色谱  2014, Vol. 32 Issue (2): 174-178   PDF (864KB)    
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倪张林
汤富彬
屈明华
莫润宏
微波灰化-液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用测定干食用菌中的三价铬和六价铬
倪张林, 汤富彬, 屈明华, 莫润宏    
中国林业科学研究院亚热带林业研究所, 国家林业局经济林产品质量检验检测中心(杭州), 浙江 富阳 311400
收稿日期：2013-9-29
基金项目：国家林业公益性行业科研专项课题(201304705，201204414).
通讯作者：汤富彬,E-mail:tfb22@163.com.
摘要：建立了干食用菌中三价铬(Cr(Ⅲ))和六价铬(Cr(Ⅵ))的液相色谱-电感耦合等离子体质谱(LC-ICP-MS)检测方法。采用微波灰化技术对食用菌样品进行灰化处理，灰化样品用乙二胺四乙酸(EDTA)二钠盐稳定其中的Cr(Ⅲ)，并使其保留在阴离子交换柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)上；用含有60 mmol/L硝酸(pH 9.3)的流动相分离其中的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)，电感耦合等离子体质谱仪测定。标准溶液中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的质量浓度在0.5~50 μg/L范围内呈良好的线性关系，线性回归系数均达到0.9999。食用菌样品中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)不同加入量的平均回收率为78.0%~90.7%，相对标准偏差小于4%(n=6)；定量限均为0.5 μg/L。该方法稳定、可靠、灵敏，可满足干食用菌中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的测定。
关键词： 微波灰化     液相色谱-电感耦合等离子体质谱     三价铬     六价铬     干食用菌    
Determination of trivalent chromium and hexavalent chromium in dried edible fungi by microwave ashing-liquid chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometry
NI Zhanglin, TANG Fubin, QU Minghua, MO Runhong    
Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry; Quality Testing Center for None-wood Forest Products of State Forestry Administration (Hangzhou), Fuyang 311400, China
Received: 2013-9-29
Abstract: An analytical method using liquid chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometry (LC-ICP-MS) for the determination of trivalent chromium (Cr(Ⅲ)) and hexavalent chromium (Cr(Ⅵ)) in dried edible fungi was established. Edible fungi sample was ashed by a microwave ashing system and Na2EDTA was added to the ashing sample to stabilize the Cr(Ⅲ). An anion exchange column (250 mm×4.6 mm, 10 μm) with a 60 mmol/L nitric acid (pH 9.3) solution as mobile phase was used for the separation and using ICP-MS as a detector for the determination of trivalent chromium and hexavalent chromium. The calibration curves were linear in the range of 0.5-50 μg/L and the correlation coefficients were 0.9999 for Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ). The average recoveries of Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ) ranged from 78.0% to 90.7% with the relative standard deviations (RSDs, n=6) less than 4%. The limits of quantification (LOQ) of Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ) were 0.5 μg/L. The method is efficient, reliable and sensitive, and can meet the requirement for the determination of Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ) in dried edible fungi.
Key words: microwave ashing     liquid chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometry (LC-ICP-MS)     trivalent chromium     hexavalent chromium     dried edible fungi    

铬(Cr)在自然界中主要以三价铬(Cr(Ⅲ))和六价铬(Cr(Ⅵ))这两种形态存在。Cr(Ⅲ)可激活胰岛素,参与机体糖、脂肪、蛋白质的代谢,能增强胆固醇的分解和排泄,防止动脉硬化,促进氨基酸的转运和蛋白质的合成,促进人体的生长发育,但较高剂量的Cr(Ⅲ)仍表现出细胞毒性反应,长期的累积毒性还有待于进一步的研究[ 1 ]; Cr(Ⅵ)可以以CrO2-4和Cr2O2-7的形态通过带负电荷的细胞膜,并且促使氧化,从而导致病变发生,具有致癌和诱发基因突变的作用。

植物体对铬的富集能力较弱,我们日常食用的蔬菜水果,其总铬含量一般在0.05 mg/kg 以下[ 2 ],即使是种植在铬污染地区的植物铬含量也处在较低水平[ 3 ]。分析近几年的文献报道[ 4, 5 ],我们发现:食用菌中铬含量处在较高水平[ 5 ],但是针对食用菌中铬形态的研究却未见报道。因此,为了对食用菌中铬的营养与安全做出正确的评价,分别测定其中的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)十分有必要。

目前国内外测定铬形态的分析方法主要有原子吸收光谱法[ 6, 7, 8 ]、分光光度法[ 9, 10 ]、离子色谱法(IC)[ 11 ]、离子色谱与电感耦合等离子体质谱联用法(IC-ICP-MS)[ 12 ]和高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱联用法(HPLC-ICP-MS)[ 13, 14, 15, 16, 17 ]等。这些方法在测定水质、尿样和牛奶等液体样品中已有一些应用,尤其是HPLC-ICP-MS方法,其采用乙二胺四乙酸(EDTA)与Cr(Ⅲ)配合形成稳定的Cr(Ⅲ)-EDTA,使Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)能够在不同类型的色谱柱上实现分离,并且可保证Cr(Ⅲ)在碱性环境下的稳定性[ 13 ];但是针对生物质固体样品,采用传统的前处理方法如浸提、搅拌和超声提取等方法进行样品前处理,提取效率低,同时在提取过程中,铬形态的稳定性得不到保证。本实验以日常食用量较大的干食用菌为例,采用微波灰化技术,通过高温消除食用菌样品中的有机物,在这个过程中同时能保证样品中原有的铬形态不发生变化,灰化后的样品用EDTA溶液配合形成Cr(Ⅲ)-EDTA稳定其中的Cr(Ⅲ),通过优化后的HPLC-ICP-MS方法测定其中的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Flexar Binary液相泵(美国PerkinElmer公司); NexIon 300D ICP-MS(美国PerkinElmer公司); PHOENIX微波灰化系统(美国CEM公司); Milli-Q超纯水系统(美国MILLIPORE公司)。50 mL石英坩埚以及其他器皿用酸(30%硝酸)浸泡24 h后,用超纯水冲洗晾干备用。

硝酸,优级纯,德国Merck公司;氨水,优级纯,德国CNW公司;EDTA二钠盐,分析纯,广东西陇化工有限公司;Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)形态标准溶液,1 000 mg/L,美国Sigma-Aldrich公司;质谱调谐液,PerkinElmer公司。

1.2 样品前处理

干食用菌样品采用旋风磨粉碎，过40目筛，称取过筛样品0.2 g(精确至 0.000?1 g)于石英烧杯中,放入微波灰化炉中,设定程序为:10 min升至300 ℃,保持30 min, 10 min升至600 ℃,保持2 h;运行完毕冷却后取出样品,用10 mL 1%硝酸少量多次将样品洗入50 mL离心管中,再用0.5 mmol/L EDTA二钠溶液反复洗涤至离心管中,用氨水(1 ∶ 1, v/v)调节pH值为6,定容至50 mL;将定容好的样品放置在60 ℃的水浴中静置60 min,使EDTA与Cr(Ⅲ)充分配合,取出冷却后上机备用,同时做样品空白和加标回收试验。

1.3 标准溶液的配制

用0.5 mmol/L EDTA二钠(pH 6)稀释Cr(Ⅲ) 和Cr(Ⅵ)标准溶液至1 mg/L,然后置于水浴中于60 ℃下保持60 min,取出冷却后作为标准储备液。标准使用液现配现用。

1.4 仪器条件
1.4.1 色谱条件

Hamilton PRP-X100阴离子交换柱(250 mm×4.6 mm,10 μ m),流动相为60 mmol/L 硝酸(pH 9.3,氨水调节),流速为1.0 mL/min,进样量为20 μ L。

1.4.2 ICP-MS条件

射频(RF)功率:1 500 W;等离子气(Ar)流速:13 L/min;反应气(O2)流速:0.4 mL/min; Rpq(Rejection parameter q)值:0.55;雾化气流速:1.12 L/min。

2 结果与讨论
2.1 灰化条件的选择

传统的马弗炉灰化方法是在样品进入马弗炉之前需要对其进行炭化,操作繁琐并且增加样品被污染的可能性。微波灰化可省去炭化过程,并且炉温冷却迅速,节省了样品前处理时间,因此本实验采用微波灰化对食用菌样品进行前处理;另外,较大的称样量会延长灰化时间,同时也会增加样品溶液中盐分含量,对色谱柱产生不利;综合考虑,选择称样量为0.2 g进行灰化实验。

Cr属于高温元素,为了在较短的灰化时间内得到较好的灰化效果,考察了400 ℃至900 ℃下的灰化效果。结果发现,在低于600 ℃条件下不能将样品较好地灰化,灰分中有较多的黑色炭颗粒;当温度在600～900 ℃时,灰化后的样品都呈白色,灰化效果较好。为了缩短灰化炉的冷却时间,选择灰化温度为600 ℃。

为了验证Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)在灰化过程中是否会发生相互转化,于空白样品中分别加入10 μ g/L 的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ),通过灰化前处理后上机测试其加标回收率,结果表明:单独进行Cr(Ⅲ)加标回收试验时,Cr(Ⅵ)未检出;单独进行Cr(Ⅵ)加标回收试验时,Cr(Ⅲ)也未检出;Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的加标回收率均达到了85%以上,这说明在灰化过程中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)并未出现相互转化,这与文献报道的结论[ 8, 18 ]相符合。

2.2 Cr(Ⅲ)-EDTA配合温度的选择

用0.5 mmol/L EDTA二钠溶液(pH 6)配制10 μ g/L 的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)标准溶液,分别置于40、50、60、70、80和90 ℃的水浴中90 min,考察不同温度下标准溶液中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的稳定性。结果表明,随着温度的升高,Cr(Ⅵ)的响应信号无明显变化,而Cr(Ⅲ)在大于80 ℃时响应信号下降明显(见图1)。综合考虑选择60 ℃作为Cr(Ⅲ)-EDTA的配合温度。

图 1 配合温度对Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)稳定性的影响 Fig. 1 Influences of stabilities of Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ) at different complexation temperatures

2.3 Cr(Ⅲ)-EDTA配合时间的选择

用0.5 mmol/L EDTA二钠溶液(pH 6)配制10 μ g/L 的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)标准溶液,分别置于60 ℃水浴中10、20、30、60、90和120 min,考察不同温度下标准溶液中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的稳定性。结果表明,随着配合时间的延长,整个过程中Cr(Ⅵ)响应信号无明显变化,而Cr(Ⅲ)在大于60 min时响应信号才趋于稳定(见图2),表明此时Cr(Ⅲ)与EDTA已完全配合,因此选择60 min作为Cr(Ⅲ)-EDTA的配合时间。

图 2 配合时间对Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)稳定性的影响 Fig. 2 Influences of stabilities of Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ) at different complexation times

2.4 仪器条件的选择
2.4.1 色谱柱及流动相的选择

文献[ 13, 14, 15, 16, 17 ]报道C18、C8硅胶柱和阴离子色谱柱均可实现Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的分离,但使用C18、C8硅胶柱分离时流动相中需要加入离子对试剂,对色谱柱损伤较大;而阴离子色谱柱应用广泛,耐受性强,因此本实验采用阴离子色谱柱分离Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)。

流动相采用60 mmol/L 硝酸(pH 9.3)。加大流动相浓度可加快这两种物质的出峰时间,当流动相浓度大于60 mmol/L 时导致Cr(Ⅲ)-EDTA和Cr(Ⅵ)的保留时间重叠;另外,过高的pH值也会导致保留时间重叠,过低的pH值易导致Cr(Ⅲ)-EDTA出峰时间延长。

2.4.2 质谱干扰的消除

铬元素在自然条件下有6种同位素,丰度最大的为52Cr(丰度83.8% ),但52Cr受质谱干扰严重。实验中发现:采用标准模式(STD)测试,52Cr信号完全被噪声信号湮没,为了得到理想的灵敏度,实验加入NH3作为反应气,在动态反应(DRC)模式下使NH3与干扰物反应形成其他质量数的物质,从而避免质谱干扰。通过仪器优化后,当NH3的流量为0.4 mL/min、Rpq值为0.55时,52Cr的响应值最大,同时背景干扰最低。图3为加入NH3后,检测52Cr得到的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的色谱图。

图 3 Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)标准溶液(10 μ g/L)的色谱图 Fig. 3 Chromatogram of Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ) standard solution (10 μ g/L)

2.5 线性关系

取适量的标准储备液用流动相配制不同浓度的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)混合标准溶液,在优化的条件下进行检测,确定Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的线性范围、回归方程以及相关系数(r2);按信噪比(S/N)为3及S/N=10分别计算其检出限(LOD)和定量限(LOQ)(见表1)。结果显示:在0.5～100 μ g/L 范围内,目标物的峰面积(Y)与其质量浓度(X, μ g/L)的线性关系良好,r2均达到 0.999?9 以上。

表 1 Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的线性方程、相关系数(r2)、 线性范围、检出限与定量限 Table 1 Regression equations, correlation coefficients (r2), detection limits (LODs) and quantification limits (LOQs) of Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ)
2.6 方法的回收率与精密度

选用干香菇(mushroom)和干木耳(agaric)做 加标回收试验。分别在样品中添加Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)混合标准溶液,添加水平分别为1倍LOQ(0.5 μ g/L)、10倍LOQ(5 μ g/L)和50倍LOQ(25 μ g/L),按优化后的方法对样品进行前处理和测定,计算平均回收率,结果见表2。由表2可知:Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的平均回收率范围分别为78.0% ～90.7%和78.3% ～86.4% , RSD分别为1.5% ～3.8%和1.9% ～3.5% ,可满足干食用菌中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的检测需求和安全评价。

2.7 实际样品测定

随机从市场上抽取6份干食用菌样品进行测试,其中5份样品中Cr(Ⅲ)含量在0.083～0.38 mg/kg 之间,均未检出Cr(Ⅵ); 1份野生牛肝菌(bolete)样品中Cr(Ⅲ)含量为2.13 mg/kg, Cr(Ⅵ)含量为0.23 mg/kg,其色谱图见图4。

图 4 牛肝菌样品及其添加5 μ g/L Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ) 标准溶液的色谱图 Fig. 4 Chromatograms of a bolete sample and the bolete sample spiked with Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ) solution at 5 μ g/L

表 2 干食用菌中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的加标回收率与相对标准偏差(n=6) Table 2 Recoveries and RSDs of Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ) spiked in dried edible fungi samples (n=6)
3 结论

本文建立了微波灰化-液相色谱-电感耦合等离子体质谱(LC-ICP-MS)检测干食用菌中三价铬和六价铬的方法。考察了Cr(Ⅲ)-EDTA配合温度和配合时间对Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)测定的影响,结果表明,当配合温度在60 ℃、配合时间为60 min时,Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的响应信号稳定。通过优化色谱条件和质谱条件,能够实现Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的较好分离,同时消除其他近质量数的质谱干扰。该方法稳定、可靠、灵敏,可满足干食用菌中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的测定。

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