准确称取0.3 g人血液,置于10 mL离心管中,依次加入40 μ L质量浓度为40 μ g/mL 的C_{23 ∶ 0}内标液、1.5 mL蒸馏水、400 μ L含有0.05%抗氧化剂(BHT)的甲醇溶液、2 mL氯仿,振荡均匀,以 2500 r/min 的转速离心10 min,取氯仿层。重复以上提取过程,合并氯仿层至20 mL顶空进样瓶中,氮气吹干备用。

在氮气保护下向上述吹干的顶空进样瓶中加入200 μ L AMP,充满氮气后密封。在210 ℃的恒温油浴中反应75 min后冷却至室温,加二氯甲烷定容至1 mL。样品经0.22 μ m滤膜过滤后用GC-MS/MS分析检测。

标准储备液:取DHA标准品12.5 mg(精确至0.1 mg)于50 mL棕色容量瓶中,加入BHT 25 mg,用甲醇溶解并定容至刻度,配成250 μ g/mL 的标准储备液,放于-20 ℃冰箱中备用。

标准溶液:分别取7、10、50、100、300、600、1000 μ L的标准储备液,用甲醇定容至25 mL,各加入40 μ L质量浓度为40 μ g/mL 的C_{23 ∶ 0}内标液,配成0.07、0.1、0.5、1、3、6、10 μ g/mL 的系列标准溶液。

Agilent HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m);进样口温度为300 ℃,不分流进样,进样量为1 μ L;柱流量为1.0 mL/min。柱升温程序:起始柱温180 ℃,保持1 min;以10 ℃/min 升温至255 ℃,保持14 min;再以15 ℃/min 升温至300 ℃,保持4 min。辅助加热器温度280 ℃。

离子源:EI源;电离能量:70 eV;离子源温度:250 ℃;溶剂延迟时间:6 min;碰撞气:氦气(2.25 mL/min),氮气(1.5 mL/min), MRM模式下的质谱条件见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 DHA杂环衍生物(DHA-H)和内标C23 ∶ 0杂环衍生物 (C23 ∶ 0-H)的MRM质谱检测条件 Table 1 MS parameters for DHA and internal standard C23 ∶ 0 heterocyclic derivatives Compound Parent ion (m/z) Product ion (m/z) Collision energy/eV DHA-H 152 98* 15 152 55 20 C23 ∶ 0-H 126 72 15 126 55* 20 *Quantitative ion.

表1 DHA杂环衍生物(DHA-H)和内标C23 ∶ 0杂环衍生物 (C23 ∶ 0-H)的MRM质谱检测条件 Table 1 MS parameters for DHA and internal standard C23 ∶ 0 heterocyclic derivatives

人血液中的脂肪酸多以偶数碳脂肪酸存在,因此选择奇数碳脂肪酸为内标。C_{23 ∶ 0}与DHA均可发生杂环衍生化反应,并且与血液中其他脂肪酸衍生化产物可很好地分离,因此选择C_{23 ∶ 0}作为内标物。

远端化学修饰的反应多采用回流法或分流催化法。本实验属微量高温反应,且DHA极易被氧化,需在氮气保护下反应,因此不宜采用上述方法。经过多次尝试,本文采用密闭高温反应方式,简化了操作步骤,提高了反应效率和准确性。

为避免甲醇与DHA发生副反应,杂环衍生化反应前,需氮气吹干DHA和C_{23 ∶ 0}甲醇溶液中的甲醇溶剂,然后加入AMP,充满氮气后密封反应瓶。由于反应需要密闭、高温,因此选择惰性高温的溶剂。曾尝试用二甲基亚砜(DMSO)作为反应溶剂,但是DMSO的保留时间介于DHA杂环衍生物(DHA-H)和内标C_{23 ∶ 0}杂环衍生物(C_{23 ∶ 0}-H)两产物峰之间,干扰定量。经反复试验发现,过量的AMP在高温下可形成气体环境,无需另加溶剂即可与DHA充分反应,且副反应少,可准确定量。

反应温度低于140 ℃时,杂环反应存在副反应,会产生少量非完全环化的N-酰基中间体;而温度高于220 ℃,油浴不容易准确控温,因此选择在155～220 ℃做温度曲线。结果显示,随着温度的升高,DHA-H的峰面积增加,即产率增加(见图2),因此本文选择210 ℃作为反应温度。

图2

Fig. 2

图2 温度对反应的影响 Fig.2 Effect of temperature on the reaction

DHA是热不稳定性物质,高温反应时间不宜过长。通过比较180、190、210 ℃下的反应时间曲线,发现不同温度下的最佳反应时间分别是120、100和75 min,如图3所示。温度越高,最佳反应时间越短,为提高效率,本文选择在210 ℃下反应75 min作为最佳反应条件。

图3

Fig. 3

图3 时间对反应的影响 Fig.3 Effect of time on the reaction

将配制好的标准溶液按1.2.2节所述方法进行杂环衍生化后, 用GC-MS/MS测定。结果显示:以峰面积为Y,质量浓度为X ( μ g/mL),线性方程为Y=0.2283X-0.0465, r²=0.9991,DHA在0.07～10 μ g/mL 范围内线性关系良好;方法的检出限(S/N=2.8)为0.02 μ g/mL,定量限(S/N=10)为0.07 μ g/mL。可以满足人血液样品的分析要求。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 方法的回收率和精密度(n=6) Table 2 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of this method (n=6) Background/ μ g Added/ μ g Found/ μ g Recovery/% RSD/% 0.658 0.5 1.130 94.40 2.91 1.127 1.5 2.674 103.13 3.16 0.504 2.5 2.926 96.88 1.51

表2 方法的回收率和精密度(n=6) Table 2 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of this method (n=6)

采用人血液样品为基质进行回收率和精密度试验。在样品中添加高、中、低3个不同水平的标准溶液,每个添加水平平行测定6次,计算平均回收率及相对标准偏差(RSD)。结果(见表2)显示:平均回 收率为94.40% ～103.13% , RSD为1.51% ～3.16%, 方法的回收率和精密度均满足要求。

取同一批号人血液样品6份,按本文方法制备6份供试品溶液,检测其中DHA含量。检测结果的RSD(n=6)为3.22% ,表明该方法重复性较好。将其中3份样品放置于-20 ℃、另3份样品放置于室温(20 ℃)条件下，经过24 h后,再分别测定两组样品中DHA浓度。在-20 ℃下保存的样品,检测结果的RSD为0.08% ～2.42% ;在室温下保存的样品,检测结果的RSD为0.04% ～4.63% 。结果显示:产物稳定性良好。