Manuka蜂蜜是新西兰特有的一种珍贵蜜种,是蜜蜂采集新西兰特有的一种红茶树——Manuka(Leptospermum scoparium)的花蜜酿造而成的。它区别于其他蜂蜜之处在于Manuka蜂蜜有强大而独特的抗菌活性。蜂蜜一般都具有抗菌活性,这是由蜂蜜本身的高渗透性、较强的酸度并且一般含有过氧化物造成的[ 1, 2 ]。而Manuka蜂蜜的抗菌活性则不依赖于过氧化物,因此被称为非过氧化抗菌活性(non-peroxide antibacterial activity, NPA)。1991年,Molan等[ 3 ]最早报道了这种抗菌活性的物质基础,并将其命名为Manuka独有因子(unique Manuka factor, UMF);由于并不清楚UMF的准确分子结构,采用微生物学方法对Manuka蜂蜜的NPA进行了检测。通过比较Manuka蜂蜜和一系列不同浓度的苯酚溶液对金黄色葡萄球菌的抑制程度,从而对Manuka蜂蜜的NPA进行评级,并标示为UMF5+、UMF10+、UMF15+等等(数字表示苯酚溶液的浓度)。目前,UMF已经被新西兰UMF蜂蜜协会(Unique Manuka Factor Honey Association, UMFHA)作为评价Manuka蜂蜜的质量指标,并要求被授权的蜂蜜生产商将其标注在产品包装上。
2008年,Mavric等[ 4 ]发现甲基乙二醛(methylglyoxal, MGO)可能是Manuka蜂蜜具有NPA的主要物质基础。同年,Adams等[ 5 ]也报道了相同的结论,并且发现Manuka蜂蜜中MGO的含量与NPA的相关性高达0.98。由于采用微生物方法检测NPA操作比较繁琐,结果变异较大,而且物质基础不明确,因此部分研究人员呼吁采用MGO的含量来代替UMF值用于标示Manuka蜂蜜的NPA。但是,也有部分研究人员认为还没有充分的证据证明MGO能完全代表Manuka蜂蜜的NPA,而且UMF更能体现新西兰Manuka植物的地域独特性和绿色环保理念。因此,目前市场上销售的Manuka蜂蜜的产品包装上会有UMF和MGO两种指标来标示Manuka蜂蜜的抗菌活性。
目前国内对Manuka蜂蜜的研究较少,且主要集中在其抗菌活性方面。朱威等[ 1 ]和玄红专等[ 2 ]综述了国外对Manuka蜂蜜抗菌活性的研究。孙艳萍等[ 6 ]研究了Manuka UMF25+、UMF10+以及其他7种蜂蜜对铜绿假单胞菌的体外抗菌活性,结论为9种蜂蜜在体外均可抑制铜绿假单胞菌,进口蜜更佳。对Manuka蜂蜜中相关物质的检测方法,仅见吕辰等[ 7 ]采用高效液相色谱-串联质谱法对多种蜂蜜中的5种双稠吡咯啶类生物碱进行了筛查,结果发现野百合碱、克氏千里光宁和倒千里光碱均未检出,而千里光菲啉和千里光宁在大多数蜂蜜中均能检出。
MGO属于二羰基化合物,国内报道的检测方法集中在大气环境监测领域。李阳等[ 8 ]建立了一种五氟化苯肼衍生化-热解吸-GC/MS方法对大气中23种羰基化合物进行了测定。牟翠翠等[ 9 ]和冯艳丽等[ 10 ]分别报道了2,4-二硝基苯肼衍生-高效液相色谱法用于测定大气中二羰基化合物。邹婷等[ 11 ]采用五氟苄基羟胺衍生与GC/MS联用的方法分析了大气中的单羰基化合物和多羰基化合物。对于蜂蜜中MGO的检测方法,目前国内尚无相关文献报道。对此,本实验室开发了高效液相色谱法对Manuka蜂蜜的MGO含量进行检测。
Agilent 1200液相色谱仪,配有自动脱气机、二元高压泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器及ChemStation数据处理软件(美国Agilent公司); PURELAB Option-Q15纯水仪(英国ELGA公司);电子天平(精确到 0.000 01 g,德国Sartorius公司;精确到0.01 g,瑞士METTLER TOLEDO公司)。
MGO对照品(40%水溶液)购自美国Sigma-Aldrich公司;邻苯二胺(o-phenylenediamine, OPD)购自阿拉丁化学试剂(上海)有限公司;甲醇(色谱纯,德国Merck公司);水为超纯水(18.2 M Ω \5cm); 0.22 μ m有机滤膜(德国Membrana公司)。
Manuka蜂蜜样品由新西兰UMF蜂蜜协会提供,中国蜂蜜样品由通标标准技术服务有限公司提供。
精密量取MGO对照品100 μ L,用水稀释并定容至10 mL,配成4 g/L 的标准储备液(4 ℃避光保存)。临用前用水将标准储备液逐级稀释为适当浓度的标准工作溶液。
精密称取邻苯二胺0.6 g,用水溶解并定容至100 mL,配成6 g/L的邻苯二胺水溶液。
称取1 g蜂蜜溶于10 mL水中,取1 mL该蜂蜜水溶液与1 mL邻苯二胺水溶液(6 g/L)混匀,在室温、避光条件下进行衍生化反应8 h以上,过0.22 μ m滤膜后进样分析。
色谱柱:Kromasil反相色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μ m);流动相:0.1%(v/v)乙酸水溶液(A)和甲醇(B);检测波长:318 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:30 ℃;进样量:10 μ L;保留时间:10.3 min。梯度洗脱程序:0～5 min, 30%B; 5～10 min, 30%B~90%B; 10～15 min, 90%B; 15～16 min, 90%B~30%B; 16～20 min, 30%B。
MGO的紫外吸收弱,需衍生化反应后再进行检测。MGO属于1,2-二羰基化合物,Weigel等[ 12 ]报道1,2-二羰基化合物能与邻苯二胺反应生成喹噁啉类化合物(见图1),在反相色谱柱上有较好的保留,且紫外吸收强。Mavric等[ 4 ]和Oelschlaegel等[ 13 ]建立的MGO检测方法中的衍生化条件均是在Weigel等[ 12 ]报道的基础上进行了修改,均为蜂蜜水溶液与邻苯二胺水溶液在室温、避光条件下反应8 h以上,只是蜂蜜样品和邻苯二胺溶液的浓度不同。本实验在室温、避光、反应时间(8 h以上)等衍生化条件不变的基础上,对衍生化试剂的浓度进行了优化。
将100 mg/L 的MGO标准溶液分别与1、2、4、6、8、10 g/L的邻苯二胺水溶液按体积比1 ∶ 1混合,进行衍生化反应。通过比较MGO衍生化产物的峰面积考察衍生化效率,结果如图2所示。
从图2中可以看出,邻苯二胺水溶液的浓度从1 g/L升高到6 g/L,衍生化产物的量逐渐上升;从6 g/L升高到10 g/L,衍生化产物的量开始趋于稳定,提示反应到达完全。因此,本实验选择6 g/L的邻苯二胺水溶液。
此外,由于蜂蜜直接稀释后的水溶液含糖量高,对色谱柱伤害较大,本实验对衍生化反应中蜂蜜水溶液的浓度也进行了调整。Mavric等[ 4 ]和Weigel等[ 12 ]报道的方法中蜂蜜水溶液的浓度分别为150和300 g/L,本实验中蜂蜜水溶液的浓度为100 g/L。并且与邻苯二胺溶液等体积混合,因此用于进样的溶液中只含有50 g/L的蜂蜜,能尽量避免高糖基质对色谱柱的损伤。在本实验的方法学验证和实际样品检测完成前后,色谱柱压力和MGO衍生化产物的保留时间均未见明显改变。
文献报道的MGO检测波长为312 nm[ 4, 12 ]或316 nm[ 13 ]。本实验中,通过光谱扫描发现,最佳的检测波长为318 nm。
MGO标准溶液与邻苯二胺水溶液进行衍生化反应后进行检测,以衍生化产物的峰面积Y对MGO的质量浓度X(mg/L)进行线性回归,在1～50 mg/L 范围内线性良好,相关系数为 0.999 9。检出限(S/N=3)为0.02 mg/L,定量限(S/N=10)为0.06 mg/L。HPLC图谱见图3,在MGO衍生化产物的保留时间附近并没有干扰峰存在。
Mavric等[ 4 ]、Weigel等[ 12 ]和Oelschlaegel等[ 13 ]报道的MGO检出限分别为0.2、0.2、5 mg/kg,本方法的检出限为0.02 mg/L,即0.4 mg/kg;差异的原因可能是所使用的蜂蜜水溶液浓度不同。Mavric等[ 4 ]和Weigel等[ 12 ]报道的检出限较低,但蜂蜜水溶液浓度较高(150和30 g/L),高糖分对色谱柱损伤较大;Oelschlaegel等[ 13 ]使用的蜂蜜水溶液浓度很低(15 g/L),但检出限太高。本实验条件中蜂蜜水溶液浓度介于两者之间,在保证灵敏度的前提下,能尽量减少高糖基质对色谱柱的损伤。而且,Manuka蜂蜜样品中MGO的含量一般较高,本实验的检出限能够满足实际样品的检测需要。
在Manuka蜂蜜样品中分别添加50.0、100.0、200.0 mg/kg 的MGO,每个添加水平重复5次,HPLC检测后计算精密度和回收率。3个添加水平下的RSD分别为1.26% 、0.89%和0.69% ,平均回收率分别为98.3% 、101.5%和99.5%(见表1)。结果表明,蜂蜜中的其他物质对MGO衍生化产物的检测准确度并没有影响。
在Manuka蜂蜜样品中分别添加50、100、200 mg/kg 的MGO,每个添加水平重复3次,在衍生化反应结束后0 h和24 h分别检测,考察衍生化产物的稳定性。结果如图4所示,衍生化产物在室温放置24 h后仍稳定,蜂蜜中的其他物质对MGO衍生化产物的稳定性没有影响。
利用本方法对61个Manuka蜂蜜样品中的MGO含量进行了检测。其中,UMF标示值为5+的蜂蜜样品共14个,MGO含量为(188.0±62.1) mg/kg; UMF标示值为10+的蜂蜜样品共16个,MGO含量为(324.6±90.4) mg/kg; UMF标示值为15+的蜂蜜样品共12个,MGO含量为(523.7±59.1) mg/kg; UMF标示值为20+的蜂蜜样品共13个,MGO含量为(726.1±76.9) mg/kg; UMF标示值为25+的蜂蜜样品共6个,MGO含量为 (1 035.0±75.8) mg/kg。该检测结果与Adams等[ 5 ]和Stephens等[ 14 ]的报道基本相符。
此外,利用本方法对中国不同产地的油菜蜜、荆条蜜、洋槐蜜、椴树蜜、葵花蜜、枣花蜜、荞麦蜜、棉花蜜共16个样品中的MGO含量进行了检测。结果显示,MGO含量均≤1 mg/kg。Stephens等[ 14 ]报道,新西兰Kanuka蜜、三叶草蜜、Rewarewa蜜和甘露蜜中MGO的含量均远低于Manuka蜜。Arena等[ 15 ]报道,意大利刺槐蜜、栗子蜜、柑橘蜜、桉树蜜、甘露蜜以及多花种混合蜂蜜中MGO的含量均≤3 mg/kg。以上研究结果均显示,MGO为Manuka蜂蜜中的特有成分。本文建立的MGO含量检测方法,可以为我国进口Manuka蜂蜜的质量评价提供参考。
建立了高效液相色谱法用于检测新西兰Manuka蜂蜜中的甲基乙二醛。该方法前处理简单,具有良好的灵敏度、回收率和重复性,可用于新西兰进口蜂蜜的质量控制,也适用于中国蜂蜜中甲基乙二醛的检测。
2014, Vol. 32 Issue (2): 189-193
PDF (865KB)
2014, Vol. 32 Issue (2): 189-193
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