色谱  2014, Vol. 32 Issue (2): 184-188   PDF (854KB)    
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唐圣芸
王远兴
温平威
辛贞
高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定饲料中的N-氨基甲酰-L-谷氨酸
唐圣芸, 王远兴, 温平威, 辛贞    
南昌大学食品科学与技术国家重点实验室, 江西 南昌 330047
收稿日期：2013-9-18
基金项目：南昌大学食品科学与技术国家重点实验室自由探索课题(SKLF-TS-200915).
通讯作者：王远兴,Tel:(0791)88304400,E-mail:yuanxingwang@ncu.edu.cn.
摘要：建立了高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-ESI-MS/MS)测定饲料中N-氨基甲酰-L-谷氨酸(NCG)含量的方法。饲料样品经甲醇提取、混合型强阴离子交换反相固相萃取(PXA)柱净化、HPLC分离后，采用ESI-MS/MS在正离子多反应监测(MRM)模式下进行检测，以碎片离子m/z 148.0和m/z 84.0进行定性，以碎片离子m/z 130.0进行定量。NCG的检出限(S/N >3)为24 μg/kg，定量限(S/N >10)为80 μg/kg，在20~1000 μg/L的质量浓度范围内峰面积与含量的线性关系良好，相关系数为0.9999。对饲料中NCG在80、200、500 mg/kg等3个添加水平下的回收率进行了测定，分别为104.0%、103.5%、95.3%，相对标准偏差分别为7.5%、6.3%、5.8%。结果表明，该方法操作简单，净化效果好，快速，灵敏度和准确度高，符合对饲料样品中NCG检测分析的要求。
关键词： 固相萃取     高效液相色谱-电喷雾串联质谱法     N-氨基甲酰-L-谷氨酸     饲料    
Determination of N-carbamyl-L-glutamic acid in feedstuff by high performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry
TANG Shengyun, WANG Yuanxing, WEN Pingwei, XIN Zhen    
State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China
Received: 2013-9-18
Abstract: A method was developed for the determination of N-carbamyl-L-glutamic acid (NCG) in feedstuff by high performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). The feedstuff samples were extracted with methanol, cleaned-up by a ProElut mixed-mode of strong anion exchange inverse column (PXA). Then the samples were separated with HPLC and detected with MS/MS in multiple reaction monitoring (MRM) mode via positive electrospray ionization (ESI+). The fragment ions of m/z 148.0 and m/z 84.0 were used for qualitative analysis, and m/z 130.0 was selected for quantitative analysis. The limit of detection for NCG was 24 μg/kg (S/N >3), and the limit of quantification was 80 μg/kg (S/N >10). The standard calibration curve was linear over the range of 20-1000 μg/L, and the correlation coefficient was 0.9999. The recoveries of NCG in feedstuff were 104.0%, 103.5%, 95.3%, at the three spiked levels of 80, 200, 500 mg/kg with the relative standard deviations (RSDs) of 7.5%, 6.3% and 5.8%. The results showed that the method is simple, fast, highly sensitive, specific and with good purification effect. It can be applied to the analysis and determination of NCG in feedstuff.
Key words: solid phase extraction (SPE)     high performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS)     N-carbamyl-L-glutamic acid     feedstuff    

N-氨基甲酰-L-谷氨酸(N-carbamyl-L-glutamic acid)简称NCG,是一种性质稳定、安全性高的活性物质[ 1 ]。它是N-乙酰-L-谷氨酸(N-acetyl-L-glutamid acid, NAG)的化学结构类似物[ 2 ],结构式见图1。已有关于NCG在食品动物生产和人类健康方面的深入研究[ 3 ],发现其可广泛用作仔猪饲料添加剂,以替代或部分替代Arg[ 4 ]。Arg是仔猪的必需氨基酸,极易缺乏,在饲料中添加量较大,成本高,且会干扰Trp、Lys和His等其他氨基酸的代谢[ 5 ]。而NCG可作为Arg的代谢激活剂,促进Arg内源合成,从而促进幼龄动物的生长和发育,其所用剂量低且效果显著,同时避免了对其他氨基酸的干扰[ 6 ]。

作为一种潜在的理想饲料添加剂,目前还没有建立对饲料中NCG的检测方法,为符合饲料添加剂安全使用规范和使用剂量,有必要建立一种检测方法。根据NCG的化学结构,可采用核磁共振[ 7, 8 ]和高效液相色谱法[ 9, 10 ]鉴定和检测含量。由于配合饲料中的成分多且基质复杂,本研究小组[ 5 ]前期采用柱前衍生-高效液相色谱法分析NCG时发现基质干扰大,分离度比较差。另外,由于NCG的紫外吸收弱,直接采用紫外检测响应度低,灵敏度低[ 11 ]。高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-ESI-MS/MS)可克服这些不足[ 12, 13 ]。因此,本文采用HPLC-ESI-MS/MS对饲料中的NCG含量进行了测定。

图 1 (a)N-氨基甲酰-L-谷氨酸和(b)N-乙酰-L-谷氨酸的结构式 Fig. 1 Structures of (a) N-carbamyl-L-glutamic acid and (b) N-acetyl-L-glutamic acid
1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Agilent 6430液相色谱-三重四极杆质谱联用仪,配有电喷雾离子源(ESI)(美国Agilent公司);涡轮振荡器(太仓市华利达实验设备有限公司);高速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司);超声提取仪(昆山市超声仪器有限公司);固相萃取仪(广州智真生物科技公司)等。

NCG标准品(纯度98% )购于Sigma公司;分析纯甲醇、三氯甲烷、正己烷、25%(v/v)氨水溶液均由国药集团化学试剂有限公司生产;色谱纯甲酸、甲醇,纯度均大于99.9% ,购自Merck KGaA公司;超纯水由Milli-Q超纯水仪(Millipore公司)制备。色谱柱Unimicro C18(Unimicro Technologies公司);混合型强阴离子交换反相固相萃取柱(ProElut PXA, 60 mg/3 mL)购自北京迪马科技有限公司;50 mL聚丙烯塑料离心管(北京科友佳生物技术有限公司)。

称取NCG标准品5.00 mg于50 mL棕色容量瓶中,用纯水溶解并定容,配制成100 mg/L 的标准储备液,于4 ℃下保存,有效期为1个月。

饲料样品由南昌大学医学院实验动物中心提供。

1.2 样品前处理方法
1.2.1 提取

参考文献[ 14, 15 ]对饲料中目标物的提取方法,依据NCG的理化性质进行改进。准确称取2 g(精确至0.1 mg)粉碎后的饲料样品于50 mL聚丙烯塑料离心管中,加入10 mL甲醇,超声提取15 min(每隔5 min振荡混匀),以 4? 000 r/min 离心10 min,上清液全部转移到另一离心管中。用上述方法对残渣重复提取1次,合并上清液。在合并的上清液中加入400 μ L 5%(v/v)的氨水溶液后,准确移取1 mL,用甲醇定容至50 mL,混匀。准确移取3.0 mL上述溶液,待净化。

1.2.2 净化

依次用3 mL甲醇和3 mL水活化固相萃取小柱(ProElut PXA, 60 mg/3 mL),将3.0 mL待净化上清液转移至固相萃取柱中,再依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗,抽至近干,用5 mL含2%(v/v)甲酸的甲醇溶液洗脱,收集洗脱液。经0.22 μ m滤膜过滤,供上机测定。

1.3 HPLC-MS/MS条件

HPLC条件 色谱柱:Unimicro C18(250 mm×4.6 mm, 5 μ m);流动相:甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液(5 ∶ 95, v/v);柱温:20 ℃;流速:0.6 mL/min;进样量:10 μ L。

质谱条件 电离源:电喷雾离子源(ESI);扫描模式:正离子扫描模式(positive);检测方式:多反应检测(MRM);毛细管电压:4.0 kV;离子源温度:100 ℃;干燥气温度:300 ℃;干燥气流量:11 L/min;雾化气压力:1.03×105 Pa。NCG的检测离子对、碎裂电压(fragmentor)、碰撞能量(collision energy)等质谱参数见表1。

1.4 加标回收试验

准确称取2 g(精确至0.1 mg)饲料样品,添加适量NCG标准溶液,涡旋混匀后静置10 min,按照1.2节所述的前处理方法进行提取和净化后,按照1.3节所述条件进行HPLC-MS/MS检测。为使标准溶液和样品溶液具有相同的基质,使用基质匹配标准曲线定量,根据添加标准品的峰面积计算回收率。

表 1 N-氨基甲酰-L-谷氨酸的质谱检测参数 Table 1 MS parameters for the determination of N-carbamyl-L-glutamic acid
2 结果与讨论
2.1 质谱条件的优化

根据NCG的分子结构特征,在电喷雾正离子模式下对NCG标准溶液进行一级质谱分析(Q1扫描),其一级质谱图见图2;再以m/z 191.0作为母离子,进行二级质谱分析(子离子扫描),得到碎片离子(子离子)信息。然后对NCG二级质谱的源内碎裂电压、碰撞气能量等参数进行了优化,使NCG的母离子和特征碎片离子产生的离子对强度最大且稳定时为佳。再按照二级质谱图提供的碎片离子信息,选择最优离子对进行定性和定量。其优化后质谱参数见表1,二级质谱图见图3。

图 2 N-氨基甲酰-L-谷氨酸的一级质谱图 Fig. 2 MS spectrum of N-carbamyl-L-glutamic acid

图 3 N-氨基甲酰-L-谷氨酸的二级质谱图 Fig. 3 MS/MS spectrum of N-carbamyl-L-glutamic acid

2.2 色谱分离条件的优化

进行HPLC-MS/MS分析时,流动相的选择对色谱分析效果和检测灵敏度都有很大的影响。分别选用甲醇水溶液和乙腈水溶液作为流动相,对比后发现以甲醇水溶液为流动相时分析物的峰形更好,所以选择甲醇水溶液。NCG呈弱酸性,试验发现在流动性中加入少量甲酸可以提高其电喷雾离子化效率,从而提高灵敏度,同时峰形更好。最终确定如1.3节所述的流动相条件,进行等度分析。

2.3 样品前处理条件的优化
2.3.1 提取溶剂的选择

因NCG易溶于水和甲醇中,实验对比了水、甲醇水溶液(1 ∶ 1, v/v)和甲醇作为提取溶剂的效果。发现以水和甲醇水溶液作为提取溶剂时,杂质更多,干扰比较大,且回收率较低;而以甲醇作提取剂时,干扰相对较小,回收率最好。这可能是由于饲料中大多数添加药物呈水溶性,更易溶于水,而不溶于甲醇中。因此,实验最终选择甲醇为提取溶剂。

2.3.2 固相萃取柱的选择

由于饲料中添加了较多药物,成分复杂,使得样品的初提取液中杂质较多,直接测定容易对目标化合物造成干扰。为了提高灵敏度和降低检出限,对样品初提取液进一步净化处理。实验中比较了液-液萃取法和固相萃取法(SPE)两种方法,发现用三氯甲烷和正己烷分别进行液-液萃取时,去除基质效果不明显,回收率也较低,而且萃取时需消耗大量的有机溶剂,不经济且对环境造成污染,而SPE法更具有优势。所以本实验采用SPE法进行纯化富集。

分别使用反相硅胶键合吸附固相萃取柱(ProElut C18, 200 mg/3 mL，北京迪马科技有限公司)、ProElut C18-U柱(200 mg/3 mL，北京迪马科技有限公司)和PXA柱进行净化,比较固相萃取的效果。结果发现,C18柱和C18-U柱对目标化合物的净化效果好,有一定的吸附能力,但其回收率都比较低,分别为37.6%和48.5% ,难以满足要求;而PXA柱的净化效果较好,对目标化合物的吸附能力很强,回收率为95.3% 。故本实验最终采用PXA柱净化。

2.3.3 洗脱条件的选择

由于PXA易吸附阴离子,而NCG为酸性化合物,在样品初提取液中加入适量的氨水溶液可使NCG呈阴离子形态,更易吸附在PXA柱上。用3 mL甲醇活化PXA柱,3 mL 0.1%(v/v)的氨水溶液平衡,上样后依次用3 mL超纯水和3 mL甲醇淋洗,抽干后用5 mL含2%(v/v)甲酸的甲醇溶液洗脱,发现回收率很低。而改用3 mL的纯水进行平衡,发现回收率很理想。分别选择了上样3、4和5 mL作比较,结果发现上样3 mL时的回收率最高,为95.3% ;而上样4 mL和5 mL时回收率不理想,分别为78.9%和65.6% 。可能是由于PXA柱对饲料中的某些药物的吸附能力也比较强,而其吸附容量有限,造成回收率降低,所以选择上样量为3 mL。

2.4 方法的线性范围、标准曲线及定量限

称取阴性饲料样品,按照1.2节所述方法步骤进行操作,制得样品提取液。用样品提取液对标准储备液进行稀释,得到含量分别为20、50、100、200、500、1 000 μ g/L 的基质标准工作液,现配现用。

为了消除基质效应的影响,使用以上基质标准溶液,按照优化后的色谱和质谱条件进样测定,外标法定量。以NCG特征碎片离子的质量浓度为横坐标(X, μ g/L),峰面积为纵坐标(Y),绘制出标准曲线。其相应的线性回归方程为Y=8.192?1X-7.545?9,相关系数(r2)为 0.999?9。结果表明NCG在20～1 000 μ g/L 范围内线性关系良好。在阴性饲料中添加80 μ g/kg 的NCG标准品进行测定,信噪比大于10,因此确定方法的定量限为80 μ g/kg;以信噪比大于3确定检出限为24 μ g/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

准确称取饲料样品,在80、200、500 mg/kg 等3个水平做添加回收试验,每个添加水平做5个平行样品。NCG在饲料中的回收率和相对标准偏差(RSD)见表2, 3个添加水平的回收率在95.3%和104.0%之间,相对标准偏差在5.8%和7.5%之间,满足饲料中NCG的定量分析要求。NCG加标水平为80 μ g/kg 的阴性饲料的多反应监测扫描色谱图见图4。

表 2 不同加标水平下N-氨基甲酰-L-谷氨酸的回收率和RSD(n=5) Table 2 Recoveries and RSDs of N-carbamyl-L-glutamic acid at different spiked levels (n=5)

图 4 阴性加标(80 μ g/kg 的N-氨基甲酰-L-谷氨酸) 饲料的多反应监测色谱图 Fig. 4 MRM chromatogram of a negative feedstuff sample spiked with N-carbamyl-L-glutamic acid at 80 μ g/kg
2.6 方法的应用

运用本文建立的方法,对5份仔猪饲料样品和5份普通猪饲料样品中的NCG进行了检测,最终5份仔猪饲料样品中均检出NCG,平均含量为309.5 mg/kg,而普通猪饲料样品中均未检出NCG。

3 结论

本文根据饲料样品和NCG的特点,采用甲醇超声提取,混合型强阴离子交换反相固相萃取柱净化,利用高效液相色谱-电喷雾串联质谱法在MRM模式下进行定量分析,成功建立了饲料中NCG含量的检测方法。该方法操作简单,所需溶剂少,样品前处理方便迅速、可操作性高,检测速度快,其灵敏度、准确度和精密度均较高,满足饲料中NCG的分析检测要求,完全达到了预期目标,可为日后建立饲料中NCG含量测定的国家标准提供参考。

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