高效液相色谱仪(Agilent 1260,美国Agilent公司),配置紫外检测器;气相色谱-质谱联用仪(GCMS-QP 2010 plus,日本岛津公司);傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICR-MS, Apex Ultra 9.4T,美国Bruker Daltonics公司)。天然维生素E制品由某公司提供; α 、 β 、 γ 、 δ -生育酚对照品购自Sigma公司;芝麻素对照品购自北京寰宇科创科技发展有限公司;正己烷、乙酸乙酯、异丙醇、甲醇均为色谱纯试剂,购自Fisher Scientific公司。

HPLC法由于具有灵敏度高、分离能力强、重复性好等优点成为测定维生素E的首选方法^{[ 12 ]}。应用HPLC法分离维生素E既可采用正相模式也可采用反相模式,两者各有特点。反相HPLC具有色谱柱性能稳定、保留时间恒定和易于平衡等优点,但是无法完全分离维生素E所有的异构体^{[ 13 ]}。与反相HPLC相比,正相HPLC法最大的优势在于能够将维生素E的4种异构体完全分离,因此只有在仅需测定维生素E总量时,才会选用反相HPLC法。

经提取、蒸馏工艺处理食用油脂原料获得的天然维生素E制品含有 α 、 β 、 γ 、 δ 4种形式的异构体,其生理活性存在较大差异,使用正相HPLC法可以测定每种异构体的准确含量,从而获得有效的维生素E含量。本文在优化文献^{[ 14, 15 ]}方法的过程中发现,当采用正己烷-异丙醇(99 ∶ 1, v/v)流动相体系时,Zorbax Sil柱对4种异构体对照品混合物具有良好的分离作用,色谱分离结果如图1所示。应用所建立的上述正相HPLC法分析某批次天然维生素E制品时发现2个未知杂质峰,保留时间分别为8.05 min和9.47 min,其中一种杂质与 δ -生育酚的出峰时间非常接近,相差0.3 min。虽然尝试调整了多种流动相条件,但是该杂质与 δ -生育酚在所使用的硅胶柱上仍然无法获得基线分离。

图1

Fig. 1

图 1 4种异构体对照品的混合溶液的高效液相色谱图 Fig. 1 HPLC chromatogram of a mixture of the four isomers reference materials 1. α -tocopherol; 2. β -tocopherol; 3. γ -tocopherol; 4. δ -tocopherol.

氨基柱是一种特殊的正相色谱柱,通过在高纯硅胶表面键合氨丙基硅烷制备得到。该柱对脂溶性维生素众多异构体常表现出独特的分离能力。本实验选用氨基柱对杂质进行分离,并考察了多种不同配比的正己烷-乙酸乙酯流动相体系对杂质分离效果的影响。结果发现,当流动相比例调整为正己烷(含0.5%异丙醇)-乙酸乙酯(90 ∶ 10, v/v)时,两种杂质在Zorbax-NH₂柱上的保留时间分别为13.84 min与14.83 min,能够与4种生育酚异构体完全分离且互不干扰,见图2。为获取杂质纯品供后续质谱鉴定,采用分析柱对杂质进行少量制备。将维生素E制品浓溶液注入HPLC,经氨基柱分离后,在紫外检测器出口处收集杂质馏分。将收集到的杂质馏分用氮吹除去有机溶剂后即得到杂质固体纯化物。

图2

Fig. 2

图 2 天然维生素E制品中杂质的高效液相色谱图 Fig. 2 HPLC chromatogram of two impurities in the natural vitamin E product 1. α -tocopherol; 2. β -tocopherol; 3. γ -tocopherol; 4. δ -tocopherol; 5. impurity 1; 6. impurity 2.

采用GC-MS分析制备得到的两种杂质纯化物。对DB-5MS柱温条件进行了选择,为了避免低沸点物质的干扰和可能的强极性物质的残留,初始柱温为100 ℃,保持2 min;终温为290 ℃,保持15 min。

图3a、3b所示为两种杂质的总离子流图,由图3可知杂质1与杂质2的保留时间分别为21.58 min与21.70 min;图4a、4b所示为杂质的质谱图,谱图显示两种杂质分子的离子峰均为m/z 354,推测两杂质为一对同分异构体。

图3

Fig. 3

图 3 两种杂质纯化物与芝麻素对照品的总离子流图 Fig. 3 Total ion chromatograms of two pure impurities and sesamin reference material a. impurity 1; b. impurity 2; c. sesamin.

为了验证上述推断,采用高分辨质谱测定两种杂质的精确相对分子质量。以直接进样方式将质子化后的杂质纯化液注入FTICR-MS的ESI源,在正离子模式下扫描得到杂质1与杂质2的[M+Na]⁺峰分别为m/z 377.10260 与m/z 377.10256,经质谱精密质量检索得到杂质的元素组成为C₂₀H₁₈O₆,不饱和度为12。高分辨质谱结果表明两种杂质的相对分子质量相同,确证了GC-MS的推断结果。

为进一步获得杂质的结构信息,对其EI质谱图进行了分析。比较发现两种杂质的质谱图概貌高度吻合,主要碎片离子完全相同,由此判断两种杂质可能为一对立体异构体。利用NIST谱库检索得到与杂质相似度最大的化合物为2,6-二(3,4-亚甲基二氧苯基)-3,7-二氧杂双环 -辛烷,匹配度达到98% 。该物质属于木脂素类化合物,为芝麻的特征性成分,存在立体异构体,俗称芝麻素和表芝麻素^{[ 16 ]}。由GC-MS分析结果结合高分辨质谱数据推测两种杂质分别是芝麻素及其异构体表芝麻素。

采用相同条件对芝麻素对照品进行GC-MS分析以确证杂质的推测结果,结果如图3c、4c所示。由图3b、3c可知芝麻素标准品与杂质2的保留时间一致,图4显示芝麻素标准品和两种杂质的质谱碎片离子结果完全吻合,并且芝麻素标准品与两种杂质的NIST谱库检索结果相同,证实了杂质为芝麻素类物质的推断。

图4

Fig. 4

图 4 两种杂质纯化物与芝麻素对照品的质谱图 Fig. 4 Mass spectra of two pure impurities and sesamin reference material a. impurity 1; b. impurity 2; c. sesamin.

对杂质的主要碎片离子进行了归属分析,其中m/z 65和m/z 77离子属于芳香族化合物特征峰,源自C₆H⁺₅; m/z 103离子源自C₈H⁺₇; m/z 178离子源自C₁₀H₁₀O⁺₃; m/z 203离子源自 [M-C₈H₇O₃]⁺; m/z 161离子源自C₁₀H₉O⁺₂; m/z 149离子源自C₈H₅O⁺₃; m/z 135离子源自C₈H₇O⁺₂; m/z 122离子源自C₇H₅O⁺₂; m/z 232离子源自[M-C₇H₅O₂]⁺。碎片离子可能的形成过程见图5。

图5

Fig. 5

图 5 杂质主要碎片离子可能的形成途径示意图 Fig. 5 Proposed mechanisms for the formation of characteristic ions of the impurity