三聚氰胺标准品(纯度99% )、肌酐标准品(纯度为98% )、混合型阳离子交换(MCX)固相萃取柱(60 mg/3 mL)、N，O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷(BSTFA-TMCS)硅烷化试剂(上海安谱科学仪器有限公司); 吡啶(优级纯，美国TEDIA公司); 甲醇、氨水、三氯乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

7890A-5975C气相色谱-质谱仪(配7693A自动进样器，美国安捷伦公司); 固相萃取装置(美国Supelco公司); 氮吹仪(天津恒奥科技发展有限公司); 离心机(上海安亭科学仪器厂)。

肌酐与三聚氰胺的结构、性质类似，均为含氮单环化合物，属强极性化合物，可采用三氯乙酸提取、乙酸铅沉淀及混合型阳离子交换固相萃取净化^{[ 5, 6, 7, 8 ]}。

称取乳粉1.0 g(其他乳制品2.5 g)(精确到0.01 g)于25 mL容量瓶中，加入20 mL 1%三氯乙酸溶液，振荡1 min，超声提取15 min，再加入1 mL 22 g/L 乙酸铅溶液，用三氯乙酸溶液定容至刻度，摇匀。转移上层提取液于10 mL离心管中，于 5000 r/min 下离心10 min(婴幼儿乳粉于 10000 r/min 下离心30 min)。移取5 mL上清液于事先依次用5 mL甲醇、5 mL去离子水活化过的MCX固相柱中净化，分别用5 mL水和5 mL甲醇淋洗，用6 mL氨水-甲醇(5 ∶ 95, v/v)洗脱，收集洗脱液于10 mL具塞玻璃试管中，在75 ℃下于氮吹仪中通氮气缓缓吹干。冷却后加入0.7 mL吡啶及0.3 mL硅烷化试剂，加盖密封、摇匀后在75 ℃下衍生60 min，待测定。

GB/T 22388-2008依次使用3 mL水、3 mL甲醇为淋洗剂，3 mL氨水-甲醇溶液为洗脱剂。但一些婴幼儿奶粉样品淋洗后洗脱液仍呈浅白色，且高含量肌酐样品的回收率偏低。而依次使用5 mL水和5 mL甲醇淋洗后洗脱液比较清澈、图谱中的杂峰少、噪声低。同时对肌酐的洗脱曲线进行了考察，结果表明采用6 mL洗脱剂可将肌酐完全洗脱，故选择依次加入5 mL水和5 mL甲醇淋洗，用6 mL氨水-甲醇(5 ∶ 95, v/v)洗脱。

肌酐结构中两个支链的空间位阻会使其衍生条件比三聚氰胺更苛刻。实验结果表明，当使用0.3 mL硅烷化试剂时响应值最大(见图1)。进一步考察衍生温度和时间对衍生效果的影响，发现肌酐衍生物的响应值随衍生温度及时间的增加而增大直至衍生完全。考虑温度过高时密封性变差和工作效率变低，选择在75 ℃条件下衍生60 min作为硅烷化条件。

图1

Fig. 1

图 1 硅烷化试剂用量对衍生效果的影响 Fig. 1 Effect of reagent dose on the silylation of melamine and creatinine

三聚氰胺的特征离子为m/z 99、171、327、342^{[ 5 ]}。从图2可以看出m/z 329为肌酐衍生物的分子离子[M]⁺; m/z 314为分子离子失去甲基形成的碎片离子 ⁺，而m/z 73、100、115、143、171、256是 ⁺进一步分解形成的子碎片离子^{[ 17 ]}。选取其中m/z 115、143、314、329这4个高丰度的非色谱柱流失离子为肌酐的特征离子，其中m/z 115为定量离子。三聚氰胺及肌酐衍生物的特征离子和相对丰度见表1。

图2

Fig. 2

图 2 肌酐硅烷化物全扫描质谱图 Fig. 2 Mass spectrum of creatinine silylative

表 1 三聚氰胺及肌酐衍生物的定性、定量离子及相对丰度 Table 1 Quantitative and qualitative ions and standard relative abundances of melamine and creatinine silylative Compound Retention time/min Quantitative ion (m/z) (relative abundance/% ) Qualitative ions (m/z) (relative abundance/% ) Melamine silylative 14.92 327 (100) 342 (52), 171 (40), 99 (18) Creatinine silylative 12.28 115 (100) 143 (29), 314 (10), 329 (17)

表 1 三聚氰胺及肌酐衍生物的定性、定量离子及相对丰度 Table 1 Quantitative and qualitative ions and standard relative abundances of melamine and creatinine silylative

将三聚氰胺、肌酐标准品用甲醇分别制成 1000 mg/L 的标准储备液，使用前用甲醇稀释至0.1～50 mg/L 系列质量浓度的混合标准工作液。用氮气吹干后按样品的硅烷化条件处理，以定量离子峰面积Y为纵坐标，质量浓度X(mg/L)为横坐标进行线性回归，结果表明本方法在0.1～50 mg/L 时，线性方程分别为Y=1.577×10⁶X-1.527×10⁵(三聚氰胺)、Y=6.296×10⁵X-7.305×10⁴(肌酐)，相关系数均大于0.99。对已知目标物含量的奶粉样品进行分析，以S/N=10对应的质量浓度为定量限，单位换算后确定三聚氰胺定量限为0.10 mg/kg，肌酐定量限为0.20 mg/kg。

在不含有三聚氰胺和已知肌酐含量(54 mg/kg)的鲜乳中添加肌酐与三聚氰胺标准溶液分别为10、40、100 mg/kg 和0.1、1.0、5.0 mg/kg，计算其回收率和精密度(n=6)，结果见表2。

表 2 鲜乳中肌酐与三聚氰胺的添加回收率和相对标准偏差(n=6) Table 2 Recoveries of melamine and creatinine in a milk sample (n=6) Compound Added/(mg/kg) Recovery range/% RSD/% Melamine 0.1 77.6-107.5 8.5 1.0 90.7-98.2 7.2 5.0 91.1-101.4 5.0 Creatinine 10 80.7-116.8 9.4 40 86.4-107.5 6.5 100 90.9-106.0 4.3

表 2 鲜乳中肌酐与三聚氰胺的添加回收率和相对标准偏差(n=6) Table 2 Recoveries of melamine and creatinine in a milk sample (n=6)

图3为加标鲜乳样品的GC-MS/SIM谱图。可以看出，通过提取、净化及衍生后，谱图中的杂质峰很少，对目标物无干扰。以本方法对部分市售乳制品样品进行检测，均检出肌酐而未检出三聚氰胺。正常乳制品中肌酐的含量在18～257 mg/kg 之间。所检测的样品中，8个品牌的23种乳粉中肌酐含量为164～257 mg/kg, 2个品牌5种鲜奶中肌酐含量为27～70 mg/kg, 2个品牌6种酸奶中肌酐含量为18～26 mg/kg, 22种含乳饮料、巧克力等其他含乳制品中肌酐含量为1.3～23 mg/kg。对一份曾经检出三聚氰胺的乳粉样品(三聚氰胺已降解)进行检测，肌酐含量高达506 mg/kg。

图3

Fig. 3

图 3 鲜乳样品的GC-MS/SIM谱图 Fig. 3 GC-MS chromatogram of a milk sample in SIM mode 1. creatinine silylative; 2. melamine silylative.