胺鲜酯(diethyl aminoethyl hexanoate, DA-6), 化学名称为乙酸二乙氨基乙醇酯, 是一种新型、广谱性植物生长调节剂[1]。研究表明, 低浓度胺鲜酯对多种植物有调节、控制和促生长的作用[2], 被广泛应用于玉米、白菜、花生、水稻等多种农产品中[3, 4]。同时, 为防止其过量使用导致的农残问题, 必须制定相应的残留限量标准。我国现行的《食品中农药最大残留限量》(GB 2763-2016)仅规定了胺鲜酯在玉米、花生仁、普通白菜和小白菜中的临时限量, 且没有相应的标准方法。
制定食品中农药的残留限量, 重要的依据就是检测方法的检出限。目前, 国内报道的胺鲜酯的测定方法主要是气相色谱法, 内容偏重于原药产品纯度的分析[5, 6], 此外, 采用气相色谱-质谱(GC-MS)、液相色谱-质谱(LC-MS)对水、土壤、水溶性肥料和白菜等环境样品中胺鲜酯残留检测的方法偶有报道[7-10]。但未见复杂基质如高糖或高色素量的水果中胺鲜酯残留分析的研究。
国内已有使用胺鲜酯提高苹果品质的实例[11], 制定苹果中胺鲜酯残留限量的要求日益紧迫。近年来, 果蔬中农药残留的分析主要是通过QuEChERS结合色谱-质谱技术, 但苹果中胺鲜酯的测定存在一定难度:一是基质复杂, 二是该农药的理化性质尚未有明确报道。本文采用GC-MS法, 并对QuEChERS前处理过程进行优化, 同时以QuEChERS结合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)对样品添加过程进行验证。本实验建立的分析方法针对性强, 灵敏度高, 适用于苹果中胺鲜酯残留的测定, 可为该农药残留限量标准的制定提供参考。
7890A-5975C气相色谱-质谱仪(美国Agilent公司); Agilent Technologies 1290 Infinity超高效液相色谱-AB SCIEX Triple Quad 4500三重四极杆质谱仪(美国AB公司); A11基本型分析研磨机、T18均质仪(德国IKA公司); Centrifuge 5804高速离心机、10 μL~1 mL移液枪(德国Eppendorf公司); R-210旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司); Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司); 电子天平(0.1 mg, 瑞士Mettler Toledo公司)。
胺鲜酯标准品(纯度≥98.5%, 国家标准物质研究中心); 乙腈、二氯甲烷、丙酮(色谱纯, 德国Merck公司); 氯化钠、无水硫酸镁、无水硫酸钠(分析纯, 南京化学试剂有限公司); 乙二胺-N-丙基硅烷(PSA, 分析纯, 美国Waters公司)实验用水为Milli-Q(美国Millipore公司)制备的超纯水。
供试的苹果样品为市场上购买的有机苹果, 经研磨成浆后冷冻保存。
称取10.2 mg胺鲜酯标准品, 置于100 mL棕色容量瓶中, 用丙酮溶解并定容至刻度, 配制成0.1 g/L的标准储备液, 于4 ℃避光保存, 有效期3个月。分别移取适量标准储备液, 用丙酮稀释, 配制0.005~0.2 mg/L系列标准溶液, 供GC-MS检测。若采用UPLC-MS/MS仪器检测, 则使用乙腈作溶剂, 标准品称量和溶剂用量与采用GC-MS时相同。
色谱柱:Agilent HP-5 MS柱(30 m×250 μm×0.25 μm); 进样口温度:260 ℃; 载气:氦气(纯度≥99.999%); 流速:1.5 mL/min。升温程序:初始温度80 ℃, 保持0.5 min; 以15 ℃/min升温至120 ℃, 保持1 min; 以5 ℃/min升温至160 ℃, 保持2 min; 再以25 ℃/min升温至200 ℃, 保持1 min; 最后以50 ℃/min升温至280 ℃, 保持2 min。进样方式:不分流进样; 进样量:1 μL。
离子源:EI源; 离子源温度:230 ℃; 四极杆温度:150 ℃; 电子扫描方式:选择性离子扫描(SIM)。特征碎片:m/z 86、100和143;定量碎片:m/z 86。
色谱柱:Agilent EC-C18柱(75 mm×2.1 mm, 2.7 μm); 柱温:30 ℃; 流动相A:甲醇; 流动相B: 0.2%(v/v)甲酸水溶液; 流速:0.4 mL/min。梯度洗脱程序:0~0.01 min, 50%B; 0.01~1.00 min, 50%B~25%B; 1.00~2.00 min, 25%B~50%B; 2.00~4.50 min, 50%B~90%B; 4.50~5.00 min, 90%B~50%B。进样量:5 μL。
离子源:ESI源, 正离子模式; 扫描方式:多反应离子监测(MRM); 定性/定量离子对:m/z 216.1/143.3和216.1/99.9;去簇电压(DP): 40 V; 碰撞能量(CE): 23.6 eV(定性离子对)、22.0 eV(定量离子对); 入口电压(EP): 10 V; 碰撞室出口电压(CXP): 7.0 V。
准确称取磨碎后的供试苹果样品5 g(精确至0.01 g), 置于80 mL具塞离心管中, 加入25 mL加热至40 ℃的超纯水, 涡旋30 s, 匀浆2 min。匀浆后的混合物经高速离心分离后过滤, 将滤液转移至分液漏斗中, 用20 mL二氯甲烷液液萃取, 重复萃取1次, 取混合后的萃取液10 mL, 于鸡心瓶中缓慢旋蒸至干, 加入2 mL丙酮溶解残余物并定容。定容液转移至10 mL离心管中, 加入0.1 g PSA和0.1 g无水硫酸镁, 涡旋30 s, 以8 000 r/min离心5 min, 取1 mL离心后的溶液, 过0.22 μm有机滤膜, 供GC-MS检测。
同时, 建立胺鲜酯分析的超高效液相色谱-串联质谱法, 相应地, 将1.5.1样品前处理最后一步的定容溶剂换作乙腈, 对方法的回收率进一步确定。
为探究使用HPLC测定胺鲜酯的可行性, 本实验配制20、30和50 mg/L胺鲜脂的乙腈标准溶液, 以甲醇-0.1%(v/v)磷酸水(7：3, v/v)作为流动相, 采用RP-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 在柱温30 ℃下, 用光电二极管阵列检测器(全扫描波长)分析。结果表明:在190~400 nm波长下, 获得的色谱图中均无胺鲜脂的特征吸收峰(见图 1)。可能是胺鲜酯的分子结构(见图 2)中不具备对光电二极管阵列检测器响应的基团。胺鲜脂的分子结构中仅有一个羧基, 不具备通常产生紫外吸收的C=C共轭及苯环结构, 而羧基的吸收波长多为100~200 nm。因此高效液相色谱-光电二极管阵列检测器无法检测胺鲜脂。
参考已有文献[7], 初步建立了GC测定胺鲜酯的方法。同时, 为避免苹果中杂质分子的干扰, 对升温程序进一步优化, 使其保留时间(9.2 min)在合理范围内, 保证胺鲜酯既不受杂质峰的干扰, 也不因保留时间滞后降低分析效率。
色谱柱的选择 通常有机农药的分析采用HP-1 MS或HP-5 MS色谱柱, HP-1 MS色谱柱的填充物为二甲基硅氧烷, 通常针对非极性化合物有较好的分离效果, 应用于相对分子质量较低的醇类, 分析效果较佳; HP-5 MS柱的填充物为5%二苯基-95%二甲基亚芳基硅氧烷共聚物, 热稳定性较高, 柱流失低, 适合弱极性化合物的分离。因此, 本研究选择HP-5 MS色谱柱。
特征碎片离子的选择 首先采用全扫描模式, 对0.2 mg/L胺鲜酯的丙酮标准溶液进行测定, 确定其特征碎片离子的m/z为86、100和143;同时发现m/z为86的碎片离子丰度值较大且稳定, 宜作为定量离子。
进样溶剂的影响 胺鲜酯在乙酸乙酯、二氯甲烷及丙酮溶液中均具有较好的溶解性。通过多次进样, 发现乙酸乙酯作进样溶剂时, 其在色谱柱、进样针或进样口垫片处可能存在较大残留, 导致重复性测定结果不稳定, 同一样品多次进样的峰面积值浮动高达200%。从溶剂极性和对HP-5 MS色谱柱填充物保护的角度考虑, 相比二氯甲烷, 丙酮作为进样溶剂更为合适。在优化的分析条件下, 胺鲜酯标准溶液(0.1 mg/L)的色谱图见图 3。
QuEChERS是一种农药多残留前处理方法。该方法操作简单, 前处理时间短, 有机溶剂用量少, 已成为多残留分析的首选方法[12, 13]。为探究契合GC-MS方法的样品前处理方法, 本实验对比了0.008、0.01和0.1 mg/kg添加水平下, 3种前处理方法下苹果中胺鲜脂的加标回收率。
方法一:将提取剂丙酮、净化剂无水硫酸镁和辅助提取剂氯化钠, 加入到研磨后的苹果中进行匀浆提取, 提取后的混合物经高速离心分离、过滤, 滤液再以PSA+无水硫酸镁净化, 净化液在1.3节条件下测定。
方法二:将提取剂乙腈(或丙酮)、净化剂无水硫酸镁和辅助提取剂氯化钠加入到研磨后的苹果中匀浆提取, 提取后的混合物经高速离心分离、过滤, 滤液经旋转蒸发浓缩并以丙酮定容, 定容液以PSA+无水硫酸镁净化, 净化液在1.3条件下测定。
方法三:同1.5.1节描述。
采用方法一：在0.008、0.01和0.1 mg/kg 3个添加水平下, 样品中胺鲜酯的峰面积平均值均在106以上, 且与添加水平无明显正相关性。0.01 mg/kg添加水平(理论进样浓度为0.002 5 mg/L)下的峰面积甚至高于0.02 mg/L的基质溶液。分析其中原因, 可能主要是因为丙酮提取液中杂质成分较多, 杂质峰对样品峰产生包裹作用; 抑或是在溶剂作用下, 胺鲜酯分子与杂质分子形成了配合物, 且不能通过净化作用去除。有研究[13]将农药的乙腈提取液经净化后直接进GC-MS系统检测, 但本研究认为, 乙腈膨胀系数大, 其溶液在汽化时容易充满衬管造成目标物不能全部进入色谱柱, 引起检测误差或污染系统, 因此未采用。
采用方法二：在0.1 mg/kg添加水平下, 无论以丙酮作提取溶剂, 还是以乙腈作提取溶剂, 胺鲜酯的平均回收率均低于10%。造成该结果可能的原因是在旋转蒸发浓缩步骤中, 提取液基质作用产生的影响, 由于受提取溶液中果糖、蛋白质等大分子影响, 提取液沸程增长, 导致具有一定挥发性的胺鲜酯产生较大的损失, 回收率过低。
采用方法三：基质作用对测试结果的影响在可接受范围内, 在0.01 mg/kg和0.1 mg/kg添加水平下, 胺鲜酯的平均回收率≥75.0%, RSD＜3.0%, 满足测定要求。分析其原因, 可能得益于反萃取操作, 既对温水提取液中杂质进行了筛除, 同时二氯甲烷的沸点远低于目标物, 萃取液沸程较短, 因此胺鲜酯损失较小, 回收率较高。
采用UPLC-MS/MS对样品的添加过程的准确性进行了辅助验证, 证实样品的添加误差可控制在±5%范围内。
基质效应是指基质成分和目标化合物在进行离子化时相互竞争而导致目标化合物信号强度有不同程度的增强或减弱的现象, 包括基质增强效应和基质抑制效应[14]。基质效应通常采用基质匹配标准溶液曲线与溶剂标准溶液曲线的斜率之比进行评价, 比值小于1, 存在基质抑制效应, 反之存在基质增强效应。基质效应会影响某些待测物定量与定性的准确性, 因此要对基质效应进行考察评估, 并采取有效措施进行消除或补偿。通过基质匹配标准溶液曲线方程计算未知样品的浓度, 能够有效消除基质效应对样品真实浓度的影响[15]。
使用1.5.1节所述前处理方式处理空白样品, 制备基质提取液, 配制相应的基质标准溶液, 供仪器检测。结果表明, 通过UPLC-MS/MS检测, 胺鲜酯在苹果基质中存在基质抑制效应; 通过GC-MS检测, 存在基质增强效应(见表 1)。因此, 当采用不同的仪器检测时, 应采用相应的基质匹配标准曲线计算未知样品浓度。
使用GC-MS分析基质匹配标准溶液, 在0.005~0.2 mg/L范围内, 胺鲜酯的峰面积(y)与对应的质量浓度(x, mg/L)呈现良好的线性关系, 相关系数大于0.999(见表 1)。
以3倍信噪比(S/N)确定方法的检出限(LOD), 以最低添加、能准确定量的浓度确定方法的定量限(LOQ)。苹果中胺鲜酯的LOD和LOQ分别为0.002 4 mg/kg和0.008 mg/kg。
按1.5节描述向空白基质中分别加入低、中、高3个水平的混合标准溶液, 进行加标回收试验(n=3)。结果表明, 使用GC-MS测定时, 苹果中胺鲜酯的平均加标回收率为74.1% ~84.2%, 相对标准偏差为1.5% ~4.1%(见表 2)。
本工作建立了QuEChERS结合反萃取的前处理技术, 并结合GC-MS检测苹果中胺鲜酯的分析方法。该方法针对性强, 快速、高效, 灵敏度、精密度均较高, 可为该农药残留限量的制定提供参考。在后续的工作中, 应在合理的基质效应范围内, 扩展可应用的检测仪器, 进一步提高该农药残留检测的灵敏度。
2019,
Vol. 37 Issue (12): 1363-1367 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.08021 
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2019,
Vol. 37 Issue (12): 1363-1367 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.08021 PDF