（n=3）和日间（n=3）相对标准偏差分别为1.2%~4.5%和2.5%~8.3%。该整体柱可对尿液中3种BZDs有效净化，且富集达12~15倍。方法构筑的聚合物整体柱制备简单，萃取高效，可成功用于尿液中3种BZDs的分析。
关键词：高效液相色谱    固相萃取    聚合物整体柱    [2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵    苯二氮类药物    尿液    
Determination of three benzodiazepines in human urine by solid-phase extraction with poly [2-(acryloyloxy) ethyl] trimethyl ammonium chloride-co-ethylene glycol dimethacrylate monolithic column coupled with high performance liquid chromatography
DU Li1, LI Na1, LIU Meikun1, WANG Hanyun1, ZHANG Qianying2, WANG Manman1, WANG Xuesheng1     
1. School of Public Health, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China;
2. North China University of Science and Technology Affiliated Hospital, Tangshan 063000, China
Foundation item: Natural Science Foundation of Hebei Province (No. H2017209232); Research Foundation of Education Bureau of Hebei Province (No. ZD2018014)
Abstract: A polymer monolithic column was prepared in a syringe by using [2-(acryloyloxy) ethyl] trimethyl ammonium chloride (DAC) as a monomer and ethylene glycol dimethacrylate (EDMA) as a crosslinker. The obtained monolith was developed as a solid-phase extraction sorbent and used with high performance liquid chromatography (HPLC) for the analysis of three benzodiazepines (BZDs) including bromazepam (BRZ), lorazepam (LRZ) and diazepam (DZP) in urine. The effects of reaction time and the solid-phase extraction conditions (washing solution, elution solvent and volume) on the extraction efficiencies of the three BZDs were investigated. The monolithic column was successfully prepared within 4 h, and it offered 100% adsorption efficiency for the three BZDs. The urine sample (4 mL) was loaded on the monolith, washed with 4 mL of H2O, and eluted with 1 mL of ethyl acetate. Under the optimized conditions, the linear ranges were 4.0-1000 ng/mL for the three BZDs, with correlation coefficients (r) of 0.999. The limits of detection (S/N=3) and limits of quantification (S/N=10) of the three BZDs were in the range of 1.0-1.2 ng/mL and 3.3-4.0 ng/mL, respectively. The recoveries at three spiked levels (10, 25 and 50 ng/mL) of the three BZDs ranged from 81.4% to 102%, with intra-day and inter-day relative standard deviations (n=3) of 1.2%-4.5% and 2.5%-8.3%. The polymer monolithic column provided effective purification for the three BZDs in urine and the enrichment factor was 12-15. This polymer monolithic adsorbent has the advantages of easy preparation and high extraction efficiency. It is successfully applied to the determination of the three BZDs in urine samples.
Key words: high performance liquid chromatography (HPLC)     solid-phase extraction (SPE)     polymeric monolithic column     [2-(acryloyloxy) ethyl] trimethyl ammonium chloride (DAC)     benzodiazepines (BZDs)     urine    

苯二氮类药物(benzodiazepines, BZDs)是一类母核结构为1, 4-苯并二氮的药物[1, 2], 因具有吸收快、代谢快和用药量少等特点而被广泛应用于临床治疗失眠和精神障碍类疾病。然而, 长期服用BZDs易产生依赖性和耐药性[3]。大多数BZDs代谢后可经尿液排出体外, 因此常通过测定尿液中BZDs的浓度评价该类药物的摄入情况以指导临床治疗[4]。目前, 常采用高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)和气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)等测定尿液中BZDs[5-8]。

在仪器分析之前, 由于尿液成分复杂且BZDs含量低, 需要采用液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)等技术进行富集净化。SPE是利用固体吸附剂吸附液体样品中的目标化合物, 然后选择性洗脱, 而达到富集净化复杂基质中目标化合物的一种前处理技术[9]。吸附剂作为其核心, 决定了分析方法的时间、成本和准确度。目前主要使用亲水-亲脂平衡柱、离子交换柱和C8/C18柱等商品化固相萃取柱[10, 11]对尿液中BZDs进行前处理。基于吸附剂在分析过程中的重要作用, 新型高效吸附剂的开发成为研究热点。

有机聚合物整体柱是通过单体、致孔剂、交联剂和引发剂等混合物的原位聚合得到的连续棒状材料, 具有制备简单、性质稳定和结构多孔等特性[12]。与填充型吸附剂相比, 它避免了装填过程, 使用时其多孔结构易于传质, 提高了萃取效率, 因而被广泛用于样品前处理领域[13]。李娜等[14]使用聚(乙二醇二甲基丙烯酸酯)整体柱对血清中卡马西平和10-羟基卡马西平进行前处理, 结合高效液相色谱分析, 检出限为0.004 μg/mL和0.01 μg/mL, 回收率为92.7%和94.2%。Yang等[15]采用聚(乙烯基苯硼酸-N, N-亚甲基双丙烯酰胺)整体柱结合高效液相色谱对尿液中4种单胺类神经递质进行富集, 富集因子高于17, 检出限为0.06~0.08 μg/L, 回收率为81.0% ~105.5%。

本研究以[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵(DAC)为单体, 乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂在注射器模具中制备聚(DAC-co-EDMA)整体柱, 结合HPLC, 建立简单、高效的尿液样品中3种BZDs的分析方法。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Agilent1260型高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD, 美国Agilent公司); Hitachi S-4800扫描电子显微镜(日本日立公司); FTIR-8400S傅里叶红外光谱仪(日本岛津公司)。

80% (质量分数)DAC水溶液、乙酸乙酯(ethyl acetate, 色谱纯)和EDMA(纯度98%)(上海阿拉丁试剂公司); 甲醇(methanol, MeOH)和乙腈(acetonitrile, ACN)(色谱纯, 美国Thermo Fisher Scientific公司); 醋酸铵(NH4Ac)、正丙醇、聚乙二醇400和偶氮二异丁腈(纯度99%, 天津市光复精细化工研究所); 丙酮(acetone, 唐山市路北区化工厂); 娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司); ProElut C18固相萃取柱(60 mg/3 mL, 北京迪马科技发展公司); 一次性聚乙烯无菌注射器(2 mL, 江西丰临医用器械有限公司)。

标准品:溴西泮(bromazepam, BRZ, 纯度99.9%)、劳拉西泮(lorazepam, LRZ, 纯度99.9%)和地西泮(diazepam, DZP, 纯度99.9%)的甲醇标准溶液(1 mg/mL)均购自美国Cerilliant公司, 其结构式见图 1。

图 1 3种苯二氮类药物的化学结构式 Fig. 1 Chemical structures of the three benzodiazepines (BZDs)
1.2 聚(DAC-co-EDMA)整体柱的制备

图 2为聚(DAC-co-EDMA)整体柱的合成示意图。量取35 μL DAC、500 μL EDMA、1 mL正丙醇、500 μL聚乙二醇400和50 μL H2O，混合均匀后, 加入8 mg偶氮二异丁腈, 超声混合均匀。取500 μL该溶液灌入一端封口的2 mL注射器中, 密封后于55 ℃水浴条件下反应4 h。反应结束后使用MeOH冲洗, 得到聚(DAC-co-EDMA)整体柱。

图 2 聚(DAC-co-EDMA)整体柱的合成示意图 Fig. 2 Fabrication diagram of poly (DAC-co-EDMA) monolith DAC: [2-(acryloyloxy) ethyl] trimethyl ammonium chloride; EDMA: ethylene glycol dimethacrylate.
1.3 尿液样品的采集和制备

采集4例口服1 mg LRZ患者9 h[16]后的尿液样品, 使用H2O稀释(尿液：H2O=3：1, v/v)后[8], 以1 500 r/min离心10 min, 收集上清液。采集若干名未服用BZDs的健康志愿者尿液作为对照样品, 处理方法同上。本实验经华北理工大学医学伦理委员会批准。

1.4 固相萃取

使用MeOH和H2O各2 mL，平衡聚(DAC-co-EDMA)整体柱, 上样4 mL尿液样品, 加压使其以1 mL/min的流速流出, 用4 mL H2O冲洗, 1 mL乙酸乙酯洗脱, 将收集的洗脱液于35 ℃、34 kPa条件下氮吹浓缩至干, 使用MeOH复溶至0.2 mL, 过滤, 进行HPLC分析。

1.5 HPLC条件

色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm); 柱温35 ℃; 流动相为(A)H2O和(B)MeOH; 流速为1 mL/min。梯度洗脱程序为0~5.0 min, 62%B; 5.0~13.0 min, 62%B~80%B。进样量:20 μL; 检测波长:228 nm。

2 结果与讨论
2.1 聚(DAC-co-EDMA)整体柱的构筑和表征

图 3a为聚EDMA和聚(DAC-co-EDMA)整体柱的红外光谱图, 与聚EDMA整体柱相比, 聚(DAC-co-EDMA)整体柱在1 456 cm-1和950 cm-1处出现的吸收峰为铵甲基C-H弯曲振动峰和季铵基团C-N伸缩振动峰, 在1 732 cm-1和2 881 cm-1处出现的吸收峰为C=O伸缩振动峰和=C-H伸缩振动峰[17], 说明DAC与EDMA成功聚合。将聚(DAC-co-EDMA)整体柱进行扫描电镜表征, 图 3b表明该柱具有均匀的孔结构, 作为吸附剂使用时, 有利于降低物质的传质阻力, 并提高吸附效率。

图 3 (a) 聚EDMA整体柱、聚(DAC-co-EDMA)整体柱的红外光谱图和(b)聚(DAC-co-EDMA)整体柱的扫描电镜图(×5000) Fig. 3 (a) FT-IR spectra of poly EDMA monolith, poly (DAC-co-EDMA) monolith and (b) scanning electron microscope (SEM) micrograph of poly (DAC-co-EDMA) monolith (×5000)

实验选择BZDs为探针目标物。固定反应温度为55 ℃, 考察聚合时间为2、3、4和5 h构筑的整体柱对3种BZDs吸附性能的影响(见图 4)。随着聚合时间的延长, 3种BZDs的吸附效率逐渐提高, 当反应时间增加到4 h时, 吸附效率达100%, 继续增加聚合时间至5 h后, 3种BZDs的吸附效率无明显变化, 因此实验最终选择整体柱的聚合时间为4 h。

图 4 聚合时间对3种苯二氮类药物吸附效率的影响(n=3) Fig. 4 Effect of reaction time on the adsorption efficiencies of the three BZDs (n=3)

实验同时考察聚EDMA整体柱对3种BZDs的吸附效率, 在相同吸附条件下, 聚EDMA整体柱对BRZ、LRZ和DZP的吸附效率分别为39.0%、26.3%和92.8%, 而聚(DAC-co-EDMA)整体柱对3种BZDs的吸附效率均达100%。聚EDMA柱床具有疏水性[18], 对脂水分配系数(log P)在2.2~4.0范围内的3种BZDs药物具有一定的吸附作用。当引入DAC单体后, 整体柱柱床增加的铵基提供了离子交换基团, 对于pKa在1.3~3.3范围内的3种BZDs而言，吸附作用显著提高至100%。

以吸附效率的相对标准偏差(RSD)评价同一批次(n=3)和不同批次(n=3)制备的聚(DAC-co-EDMA)整体柱的重复性, 批次内和批次间的RSD分别为1.7% ~2.8%和3.0% ~7.6%。该整体柱重复使用15次, 以3种BZDs的吸附效率计算RSD, 结果均≤8.9%。以上结果表明, 该柱制备简单, 用时短, 吸附效率高且重复性良好。

2.2 固相萃取条件的优化

固相萃取的淋洗和洗脱步骤决定了该方法的准确度。实验固定上样体积为4 mL, 上样含量为50 ng/mL, 考察淋洗溶液和洗脱溶剂种类对3种BZDs回收率的影响。

2.2.1 淋洗溶液种类

淋洗的目的是保留目标物的同时最大限度地去除杂质, 因此淋洗液的选择至关重要。以健康志愿者尿液样品分析, 固定淋洗溶液体积为4 mL, 洗脱溶剂为1 mL乙酸乙酯, 考察了H2O、ACN-H2O(5：95, v/v)、NH4Ac溶液(25 mmol/L, pH=5)和0.9%(质量分数)NaCl水溶液的淋洗效果。以上4种淋洗液对杂质的去除率均达到90%以上, 但当使用H2O作为淋洗液时, 3种BZDs的回收率最高(见图 5a)。因此实验选择H2O作为淋洗溶液。

图 5 (a) 淋洗溶液和(b)洗脱溶剂对3种BZDs回收率的影响(n=3) Fig. 5 Effects of (a) washing solutions and (b) elution solvents on the recoveries of the three BZDs (n=3) Solutions 1-4 were H2O, acetonitrile-H2O (5:95, v/v), ammonium acetate aqueous solution (25 mmol/L, pH 5) and 0.9% (mass fraction) sodium chloride aqueous solution, respectively.
2.2.2 洗脱溶剂的种类和体积

洗脱条件决定了方法的准确度, 实验固定淋洗溶液为4 mL H2O, 洗脱体积为1 mL, 考察4种洗脱溶剂(丙酮、ACN、MeOH和乙酸乙酯)对目标物的洗脱效果。当洗脱溶剂为乙酸乙酯时, 3种BZDs的洗脱效果最佳, 回收率为97.3% ~105% (见图 5b); 继续增加洗脱体积, 会延长氮吹浓缩的时间。因此, 实验最终选择1 mL乙酸乙酯进行洗脱。

2.3 聚(DAC-co-EDMA)整体柱的富集净化效果

为了评价聚(DAC-co-EDMA)整体柱对尿液中BZDs的富集净化效果, 对BZDs标准溶液(750 ng/mL)(见图 6a)和加标50 ng/mL尿液样品进行分析。如图 6b所示, 尿液样品直接进样分析时, 杂质的信号超过2 500 mAU, 3种BZDs的响应信号低, 无法定量。当经过聚(DAC-co-EDMA)整体柱富集和净化后(见图 6c), 杂质的信号明显降低, 各目标物均得到有效富集, 富集倍数为12~15倍, 回收率为86.9% ~102%。将尿液样品经商品化C18固相萃取柱前处理(见图 6d), 3种BZDs的回收率为68.1% ~114%, 并且杂质响应信号明显高于聚(DAC-co-EDMA)整体柱的净化结果。说明聚(DAC-co-EDMA)整体柱净化效果更佳。

图 6 (a) BZDs标准溶液(750 ng/mL)以及加标尿液样品(50 ng/mL)(b)直接进样、(c)经本方法处理和(d)经C18固相萃取柱处理的色谱图 Fig. 6 Chromatograms of (a) BZDs (750 ng/mL) in the standard solution, spiked urine sample (50 ng/mL) with (b) direct analysis, (c) pretreated by poly (DAC-co-EDMA) monolith, and (d) pretreated by C18 SPE column
2.4 方法验证
2.4.1 线性范围、检出限和定量限

在最佳实验条件下, 在4.0~1 000 ng/mL范围内配制一系列3种BZDs的标准溶液(n=7)进行分析, 以目标物的质量浓度(x, ng/mL)为横坐标, 峰面积(y)为纵坐标, 构建标准曲线(见表 1)。结果表明, 3种BZDs在4.0~1 000 ng/mL范围内线性关系良好, 相关系数(r)为0.999。

表 1 3种BZDs的线性范围、回归方程、相关系数、检出限、定量限、回收率和精密度 Table 1 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r), LODs, LOQs, recoveries and precisions of the three BZDs

对健康志愿者的尿液样品分析, 按信噪比(S/N)=3和S/N=10分别计算方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ), 结果分别为1.0~1.2 ng/mL和3.3~4.0 ng/mL。

2.4.2 回收率和精密度

为了验证该方法的准确度和精密度, 以健康志愿者的尿液为样品, 加标10、25和50 ng/mL 3个水平进行分析(n=3)。如表 1所示, 3种BZDs的回收率为81.4% ~102%, 日内和日间精密度(n=3)分别为1.2% ~4.5%和2.5% ~8.3%。表明该方法准确可靠。

2.5 实际样品分析

为了进一步验证方法的可行性, 使用聚(DAC-co-EDMA)整体柱, 结合HPLC测定4例服用LRZ患者的尿液样品。在4例患者的尿液样品中均检出了LRZ, 含量为(72.1±1.6)~(85.2±3.2) ng/mL, 加标回收率(加标水平为50 ng/mL)为78.2% ~98.3%, RSD≤5.0%。

3 结论

本研究制备了聚(DAC-co-EDMA)整体柱, 并结合HPLC建立了检测尿液中3种BZDs的方法。方法线性范围宽, 灵敏度和回收率高。该整体柱制备简单, 富集净化能力高效, 为尿液中BZDs的临床检测提供了一种新方法。

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