色谱  2014, Vol. 32 Issue (1): 47-51   PDF (986KB)    
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张勇
薛昆鹏
周安
俞慧敏
李崟
姚立新
赵岳星
谢晓梅
应用C30色谱柱高效液相色谱法同时分析枇杷叶中三萜酸类同分异构体
张勇1 , 薛昆鹏2, 周安1, 俞慧敏1, 李崟2, 姚立新2, 赵岳星2, 谢晓梅1    
1. 安徽中医药大学药学院, 安徽 合肥 230031;
2. 浙江月旭材料科技有限公司, 浙江 金华 321000
收稿日期：2013-8-13
基金项目：安徽省教育厅自然科学基金项目(KJ2013A172)；安徽中医学院自然科学基金项目(2012zr023).
通讯作者：张勇,Tel:(0551)65169230,E-mail: yongzh@163.com
摘要：建立了一种快速、简便测定中药枇杷叶中4种三萜酸成分的液相色谱分析方法。枇杷叶经甲醇提取并定容后，采用C30色谱柱进行分离，以乙腈-水(95：5，v/v)为流动相进行洗脱，流速为1.0 mL/min，于210 nm波长下检测。对不同产地枇杷叶中的山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸4种同分异构体进行了测定和比较。结果表明，该方法分离度好(分离度(R)≥2.2)，精密度高(RSD≤1.1%)，线性关系良好(r≥0.9992)，重现性良好(RSD≤4.4%)，加标回收率范围为95.4%~101.7%(RSD≤4.8%)，满足定量要求。该方法简便、快速，结果可靠，可作为枇杷叶质量评价的方法。
关键词： 高效液相色谱法     C30色谱柱     山楂酸     科罗索酸     齐墩果酸     熊果酸     同分异构体     枇杷叶    
Determination of triterpenoic acid isomers in Eriobotryae folium using high performance liquid chromatography on C30 column
ZHANG Yong1 , XUE Kunpeng2, ZHOU An1, YU Huimin1, LI Yin2, YAO Lixin2, ZHAO Yuexing2, XIE Xiaomei1    
1. School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230031, China;
2. Welch Materials (Zhejiang) Inc., Jinhua 321000, China
Received: 2013-8-13
Abstract: A rapid and easy assay method for four triterpenoic acid isomers in Eriobotryae folium was established. The sample was extracted with methanol, then separated on a C30 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) at 20 ℃ using acetonitrile-water (95:5, v/v) as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min. The target compounds were simultaneously detected at 210 nm, and the injection volume was 10 μ L. The validation was carried out and the resolution (R≥2.2), the precision (RSD≤1.1%), the linearity (r≥0.9992), the repeatability (RSD≤4.4%), and the recovery (range from 95.4% to 101.7%, RSD≤4.8%) were acceptable. The method is reliable for the quantification of the four triterpenoic acid isomers by HPLC on C30 column.
Key words: high performance liquid chromatography (HPLC)     C30 column     maslinic acid     corosolic acid     oleanolic acid     ursolic acid     isomers     Eriobotryae folium    

中药枇杷叶为蔷薇科枇杷属植物枇杷Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.的干燥叶,具有清肺止咳、降逆止呕的功效[ 1 ]。枇杷叶主要的化学成分有三萜类、黄酮类、皂苷类、有机酸类、倍半萜及多糖类等化合物[ 2 ],其中对三萜酸类成分的研究较为成熟。近年来,三萜酸的生物活性及毒性研究结果显示,其具有抗癌、抗炎、促进免疫、保肝、强心等药理作用[ 3, 4, 5 ]。

枇杷叶中的三萜酸类化合物大部分为互为同分异构体的山楂酸和科罗索酸(Mr=472.7)、齐墩果酸和熊果酸(Mr=456.7)(结构式见图1)等成分,这些几何同分异构体的分离较为困难,有的是自身分离较困难,如齐墩果酸与熊果酸的分离;有的是与周围干扰成分分离较困难,如山楂酸与其前一相邻干扰组分的分离。关于这些成分分析的相关文献较多,但都是选择较为复杂的流动相体系[ 6, 7, 8 ]。本文在实验之初对文献[ 6, 7, 8 ]和《中国药典》(一部)(2010版)[ 9 ]中的流动相进行了分析,以《中国药典》采用的甲醇、乙腈与醋酸铵三相混合体系为流动相,在低压四元梯度比例阀下,仪器的基线噪声较大,为避免这个问题就需要事先将流动相混匀,操作较复杂。根据文献[ 10, 11, 12, 13, 14, 15 ]报道的方法,用常规的C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μ m)分离,发现无论选择甲醇-水还是乙腈-水体系作流动相,都要适当添加三乙胺、磷酸或者缓冲盐,并且调节pH和流速才可将齐墩果酸与熊果酸勉强分离,而且这种分离并不稳定,方法的耐用性不好。这对药典中的指标性成分控制造成一定的影响。

目前商品C18色谱柱绝大多数都是使用单官能团硅烷化试剂键合形成的单层键合相(monomeric C18),也有使用双官能团或三官能团硅烷试剂键合形成的多层键合相,也称为聚合型键合相(surface polymerization),如PAH专用柱即采用这种键合技术(polymeric C18)[ 16, 17, 18 ]。由于多层键合相可以形成更为致密的键合层,能更加有效地掩蔽硅胶表面的硅羟基,因此可以使色谱柱在稍宽于单层键合相的pH条件下使用,同时具有更强的溶质保留能力和对强极性物质更小的非特异性吸附,并且能够提供与常规单层键合C18色谱柱不同的选择性。C30色谱柱即使用这种聚合型的键合方式,在硅胶表面形成致密的多层C30烷基链(polymeric C30)。由于C30键合相具有比C18更长的烷基链,有更强的疏水性,因而对非极性溶质的保留能力和分辨率更高,同时对长链的异构体有非常好的分离能力[ 19, 20, 21 ]。基于多层聚合型键合相的优势和C30优异的异构体分离效果,本文利用该键合相建立了一种简便快速的定量分析方法,对枇杷叶中4种三萜酸类异构体成分的含量进行了测定,为枇杷叶的质量控制提供了基础数据。

图 14种三萜酸的结构式 Fig. 1 Chemical structures of the four triterpenic acids
1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Agilent 1290液相色谱仪、Chemstation色谱数据工作站(美国Agilent公司), Milli-Q超纯水制备系统(美国Millipore公司), AG285电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司), KQ-100DB数控超声仪(220 V, 50 Hz)、SF-130C万能粉碎机(吉首市中湘制药机械厂)。

山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸、熊果酸对照品(含量≥98% ,天津中新药业研究中心),枇杷叶药材均购自亳州药材市场,产地分别为安徽合肥、福建莆田、广东梅州、贵州遵义、湖北宜昌、广西贵港、湖南永州、四川自贡、云南曲靖、浙江磐安,经本院周建理教授鉴定为正品。甲醇、乙腈(色谱纯,安徽时联特种溶剂股份有限公司),其余所用试剂均为分析纯。

1.2 对照品溶液的配制

对照品储备液:精密称定山楂酸、科罗索酸、熊果酸、齐墩果酸对照品, 分别制成含山楂酸209 mg/L、科罗索酸208 mg/L、熊果酸434 mg/L、 齐墩果酸382 mg/L 的对照品储备液。

混合对照品溶液:分别量取各储备液适量,加入 甲醇制成含山楂酸69.7 mg/L、科罗索酸69.3 mg/L、 熊果酸76.1 mg/L、齐墩果酸60.3 mg/L 的混合对照品溶液。

1.3 样品前处理

将枇杷叶样品于60 ℃电热鼓风干燥箱中烘至恒重,用高速粉碎机粉碎,过30目筛,置于干燥器中备用。精密称定粉碎后的枇杷叶粉约1 g,置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 mL[ 13 ],密塞,称重,超声处理30 min,放冷;用甲醇补足重量,摇匀,经0.45 μ m有机微孔滤膜过滤,取续滤液供测定。

1.4 色谱条件

色谱柱:月旭Ultimate XB-C30(250 mm×4.6 mm, 5 μ m; Welch Materials Inc.);流动相:乙腈-水(95 ∶ 5, v/v);流速:1.0 mL/min;柱温:20 ℃;进样量:10 μ L;检测波长:210 nm。

图 2 不同固定相色谱柱分离4种三萜酸的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of the four triterpenic acids oncolumns with different stationary phases Mobile phase: acetonitrile-water (95 ∶ 5, v/v); column size: 250 mm×4.6 mm, 5 μ m. Columns: a. Ultimate XB-C30; b. Ultimate XB-PAH; c. Phenomenex Luna-C18; d. Shimpack CLC-C18.
Peaks: 1. maslinic acid; 2. corosolic acid; 3. oleanolic acid; 4. ursolic acid.
2 结果与讨论
2.1 色谱柱的选择

采用HPLC对目标物质进行分析,选择同一规格(250 mm×4.6 mm, 5 μ m)不同固定相的色谱柱:Phenomenex Luna-C18、Shimpack CLC-C18两种单层C18硅烷化键合色谱柱,Ultimate XB-PAH多层C18硅烷化键合色谱柱和Ultimate XB-C30多层C30硅烷化键合色谱柱。结果(见图2及表1)表明,单层C18键合的色谱柱对异构体的分离度都没有多层C18键合的色谱柱好,特别是齐墩果酸与熊果酸无法基线分离；而在多层C18键合的色谱柱上目标峰的峰形不够理想,多层C30键合固定相在不同比例(80 ∶ 20～95 ∶ 5, v/v)的乙腈-水体系流动相中,山楂酸与科罗索酸、齐墩果酸与熊果酸都可以达到基线分离,方法的耐用性较好，因此本文选择Ultimate XB-C30多层C30硅烷化键合色谱柱进行分离。

表1 不同固定相色谱柱分离4种三萜酸的分离度 Table 1 Resolutions of the four triterpenic acids oncolumns with different stationary phases
2.2 流动相条件的选择

以Ultimate XB-C30色谱柱为分离柱,在不同比例的乙腈-水和柱温下测定供试品溶液,发现当乙腈的体积分数高于或低于95% 时,山楂酸与其前一相邻峰的分离度都不理想。而柱温超过20 ℃后,每个峰的分离度都下降。因此选择柱温为20 ℃和乙腈的体积分数为95% ,在该条件下4种三萜酸与干扰成分达到基线分离,可准确定量,得到的分离度数据见表2。

表2 4种三萜酸在不同比例流动相与柱温下的分离度 Table 2 Resolutions of the four triterpenic acids under different compositions of mobile phase and different column temperatures
2.3 方法的精密度、线性范围、检出限和定量限

按本方法分析混合对照品溶液,于同日内测定6次,连续测定5 d,得到山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸峰面积的日内精密度和日间精密度(以峰面积的相对标准偏差(RSD)计);将混合对照品溶液分别进样0.5、1、2、4、6、8、10 μ L测定,以峰面积Y对目标物的进样量X(ng)进行线性回归,得到各化合物的线性回归方程;以3倍信噪比(S/N=3)所对应的质量浓度为检出限(LOD),以S/N=10对应的质量浓度为定量限(LOQ),结果见表3。从表3可看出,各组分在1个数量级范围内呈良好的线性关系,相关系数均大于0.999,日内精密度和日间精密度的RSD值都不超过1.1% 。

表3 4种三萜酸的精密度、线性关系、检出限(S/N=3)和定量限(S/N=10) Table 3 Precisions, linear relationships, limits of detection (LODs, S/N=3) and limits ofquantification (LOQs, S/N=10) of the four triterpenic acids

图 3 不同产地枇杷叶的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of ten Eriobotryae foliumsamples from different habitats Peaks: 1. maslinic acid; 2. corosolic acid; 3. oleanolic acid; 4. ursolic acid.

表4 不同产地枇杷叶中4种三萜酸的含量 Table 4 Contents of the four triterpenoic acids in Eriobotryae folium samples from different habitats
2.4 方法的重复性和稳定性

精密称取同一批湖南永州产枇杷叶1 g,按1.3节的方法制备6份供试品溶液进行测定,山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD分别为2.5% 、4.4% 、4.2% 、3.4% ，表明方法的重复性较好。

重新制备1份供试品溶液,分别室温放置0、1、2、4、8、12 h后进行测定,山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD分别为3.5% 、4.0% 、3.8% 、4.0% ,表明12 h内供试品溶液基本稳定。

2.5 回收率

精密称取湖南永州产枇杷叶粉末0.5 g 6份,分别加入对照品山楂酸1.42 μ g、科罗索酸2.96 μ g、齐墩果酸0.98 μ g和熊果酸3.64 μ g,按建立的方法处理后测定,计算回收率。山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸的平均回收率分别为96.8% 、96.9% 、95.4%和101.7% , RSD分别为3.4% 、4.8% 、4.2%和3.9% 。

2.6 样品测定

按本文建立的方法处理及测定10个不同产地的枇杷叶样品,用标准曲线法分别计算不同产地枇杷叶中各目标物的含量,结果见表4,色谱图见图3。通过对10个不同产地的枇杷叶药材样品的谱图对比发现,熊果酸的含量明显高于其他3种三萜酸,
且不同产地的枇杷叶药材中所含的化学成分及含量有很大的差别。根据《中国药典》(2010版)中对枇杷叶药材中齐墩果酸和熊果酸总含量≥0.7%的要求[ 9 ],本实验中测得的这两种三萜酸的总量,除了广西与贵州产的样品没达到要求外,其他样品都符合《中国药典》要求。

3 结论

《中国药典》(2010年版)收载的多种中药中往往山楂酸、科罗索酸、熊果酸和齐墩果酸共存,如山茱萸和山楂[ 22, 23 ]等。本实验建立的C30-HPLC测定4种三萜酸的方法具有简单、快速、准确的优点,可以为枇杷叶及其他含有三萜酸中药的质量控制提供可靠的测定方法。同时该分离方法可以很方便地应用于质谱及蒸发光散射检测器,为三萜酸的制备色谱分离提供了方法依据。

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