色谱 ›› 2012, Vol. 30 ›› Issue (01): 1-2.DOI: 10.3724/SP.J.1123.2012.01005
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耿信笃
GENG Xindu
摘要： 有幸受邀为一个月前出版的J Chromatogr A撰写了一篇题为“生物大分子的混合色谱及应用”的综述文章,在此后又有几篇很有创意的相关论文发表,在此选择具有代表性的有关蛋白质和多肽分离的论文3篇及本人所撰写的综述文章共4篇论文的内容简要作一介绍。 混合模式色谱(mixed-mode chromatography, MMC)指的是应用多种作用力使溶质在固定相上进行保留和分离的色谱方法。与传统的单一模式色谱相比,MMC具有高选择性、高负载量。在一些情况下一根MMC柱具有与相对应的多根单模式色谱柱相当或更好的分离效率,故一根MMC柱可代替2根或多根单模式色谱柱。当其用于在线单柱二维液相色谱时,在高流速下,从第一维到第二维的所有操作均可在一个封闭的体系中完成,包括所收集的第一维馏分的储存、缓冲溶液的交换、体系的再平衡、所收集馏分的再进样等所有操作均能在数分钟内完成,目标蛋白质不离开这一具正压的封闭体系,从而不仅可以快速地将目标蛋白质定量转移到下一分离步骤,同时也可防止来自环境的污染。 但是,作为一个新的领域,仍有很多理论和应用方面的细节需要进一步研究;最重要的目标之一是要得出一个为人们普遍接受的MMC机理,在此基础上开发更多的MMC固定相并加以应用;还要开发出有更高分离效率的MMC色谱柱,而不是广泛意义上的混合机理柱,因为前者具有较两根单独的商品柱更高的峰容量和选择性,能取代两根普通的商品柱。在新的MMC柱被合成或商品化之前,很多商品化的离子交换色谱(IEC)柱也可以IEC和疏水作用色谱(HIC)模式分离生物大分子。通过优化流动相pH、盐浓度、溶剂及其他色谱条件,在任何实验室都可以此方式实施较一维液相色谱更好的离线、甚至在线的单柱二维液相色谱分离。详见文献[1]。 中科院大连化学物理研究所梁鑫淼研究员所带领的研究小组合成了一种新的称之为C18WCX的MMC介质,并利用其对多肽实施了二维液相色谱分离。该MMC介质是在硅胶基质上键合了正十八烷基和3羧丙基而成的极性聚合配基,其中的十八烷基显示了强的疏水性,而共聚的羧丙基则显示出弱阳离子交换(WCX)性质。在用此C18WCX固定相对多肽进行分离时,在中性和弱碱性条件下该固定相与多肽相互作用呈现出电荷相互作用和疏水相互作用共同起作用的反相液相色谱(RPLC)/IEC混合机理；而在pH 3.0时却显现出RPLC分离机理。用此C18WCX柱为第一分离色谱柱在pH 6.5的梯度洗脱条件下对鼠脑的可溶性蛋白质酶解所得的多肽进行了一维分离,将不同时间段的收集液冻干后再依次进样到第二维的常用C18毛细管柱上,在pH 3.0的条件下进行再分离后,用串联质谱(MS/MS)进行了鉴定。与单纯用一维的nano-RPLC-Q/TOF质谱分析得到84个蛋白质和292个多肽这一结果比较,用该离线的二维C18WCX-RPLC/LC-MS/MS法从相同样品中能得到1031个蛋白质和4397个特征多肽,大大地提高了分离能力和检测的蛋白质和多肽的数目。该方法应当在蛋白质组学中发挥其应有的作用。作者还特别指出:该C18WCX固定相在其作为第一维色谱柱进行分离时就显示出了具有RPLC和IEC正交机理的效果；此外,该固定相还会对强疏水性和碱性多肽显示出更好的分离效果。详见文献[2]。 近年来重组单克隆抗体(mAbs)已成为治疗许多疑难疾病(如癌症)的有效药物。因纯化该mAbs需要使用的蛋白质A亲和色谱柱非常昂贵,Pezzini等使用4种商品MMC柱对从中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary, CHO)培养液中捕集mAbs、去除宿主蛋白质和洗脱mAbs进行了全面的考察。该4种商品柱的填料分别为MEP HyperCel、PPA HyperCel、HEA HyperCel和Capto adhere,其相应的固定相端基分别为:4-巯基乙基吡啶(4-mercaptoethylpyridine,MEP)、苯丙胺(phenylpropylamino,PPA)、N-己胺(N-hexylamine,HEA)和N-苯基-N-甲乙醇胺(N-benzyl-N-methylethanol amine)。该4种端基的共性是均含有疏水和阳离子交换基团,故可以静电作用力和疏水作用力从CHO培养液中吸附mAbs。又因该4种色谱介质所含有的基团不同而显示出不同的pKa值和疏水强度,因此可采用不同的洗脱条件以去除宿主蛋白质和洗脱mAbs。作者对所用MMC机理的解释为:对PPA HyperCel和HEA HyperCel而言,二者显示出很强的疏水和静电作用力,其中的PPA HyperCel具有更强的混合机理。因MEP HyperCel具有较低的pKa值,在所有情况下静电作用力都很弱,疏水性作用力一直起主导作用;但是在Capto adhere介质中,静电作用力起主导作用,故该二色谱介质为弱混合机理;基于宿主细胞蛋白质与mAbs物理性质与化学性质的差别,可选择不同的pH和盐浓度洗脱条件洗出宿主蛋白质,使mAbs不被洗脱,最后又可选择另外的pH和盐浓度洗脱并回收mAbs。此外,作者还介绍了用96孔板高通量地快速筛选其洗脱条件,然后直接放大到实验规模色谱柱条件下进行纯化。该作者还认为这4种MMC介质有可能用于其他抗体的纯化。详见文献[3]。 Saufi等采用一种新方法将阳离子和阴离子交换树脂同时嵌入同一张膜以制备混合模式膜(mixed-mode membrane, MMM),用来实现从乳清或血清中吸附并纯化高丰度的酸性和碱性蛋白质。该法将7.5%(质量分数)的SP Sepharose阳离子交换树脂和42.5%(质量分数)的MP500阴离子交换树脂同时加入到以乙烯-乙烯醇为基质的聚合物溶液中,然后将膜成型。作者用该MMM几乎能将乳清或血清中的高丰度蛋白质完全吸附,其键合容量高(如：1 g膜可键合(59.2±9.9) mg的β-乳球蛋白）。预计1 m3的成型膜1 h能生产约25 kg总乳清蛋白。与通常所使用的化学改性方法比较,以该物理吸附法制备MMM的优点之一是制备方法简单，且所制得的膜具备与化学改性法所制备膜相当的吸附容量和动力学性质。此外,更重要的一点是可依据样品的性质和待吸附酸、碱蛋白的相对量调节加入到成膜溶液中的阴、阳离子交换树脂的质量比,获得“量身订做”的效果,使该法更具针对性和适用性。如:在乳清中有约95%的带负电荷的酸性蛋白,如β-乳球蛋白(pI 5.2)、牛血清蛋白(pI 4.7～4.9)、α-乳清蛋白(pI 4.5～4.8)和免疫球蛋白(pI 5.5～8.3),剩下的约5%是带正电荷的碱性蛋白,如乳清传递蛋白(pI 8～9.5)、乳酸过氧化氢酶(pI 9.5)和免疫球蛋白(pI 5.5～8.3)。从理论上讲,如不考虑键合容量,MMM中阴离子交换树脂与阳离子交换树脂的比例应为95∶5。为使所制的该混合膜（M5）更实用和具有更好的可行性（proof-of-concept），将酸性蛋白质和碱性蛋白的质量分数设定为85%和15%。上述在MMM成膜前向聚合物溶液中添加阴、阳离子交换树脂量，42.5% MP500和7.5% SP Sepharose，便是由此而得。该被吸附在MMM上的蛋白质可以依据待洗脱蛋白质的特征,通过改变pH值等方法分批将其洗脱之。详见文献[4]。
