色谱柱:Acquity UPLC HSS T3 (50 mm×2.1 mm, 1.8 μ m);流动相A为10 mmol/L 乙酸铵水溶液,流动相B为乙腈。梯度洗脱程序:0～1.0 min, 90%A; 1.0～2.0 min, 90%A～10%A; 2.0～4.0 min, 10%A; 4.0～4.1 min, 10%A～90%A; 4.1～6.0 min, 90%A。流速为0.3 mL/min;柱温为35 ℃;进样体积为10.0 μ L。

电喷雾离子源,正、负离子模式(ESI^±);检测方式:多反应监测(MRM);监测离子对、锥孔电压和碰撞能量等参数见表1。

表 1 DCD、MEL和CY的多反应监测扫描模式的质谱参数 Table 1 MS parameters in multiple reaction monitoring (MRM) mode for DCD, MEL and CY Analyte Precursor ion(m/z) Daughter ion(m/z) Cone voltage/V Collision energy/eV DCD 85 43 25 10 68* 12 MEL 126.8 67.8 36 22 84.8* 16 CY 128 42* 24 12 85 10 * quantitative ion.

表 1 DCD、MEL和CY的多反应监测扫描模式的质谱参数 Table 1 MS parameters in multiple reaction monitoring (MRM) mode for DCD, MEL and CY

称取5.00 g牛奶样品于50 mL离心管中(奶粉样品称取2.00 g,用3 mL水溶解,混匀);加入5 mL 5%(质量分数)三氯乙酸水溶液,充分旋涡混匀,超声提取30 min,取上清液至1.5 mL尖底塑料离心管,14000 r/min 高速离心15 min;取上清液过0.2 μ m微孔滤膜,滤液供UPLC-Xevo TQ MS分析。

二聚二胺和三聚氰胺为碱性化合物,根据溶液化学原理,易解离电子形成正离子;三聚氰酸为酸性化合物,易解离质子形成负离子。因此本方法采用正离子和负离子电离模式同时扫描实现二聚二胺、三聚氰胺和三聚氰酸的同时测定。常见的文献报道中,ESI^±电离同步检测多采用分段采集的方式,其方法要求在液相色谱分离时必须将正、负电离性质不同的组分的保留时间分离较远,才能实现质谱分段采集,这样往往会造成检测时间的增加及灵敏度的下降。本文利用Xevo TQ MS正、负电离模式切换时间短、灵敏度高的优势,用MRM双通道分别进行电喷雾正、负电离扫描,无需分段分离,在同一出峰时间即可实现二氰二胺、三聚氰胺和三聚氰酸的同时采集。图2所示为二聚二胺、三聚氰胺、三聚氰酸在正、负离子电离模式下同时扫描的MRM色谱图。

图2

Fig. 2

图 2 DCD、MEL和CY在正、负离子电离模式下的MR色谱图(20 μ g/L) Fig. 2 MRM chromatograms of DCD, MEL and CY under ESI±mode (20 μ g/L)

虽然电喷雾模式切换速度可达到0.02 s,但反吹气流量、雾化温度等常规调谐参数在正、负模式切换之间有延时。为避免参数延时响应从而影响质谱采集的灵敏度,实验需将正、负两个模式下的调谐条件设为一致。以雾化温度为例,三氯乙酸沸点为197.5 ℃,本实验在正、负模式下均选取400 ℃雾化气温度进行雾化。各项调谐参数设置见表2。

表 2 DCD、MEL和CY在MRM模式下的质谱调谐参数 Table 2 MS tune parameters in MRM mode for DCD, MEL and CY Capillary/kV Extractor/V Source temperature/℃ Desolvation temperature/℃ Cone gas flow/(L/h) 3.5 3.00 150 400 50 Desolvation gas flow/(L/h) LM1 resolution HM1 resolution LM2 resolution HM2 resolution 800 2.69 14.5 2.69 14.5

表 2 DCD、MEL和CY在MRM模式下的质谱调谐参数 Table 2 MS tune parameters in MRM mode for DCD, MEL and CY

由于本实验进行MRM双通道正、负模式电离的同时扫描,极大地降低了对液相色谱分离的要求,无需考虑二氰二胺、三聚氰胺和三聚氰酸的分段分离,只需要考虑样品中待测物质与杂质峰的分离。牛奶和奶粉基质复杂,蛋白质和维生素等其他成分较多,色谱分离时应充分考虑到此类杂质峰对检测结果的影响。赵善贞等^{[ 13 ]}、王祖翔等^{[ 9 ]}曾分别使用HILIC色谱柱对三聚氰胺和三聚氰酸、二氰二胺和尿素等进行分离;本文作者也应用HILIC色谱柱实现了二氰二胺、三聚氰胺和三聚氰酸的标准溶液分离测定,但在实测样品中发现,随着检测样品量的增加(约200个样品之后),三聚氰胺的峰形不够稳定,保留时间逐渐向前漂移。

T3键合技术采用三键C18烷基键合,配基密度低,可以提高极性化合物的保留并与水相流动相兼容;同时,T3技术还包括比传统三甲基氯硅烷(TMS)更有效的端基封尾过程。独特的键合与封尾技术确保HSS T3色谱柱针对二氰二胺等极性有机小分子有很好的保留,实现在反相UPLC条件下保留和分离水溶性的极性有机小分子,其原理仍是亲水色谱作用,同时具备HSS高强度硅胶填料可与100%水性流动相兼容不塌陷的特性。本课题在前期工作中曾用HSS T3色谱柱实现了对三聚氰酸与乳粉中杂质的分离^{[ 11 ]},现将其应用于二氰二胺、三聚氰胺和三聚氰酸的分离检测中,并重点观察了检测100、200个样品后三聚氰胺标准液的出峰时间与重现性。实验结果显示:Acquity UPLC HSS T3(50 mm×2.1 mm, 1.8 μ m)可以实现二氰二胺、三聚氰胺和三聚氰酸与牛奶、奶粉中杂质的分离,且在大量实测样品之后,三聚氰胺的保留时间仍很稳定。图3为实测100、200个样品之后,三聚氰胺在不同色谱柱上的保留时间及峰形。

图3

Fig. 3

图 3 实测(a) 100、(b) 200个样品之后三聚氰胺在和HSS T3色谱柱上的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of melamine on HILIC and HSS T3 columns after detection of (a) 100 and (b) 200 samples

二氰二胺、三聚氰胺和三聚氰酸均属于极性化合物,在甲醇、乙腈等纯有机溶剂中溶解度较小,而在水中溶解度较大,因此提取溶剂一般都选用稀酸溶液、有机溶剂-水的混合溶液、极性较强的有机溶剂或缓冲溶液。文献报道中二氰二胺、三聚氰胺和三聚氰酸检测的前处理分为两种思路:固相萃取法^{[ 12, 13 ]}和乙腈-水体系提取法^{[ 8, 9 ]}。单纯的阴阳离子固相萃取很难实现3种组分的同步净化,且操作复杂,耗费时间较长,不适用于大量样品检测;王祖翔等^{[ 9 ]}报道的方法中未包含三聚氰胺和三聚氰酸,且提取后的溶液不是纯有机相,而是乙腈-水混合溶剂,氮气吹干需要耗时太久,且容易在较长的吹干过程中损失待测物质;MacMahon等^{[ 8 ]}的方法是唯一一种同时处理二氰二胺、三聚氰胺和三聚氰酸3个组分的方法,但方法采用甲酸、乙腈双重稀释提取,且稀释倍数过大。本实验在前期工作的基础上^{[ 11 ]},仍采用三氯乙酸提取样品,无需固相萃取净化,利用三氯乙酸对极性小分子的高提取率和沉淀蛋白作用,辅以高速离心,实现对牛奶、奶粉样品的提取和净化。该方法快速简便,极易操作,稀释倍数在牛奶中为2,奶粉中为5,兼顾了定量要求。图4是奶粉中的二氰二胺、三聚氰胺和三聚氰酸经提取净化后的色谱图。

图4

Fig. 4

图 4 奶粉中添加DCD、MEL和CY的MRM色谱图 Fig. 4 MRM chromatograms of blank milk powder spiked with DCD, MEL and CY

实验发现,乳及乳制品中的二氰二胺、三聚氰胺和三聚氰酸测定过程中样品的基质干扰非常明显。取空白样品按1.4节进行前处理,以此基质提取液作稀释液配制混合标准溶液,与直接用5%三氯乙酸溶液配制的标准溶液对比,发现基质抑制效率约为10倍。为扣除此基质效应,本实验采用空白样品配制基质标准曲线。分别取不同基质的空白样品进行前处理,以此基质提取液作稀释液配制混合标准曲线,以定量离子的峰面积对质量浓度进行线性回归计算,在5.0～200.0 μ g/L 范围内线性关系良好(r≥0.995)。在空白样品中添加不同浓度的二氰二胺、三聚氰胺和三聚氰酸,前处理后按浓度由高至低检测,直到获得信噪比等于10(S/N=10)的浓度,确定其为定量限(LOQ)。本实验中,牛奶中3种化合物的定量限为0.02 mg/kg,奶粉中3种化合物的定量限为0.05 mg/kg。

用空白牛奶、奶粉试样进行添加回收率和精密 度试验。牛奶样品中添加水平为0.02、0.1、0.2mg/kg,奶粉样品中添加水平为0.05、0.1、0.2 mg/kg,混合后静置,使标准溶液被样品充分吸收,然后按照本方法测定,每个添加水平测定6次,计算加标回收率和相对标准偏差(RSD),结果见表3。

表 3 牛奶和奶粉中DCD、MEL和CY的加标回收率和相对标准偏差 (n=6) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of DCD, MEL and CY in milk and milk powder (n=6) Analyte Milk Milk powder Spiked/(mg/kg) Recovery/% RSD/% Spiked/(mg/kg) Recovery/% RSD/% DCD 0.02 70.0-86.0 8.2 0.05 80.0-86.0 3.6 0.10 73.0-88.0 13.6 0.10 78.3-114.0 6.3 0.20 84.3-88.5 12.6 0.20 84.7-108.5 4.6 MEL 0.02 81.2-105.8 5.7 0.05 78.0-96.0 3.2 0.10 91.7-99.6 4.2 0.10 78.9-112.5 7.5 0.20 88.0-94.8 2.5 0.20 84.3-115.0 6.6 CY 0.02 60.0-86.0 9.4 0.05 80.0-96.0 2.7 0.10 73.0-98.0 13.3 0.10 83.0-104.0 4.3 0.20 84.3-103.5 11.1 0.20 84.3-111.5 5.6

表 3 牛奶和奶粉中DCD、MEL和CY的加标回收率和相对标准偏差 (n=6) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of DCD, MEL and CY in milk and milk powder (n=6)

将建立的方法应用于200份实际乳制品产品(10份牛奶、190份婴儿配方奶粉)的检测,检出11份奶粉含有二氰二胺0.1～0.6 mg/kg,其他样品均未检出这3种化合物。