食品过敏原, 是指食物中某些能够选择性地刺激人体细胞, 引起机体免疫系统异常的成分, 其种类繁多, 已成为全球关注的重大公共卫生热点问题和新兴食品安全问题[1]。一般地, 引起食物过敏症的过敏原多数来源于食物中的蛋白质, 约90%的食品过敏来自8大类食品, 包括鸡蛋、牛奶、鱼、甲壳类、大豆、花生、坚果类及小麦[2]。由于婴幼儿的抵抗力弱, 且目前尚无治疗食物过敏的根本方法, 预防食物过敏的重要途径是严防接触过敏原[3]。因此, 亟须发展有效的手段对婴幼儿食品中的多类过敏原进行同时检测, 并建议在包装上加以标明, 避免过敏者误食。
目前, 食品过敏原常用的分析方法主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)、聚合酶链式反应法(PCR)和液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)[4-6]。其中ELISA是基于抗原或抗体的固相化以及抗原或抗体酶标记的免疫学方法, 具有实用性强、特异性高且敏感性强的优点, 但该方法存在交叉作用且一次只能检测一个目标物, 检测通量较低; 且易受到抗体种类限制以及抗原-抗体反应不完全等因素的影响, 导致检测灵敏度降低[7, 8]。PCR是基于DNA的分子生物学方法, 虽然可以实现多种目标物同步检测, 但其易受过敏原蛋白质的浓度、物种、生长条件和DNA水平等限制, 且容易出现假阳性结果, 难以实现复杂食品基质中过敏原的检测[9, 10]。相比于PCR和ELISA检测, LC-MS/MS不仅能直接对目标过敏原进行鉴定, 还可以同时分析不同亚型, 方法的选择性、准确度、通量均有很大提高, 目前被广泛应用于食物过敏原蛋白质的研究中[11-14]。Simon等[15]利用LC-MS/MS实现了甲壳类过敏原卵黄蛋白原的检测, 其线性范围为2.5~25 000 pg/mL, 检出限可达0.75 pg/mL, 结果优于常用的ELISA。Huschek等[16]通过合成同位素标记的特征肽段并结合液相色谱-质谱联用, 实现了白羽扇豆中多种植物过敏原蛋白质(Gly m6 soy, Ses i6 sesame及β-conglutin)的分析, 回收率为70%~113%, 定量限达10~50 ppm。Planque等[17]基于LC-MS, 同时实现了牛奶、鸡蛋、花生和大豆等样品中过敏原的同时检测, 其检出限分别为0.5、3.4、2.5及5 mg/kg。目前仍然缺乏针对婴幼儿食品中多类过敏原蛋白质的具有高灵敏度、高准确度的同时检测技术。
本论文主要针对现有食品过敏原检测技术和方法存在的分析通量低、精确度和准确度差、灵敏度低的难题, 利用平行反应监测(PRM)技术以及基于高效液相色谱-质谱联用技术的高准确度、高通量的特异性肽段定量方法, 建立了可实现多类食物(鸡蛋、牛奶、花生、鱼、甲壳类、大豆及坚果类)中过敏原蛋白质同时检测的快速分析方法, 并对婴幼儿食品中的过敏原成分进行了测定。
利用Ultimate 3000色谱系统(Dionex公司, 美国)与Q-Exactive质谱仪(Thermo Fisher公司, 美国)构建一维纳升级平台(1D-nanoRPLC-ESI-MS/MS)进行蛋白质组的定量分析。超声破碎仪购自Cole-Parmer公司(美国)。真空浓缩仪购自Thermo Fisher公司(美国)。
牛胰蛋白酶、甲酸(FA)、尿素、Triton X-100、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇(DTT)与碘乙酰胺(IAA)购自Sigma-Aldrich公司(美国)。三氯乙酸(TCA)和苯甲基磺酰氟(PSMF)购自Fluka公司(美国)。甲醇与乙腈(ACN)购自Merck公司(德国)。BCA试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。氯化-1-十二烷基-3-甲基咪唑(C12 Im-Cl)购自上海成捷化学有限公司。所有实验用水均经过Milli-Q system (Millipore公司, 美国)纯化, 其他试剂均为分析纯。C18硅胶填料(粒径5 μm, 孔径10 nm)购自天津博纳艾杰尔。超滤离心管购自赛多利斯(截留分子质量, 10 kDa, 德国)。
过敏原蛋白质特征肽段选择:① 甲壳类:SEEEVFGLQK(肌球蛋白tropomyosin); ② 牛奶类:FALPQYLK(酪蛋白α-casein); ③ 花生类:GTGNLELVAVR(水溶性清蛋白Ara h1); ④ 鱼类:SGFIEEDELK(小清蛋白β-parvalbumin及isoforms); ⑤ 大豆类:SQSDNFEYVSFK(大豆球蛋白glycinin); ⑥ 鸡蛋类:YPILPEYLQCVK(卵清白蛋白OVA); ⑦ 坚果类:QGQVLTIPQNFAVAK(球蛋白11S globulin)及VGFNTNSLK(蓝豆蛋白γ-conglutin(羽扇豆类))。
提取方法1(丙酮沉淀法)[18]:称取0.1 g样品粉末, 加入1.5 mL提取液(20 mmol/L Tris-HCl, pH=8, 1%(质量分数)Triton X-100, 5 mmol/L EDTA), 振荡混匀, 超声, 离心(20 000 g, 20 min, 4 ℃)后取上清液, 加入4倍体积的冰丙酮(含质量分数为10%的TCA)溶液, 于-20 ℃下静置2 h, 离心(20 000 g, 20 min, 4 ℃), 取沉淀, 并用冰丙酮洗涤2次, 于空气中自然放干, 溶于1.5 mL 10 mmol/L碳酸氢铵溶液中, 采用BCA方法测定所得蛋白质的浓度并保存于-80 ℃备用。
提取方法2(膜上原位样品预处理法, in-situ filter-aided sample pretreatment, i-FASP方法):称取0.1 g样品粉末, 加入1.5 mL C12 Im-Cl离子液体提取液进行超声破碎(100%能量, 10 s开, 10 s关, 3 min)。将匀浆液离心(20 000 g, 20 min, 4 ℃), 取上清液, 采用BCA方法测定上清液中蛋白质的浓度, 并将上清液保存于-80 ℃备用。
将蛋白质提取液转移至预先润湿的超滤离心管中, 以14 000 g离心20 min; 于膜上加入200 μL DTT溶液(100 mmol/L, 溶于10 mmol/L碳酸氢铵溶液中), 于95 ℃下变性5 min, 以14 000 g转速离心20 min; 加入200 μL的10 mmol/L碳酸氢铵溶液洗涤, 以14 000 g转速离心20 min; 再向膜上加入20 μg蛋白酶, 5 μL 100 mmol/L IAA溶液(溶于10 mmol/L碳酸氢铵溶液中)和45 μL的10 mmol/L碳酸氢铵溶液, 于37 ℃反应过夜, 再以14 000 g离心20 min, 取下清液50 μL; 再向膜中加入50 μL去离子水冲洗, 以14 000 g离心20 min, 取下清液50 μL; 合并两次的下清液, 所得酶解液直接进行LC-MS/MS分析。
NanoRPLC的分离条件流动相A为98%H2O+2%ACN+0.1%FA(均为体积分数); 流动相B为98%ACN+2%H2O+0.1%FA(均为体积分数); 首先用100%的A在5 μL/min的流速下将样品上样到C18预柱(3 cm×0.15 mm), 然后在C18毛细管分离柱(15 cm×0.1 mm)上以500 nL/min的流速以如下梯度分离肽段:2%B(0 min)-5%B(0.1 min)-25%B(45 min)-40%B(65 min)-80%B(70 min)-80%B(75 min)-2%B(75.1 min)-2%B (85 min)。
Q-Exactive的质谱参数正离子模式，离子传输管温度为325 ℃，毛细管电压为2.2 kV。特征肽段参数的选择:采集方式为全扫描/数据依赖二级扫描(Full MS-ddMS2)，一级扫描范围为m/z 300~1 800，一级扫描分辨率为70 000，自动增益控制(AGC)为1×106，离子最大累积时间为120 ms; 二级扫描分辨率为17 500，AGC为2×105，离子最大累积时间为60 ms，Top N=20(前20强)，隔离窗口设为m/z 2，碰撞能(NCE)为28。肽段的质谱定量:采用PRM模式，二级扫描分辨率设为17 500，AGC为2×105，离子最大累积时间为200 ms，隔离窗口为m/z 2，二级质谱NCE为28。
本研究基于高准确度、高通量的PRM技术对特异性肽段进行定量, 并将其应用于婴幼儿食品中多种过敏原蛋白质的检测, 如图 1所示, 样品经过蛋白质提取、酶解成肽段, 再进行PRM定量分析。其中, 在样品预处理方面, 以婴幼儿食用米糊为样品, 考察了不同样品提取策略对蛋白质鉴定的影响。首先采用了Zhao等所在的课题组[19]发展起来的基于离子液体的i-FASP方法对米糊中的蛋白质进行提取, 接着采用BCA法测定蛋白质的浓度, 然后进行酶解及LC-MS/MS分离鉴定, 并与常用的丙酮沉淀法[18]进行比较。从BCA测定结果可知, 丙酮沉淀法从0.1 g米糊中提取的总蛋白质质量仅为0.150 mg, 而采用i-FASP方法所提取的蛋白质质量可达1.5 mg, 蛋白质提取效率提高了10倍。此外, 从质谱分析结果(见图 2)中可以看出, 采用丙酮沉淀法处理的样品中仍然含有较强的聚合物干扰峰(45~60 min有一簇价态为1的聚合物峰，一般肽段带多电荷), 会对定量分析产生干扰, 而i-FASP方法则不存在该现象。分析原因, 这主要得益于i-FASP方法中所采用的C12离子液体对蛋白质的强溶解能力, 同时结合膜上原位样品预处理技术, 使得整个样品预处理过程集成在膜上进行, 反复采用碳酸铵溶液进行冲洗去噪, 降低了预处理过程中由于转移、冻干、纯化等过程造成的蛋白质损失, 从而提高了蛋白质样品预处理的效率, 且离子液体的去除较为方便彻底。因此, 本文中所使用的样品均采用i-FASP方法处理, 采用该法可从0.1 g进口婴幼儿食品小饼干中提取蛋白质4.5 mg, 从1#小面包中提取蛋白质10.5 mg, 从2#小面包中提取蛋白质8.6 mg。
本研究的目的是针对甲壳类、鱼类、蛋类、牛奶、花生、坚果类、大豆这7类食品中的过敏原蛋白质进行高通量、高准确度的同时检测, 为此, 每类食品分别选择了一种文献中常见的过敏原蛋白质作为研究对象, 并合成了多条相应的特征肽段进行定量分析[20]。为确定各个过敏原蛋白质的最佳特征肽段及其保留时间段, 首先采用数据依赖型扫描进行采集, 并按照以下标准选择用于PRM采集的特征母离子:对于目标蛋白质有唯一性, 无漏切位点及翻译后修饰位点, 带电荷+2价到+4价, 且具有一定的强度和稳定性。将所鉴定的肽指纹信息利用Sequest搜索引擎进行匹配验证, 并结合相关文献, 确定了每种过敏原蛋白质的特征肽段及其对应保留时间(见表 1)。
为考察筛选到的各个肽段的线性范围和检测灵敏度, 制作了特征肽段标准品的标准曲线。以牛奶中过敏原酪蛋白的特征肽段FALPQYLK为例, 以峰面积与肽段质量浓度的对数值作线性曲线, 结果表明峰面积与质量浓度的对数的线性方程为y=1.523x+12.415(x为lg (肽段质量浓度); y为lg(峰面积)), 具有良好的线性关系(相关系数R2=0.991), 且方法重复性较好, 3次分析结果的相对标准偏差小于4% (n=3)。所测得肽段质量浓度的线性范围为0.01~10 mg/L, 换算成牛奶过敏原蛋白质α-酪蛋白(相对分子质量为26 019) 的质量浓度范围为0.266~265.619 mg/L, 定量限为0.266 mg/L。以此类推, 得到其他6类过敏原蛋白质的线性范围及检出限(见表 2), 结果表明采用PRM法测得过敏原蛋白质的定量限(LOQ)可达到0.028 mg/L, 优于文献[17, 21]报道的水平, 其线性范围可跨越4个数量级, 且线性关系均良好(R2≥0.99)。说明该方法在高通量同时检测多过敏原的同时仍保持PRM方法的高准确性、精密度和灵敏度。
为了进一步验证该方法在强干扰情况下的准确性, 我们将婴幼儿食品米糊提取液的酶解液作为空白本体, 分别添加不同质量浓度(10、1和0.1 mg/L)的特征肽段标准品, 进行PRM检测, 所得峰面积利用之前标准曲线的线性关系式进行定量, 检测回收率均在83%~109%之间, 3次重复测定的RSD值均小于4.6%(n=3), 充分证明该方法具有良好的抗干扰能力。
为进一步验证所建立的定量方法的可靠性和实用性, 将其用于检测4种进口婴幼儿食品(两种小饼干和两种小面包)中的过敏原结果见表 3。分析所得结果可以看出, 这4种进口零食中分别含有来自鸡蛋、牛奶及大豆等食品的过敏原蛋白质, 与该4种商品中成分标识相符, 说明该法可靠。
本研究建立了基于高效液相色谱-串联质谱联用技术的PRM方法, 实现了婴幼儿食品中多类过敏原蛋白质的同时检测。该方法对于多过敏原检测具有较好的灵敏度和准确性, 在多过敏原同时、高准确检测中具有很好的应用前景。该检测方法的建立有助于解决我国食品安全中的过敏问题, 并为完善我国食品过敏原标签管理提供了一定的技术支持。
2017,
Vol. 35 Issue (10): 1037-1041
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2017,
Vol. 35 Issue (10): 1037-1041
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