色谱  2013, Vol. 31 Issue (10): 946-953   PDF (926KB)    
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李玮
艾连峰
郭春海
马育松
窦彩云
高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛奶和奶粉中的青霉素类药物及其主要酶解代谢产物
李玮 , 艾连峰, 郭春海, 马育松, 窦彩云    
河北出入境检验检疫局, 河北 石家庄 050051
收稿日期：2013-03-06
基金项目：国家质检总局科技基金项目(2010IK126).
通讯作者：李玮.E-mail:liwei.305@163.com.
摘要：建立了液相色谱-串联质谱法同时测定牛奶和奶粉中4种青霉素(青霉素G、青霉素V、阿莫西林、氨苄西林)及其4种 β-内酰胺酶酶解产物(青霉素G脱羧噻唑酸、青霉素V脱羧噻唑酸、阿莫西林脱羧噻唑酸、氨苄西林脱羧噻唑酸)残留的方法。样品采用乙腈-水提取,浓缩后经HLB柱净化,用液相色谱-串联质谱检测,外标法定量。结果表明,青霉素原药在4~200 μg/L,酶解产物在10~500 μg/L范围呈良好线性,线性相关系数均大于0.99;样品检出限为5~50 μg/kg(S/N≥3),定量限为8~100 μg/kg(S/N≥10);对牛奶和奶粉样品分别进行3个水平的加标回收实验(n=6),牛奶中青霉素及其酶解产物的平均回收率为83.48%~96.97%,相对标准偏差为3.86%~10.87%;奶粉中青霉素及其酶解产物的平均回收率为82.70%~95.14%,相对标准偏差为3.02%~9.81%。该方法稳定、可靠,适用于牛奶和奶粉中青霉素类药物及其酶解代谢产物的测定。
关键词： 高效液相色谱-串联质谱     青霉素     酶解代谢产物     牛奶     奶粉    
Simultaneous determination of penicillin and their major enzymatic metabolites in milk and milk powder by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
LI Wei , AI Lianfeng, GUO Chunhai, MA Yusong, DOU Caiyun    
Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shijiazhuang 050051, China
Received: 2013-03-06
Abstract: A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) method has been developed for the determination of eight compounds in milk and milk powder. They are four penicillins (penicillin G, penicillin V, amoxicillin and ampicillin) and four major β-lactamase enzymatic metabolites of them (penilloic acid G, penilloic acid V, amoxiilloic acid and ampilloic acid). The compounds were extracted from the samples with acetonitrile and water, cleaned-up by HLB solid-phase extraction cartridges, and then detected by HPLC-MS/MS and quantified by external standard method. The linearities were satisfactory with the correlation coefficients >0.99 at the mass concentrations ranging from 4 μg/L to 200 μg/L for penicillins and from 10 μg/L to 500 μg/L for enzymatic metabolites. The limits of detection and the limits of quantification were 5-50 μg/kg (S/N≥3) and 8-100 μg/kg (S/N≥10), respectively. The average recoveries of the eight compounds were 83.48%-96.97% in milk and 82.70%-95.14% in milk powder. The relative standard deviations (RSDs) in milk and milk powder were 3.86%-10.87% and 3.02%-9.81%, respectively. In conclusion, the established method is convenient, accurate and sensitive so that it can be applied to the determination of penicillin residues and enzymatic metabolites in milk and milk powder.
Key words: high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)     penicillin     enzymatic metabolites     milk     milk powder    

青霉素是目前治疗牛乳腺炎的首选药物,同时也是牛奶中最常见的残留抗生素,这一问题已受到国内外的广泛重视。我国农业部2008年颁布实施了《无公害食品生鲜牛乳行业标准》 (NY/T 5045-2008)明确了对新鲜牛乳的卫生指标即“抗生素不得检出”,欧美国家也已明文禁止抗生素残留超标的牛奶上市。但为谋求私利,不法商贩常使用 β -内酰胺酶将牛乳中的抗生素变为酶解代谢产物从而达到掩蔽青霉素类抗生素的目的[ 1 ]。这类人造“无抗奶”中残留的抗生素及其酶解代谢产物会使人体产生耐药性导致免疫力降低,也会对抗生素过敏个体存在潜在的风险,因此亟须建立抗生素及其酶解代谢产物的检测方法。

目前关于动物源性食品中 β -内酰胺类抗生素的检测方法已有大量报道[ 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ],并已制定相关检测标准(GB/T 22975-2008),但关于其酶解代谢产物的研究较少[ 13 ], De Baere等[ 14 ]利用液相色谱-串联质谱法建立了猪组织中阿莫西林、阿莫西林噻唑酸和阿莫西林二酮哌嗪的检测方法,但使用三氯乙酸沉淀蛋白质的效果较差,对测定的干扰较大;陈聪等[ 15 ]利用超高效液相色谱-串联质谱检测了全血中的青霉素G和青霉噻唑酸、脱羧青霉噻唑酸两种代谢物,但两种代谢物在色谱柱上并未完全分离,在复杂基质中此方法的特异性不高;冯月超等[ 16 ]建立了超高效液相色谱-串联质谱检测牛奶中青霉素G和青霉噻唑酸代谢物的方法,该方法简单、快速,但不适用于多残留分析;刘创基等[ 17, 18 ]建立了超高效液相色谱-串联质谱检测牛奶和牛肉中的羟氨苄青霉素、青霉素G及其5种主要代谢产物(阿莫西林噻唑酸、阿莫西林二酮哌嗪、苄青霉噻唑酸、苄青霉去羧噻唑酸和苄青霉二酸)残留的分析方法。本文研究了牛奶和奶粉中青霉素G、青霉素V、阿莫西林、氨苄西林及其各自的酶解产物青霉素G脱羧噻唑酸、青霉素V脱羧噻唑酸、阿莫西林脱羧噻唑酸、氨苄西林脱羧噻唑酸共8种化合物的检测方法,采用乙腈-水提取液提取目标物,通过固相萃取柱净化,利用高效液相色谱-电喷雾串联质谱法对乳制品中的药物残留情况进行了分析,利用基质匹配标准溶液校准法对其进行定量,方法灵敏、简便、选择性高,适用于乳及乳制品中青霉素类药物及其酶解产物残留的研究。



1 实验部分
1.1 仪器与试剂

TSQ Quantum Ultra AM型高效液相色谱-串联质谱仪,配电喷雾离子源(Thermo,美国); HITACHI离心机(HITACHI,日本); VORTEX-2 GENE涡旋混合器(Scientific,美国); LABOROTA 4000型旋转蒸发器(Heidolph,德国); Turbo Vap型氮气吹干仪(Zymark,美国); Milli-Q超纯水器(Millipore,美国); Oasis HLB固相萃取柱(0.5 g, 6 mL, Waters,美国)。

乙腈、甲醇(色谱纯,Fluka);甲酸、乙酸铵(色谱纯,Dikma);磷酸氢二钠(分析纯); 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲溶液(6 g磷酸氢二钠溶解于500 mL水中)。青霉素G、青霉素V、阿莫西林、氨苄西林均购自Dr. Ehrenstorfer公司,青霉素G脱羧噻唑酸、青霉素V脱羧噻唑酸、阿莫西林脱羧噻唑酸、氨苄西林脱羧噻唑酸由实验室内部制备;实验用水均为Milli-Q高纯水。

1.2 标准物质制备及标准曲线

酶解产物标准物质的制备:称取一定量青霉素原药用水溶解,加入适量 β -内酰胺酶,在最优化酶解条件下酶解完全后,进液相色谱自动纯化系统(Waters 2767型制备色谱+Waters 2489型紫外-可见检测器)纯化,流出液经净化浓缩后真空烘干得到白色粉末,用液相色谱-飞行时间质谱进行扫描,确证白色粉末即为相应青霉素原药的酶解产物,采用液相色谱归一化法检测含量,杂质含量≤0.5% 。

标准储备液的配制:分别称取适量标准品(精确至 0.0001 g),用乙腈-水(1 ∶ 1, v/v)配制成100 mg/L 标准储备液,保存于4 ℃冰箱中;标准工作溶液的配制:根据需要,吸取一定量的标准溶液,用乙腈-水稀释至所需质量浓度。

基质匹配标准曲线:称取不含待测物的牛奶和奶粉,按照1.4节方法操作,得到空白基质溶液。用空白基质溶液稀释标准溶液配制成一系列混合基质标准工作溶液,现用现配。

1.3 仪器条件
1.3.1 色谱条件

Hypersil GOLD C18色谱柱(150 mm×2.1 mm, 5 μ m);流动相:A为0.1%乙酸-1 mmol/L 乙酸铵溶液,B为乙腈;梯度洗脱程序:0～3 min B从5%升到90% , 5～8 min保持B为90% , 8～8.01 min B从90%降至5% , 8.01～10 min保持B为5% ;流速0.2 mL/min,进样量为10 μ L。

1.3.2 质谱条件

离子源:电喷雾电离源(ESI);扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测(MRM)模式;电喷雾电压:3 500 V;干燥气温度:350 ℃;干燥气流量:11 L/min;碰撞气压力:0.2 Pa。优化得到的各分析物在正离子模式下的质谱参数及参考保留时间见表1。

表 1 8种分析物的质谱参数及保留时间 Table 1 MS/MS parameters and retention times of the eight analytes
1.4 样品前处理
1.4.1 提取

液态奶:称取样品5 g(准确至0.01 g)于50 mL具塞离心管中,加入20 mL乙腈-水(4 ∶ 1, v/v)溶液高速涡旋振荡提取2 min,以 3 000 r/min 离心5 min,移取上清液至鸡心瓶中。再用10 mL提取液重复提取1次,合并提取液于同一鸡心瓶中。

奶粉:称取样品1 g(准确至0.01 g)于50 mL具塞离心管中,加入4 mL水,混匀,再加入20 mL乙腈-水(4 ∶ 1, v/v)溶液高速涡旋振荡提取2 min,以 3 000 r/min 离心5 min,移取上清液至鸡心瓶中。再用10 mL提取液重复提取1次,合并提取液于同一鸡心瓶中。

1.4.2 净化

将提取液于45 ℃条件下旋转蒸发至约8 mL左右,加入2 mL 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液,混匀后,转移到HLB固相萃取柱(使用前依次用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL磷酸盐缓冲溶液活化)上,再用2 mL磷酸盐缓冲液洗涤鸡心瓶两次,洗液一并转移到柱上。用3 mL水淋洗并抽干萃取柱,用5 mL乙腈-水(1 ∶ 1, v/v)洗脱并收集于10 mL带刻度的玻璃管中,于40 ℃氮吹仪上吹至约1 mL,用乙腈-水(1 ∶ 1, v/v)定容至2.0 mL,涡旋混合后,过0.22 μ m滤膜,滤液供HPLC-MS/MS测定。

2 结果与讨论
2.1 前处理方法的优化

在已有研究[ 2 ]的基础上,对4种青霉素类药物及其4种酶解代谢产物进行检测方法的考察。试验证明:乙腈具有较好的沉淀蛋白作用,而且方便青霉素G、青霉素V及其酶解产物的提取；适量的水方便阿莫西林、氨苄西林及其酶解产物的提取,所以提取溶剂选择乙腈-水混合溶液体系。比较不同比例的乙腈-水的提取效率,发现乙腈-水的体积比为4 ∶ 1时8种待测物的回收率较高,且蛋白沉淀效果好,因此选择乙腈-水(4 ∶ 1, v/v)作为提取液。

试验初期采用提取液氮气吹干定容后直接进样的检测方式,结果表明：干扰物质较多,谱图背景较高,检出限无法满足国内外需求,而且阿莫西林酶解产物和氨苄西林酶解产物的回收率重现性较差,因此采用固相萃取方法净化。旋蒸后加入2 mL 0.1 mol/L 磷酸盐碱性缓冲液防止待测物降解,净化时采用对碱性物质有较强保留性质的HLB柱,洗脱时比较了乙腈以及不同比例的乙腈-水溶液。结果发现乙腈-水比例为1 ∶ 1时使用5 mL洗脱效果最佳,不会带来较多杂质,也不会消耗太多洗脱溶液而不利于下一步骤的浓缩。

2.2 色谱条件的优化

选择Hypersil GOLD C18色谱柱作为分析柱,对比了甲醇-0.1%乙酸和乙腈-0.1%乙酸两个体系的分离效果,发现乙腈-0.1%乙酸对目标化合物的分离较好。为了提高分离度并改善峰形,考察了在流动相体系中加入乙酸和乙酸铵的比例:固定水相中乙酸的含量,考察添加0.5、1.0、2.0、5.0 mmol/L 乙酸铵对分离度及灵敏度的影响,结果表明随着乙酸铵浓度的增加,灵敏度逐渐降低且背景干扰变大;考察了不同含量的乙酸对结果的影响,结果表明其对灵敏度和峰形的影响不大。本实验选择乙腈-水(含0.1%乙酸和1 mmol/L 乙酸铵)流动相体系。

由于大部分青霉素类药物及其酶解产物在水溶液中以离子状态存在,定容液中水溶液的比例也影响峰形和灵敏度。考察了定容液中乙腈-水的不同比例,发现随着有机相比例的增加峰形变宽或分裂,灵敏度降低,所以用乙腈-水(1 ∶ 1, v/v)溶液定容,此时青霉素原药和酶解产物的灵敏度最高,稳定性最好。

2.3 质谱参数的确定

用针泵连续直接进样(单一标准溶液1 mg/L),选用ESI+离子化模式进行全扫描,得到稳定的[M+H]+准分子离子峰。采用子离子扫描方式进行二级质谱分析,得到碎片离子信息。优化各质谱参数,使准分子离子与特征碎片离子的信号强度达到最高,根据2002/657/EC关于确证法4个确证点的要求,选取丰度较强、干扰较小的两个子离子为定性离子和定量离子(见表1)。

2.4 基质效应

采用标准曲线比较法考察了牛奶和奶粉样品对待测物的基质效应。在本实验所建立的前处理方法与仪器条件下,通过比较一系列相同浓度的标准工作溶液标准曲线与基质溶液标准曲线来确定基质效应是否存在。实验发现,三者线性差别较大(见图1),说明存在基质影响。因此采用基质匹配标准曲线进行定量。

图 1 牛奶、奶粉样品对待测物的基质效应 Fig. 1 Matrix effects of milk and milk powder for the analytes ◆ standard calibration curve; ■ milk matrix-matched calibration curve; ▲ milk powder matrix-matched calibration curve.
2.5 线性范围和检出限

在空白样品提取液中分别添加8种一定量的待测物,使用上述仪器条件测定后,以峰面积对质量浓度作图,得到基质匹配标准曲线。由于青霉素原药及其酶解代谢物的检测灵敏度存在差异,因此对线性浓度点的选择不同,青霉素原药各质量浓度分别为4、8、20、40、80、200 μ g/L,酶解代谢物各质量浓度分别为10、20、50、100、200、500 μ g/L,所得结果见表2。以S/N≥3确定检出限(LOD)为5～50 μ g/kg,以S/N≥10确定定量限(LOQ)为8～100 μ g/kg(见表2)。结果表明,各待测物在所测定的质量范围内线性关系良好,相关系数达到0.99以上。在牛奶和奶粉样品中添加8种待测物,其MRM谱图分别见图2和图3。

表 2 牛奶和奶粉样品中8种待测物的线性方程、相关系数(r)、检出限(LOD)和定量限(LOQ) Table 2 Regression equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the eight analytes in milk and milk powder samples

图 2 牛奶(a)空白样品和(b)加标样品中目标物的MRM谱图 Fig. 2 MRM chromatograms of (a) blank and (b) spiked milk with the eight drugs

图 3 奶粉(a)空白样品和(b)加标样品中目标物的MRM谱图 Fig. 3 MRM chromatograms of (a) blank and (b) spiked milk powder with the eight drugs
2.6 准确度和精密度

选取空白牛奶和奶粉样品,分别添加不同浓度的标准溶液后,按上述前处理方法进行加标回收和精密度试验,其回收率和精密度结果见表3。牛奶的加标回收率在83.48% ～96.97%范围内,相对标准偏差为3.86% ～10.87% ;奶粉的加标回收率在82.70% ～95.14%范围内,相对标准偏差为3.02% ～9.81% ,符合兽药残留分析要求。

表 3 牛奶和奶粉中8种待测物的加标回收率和精密度(n=6) Table 3 Recoveries and RSDs of the eight analytes in milk and milk powder (n=6)
3 结论

本研究应用液相色谱-串联质谱建立了牛奶和奶粉中同时检测4种青霉素及其4种 β -内酰胺酶酶解产物残留的方法。采用乙腈-水提取待测物,Oasis HLB柱净化提取液,液相色谱-串联质谱检测,使8种待测物得到了较好的分离,利用基质匹配标准溶液校准法对其进行定量,实现了对牛奶和奶粉中青霉素原药及其酶解产物残留的定量及确证分析。该方法具有适用性强、简单快速、经济等特点,各项技术指标均能满足日常检测分析的要求,可应用于实际日常检测,为食品安全领域提供重要的技术支持。

参考文献
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