PEGASUS 4D GC×GC-TOF/MS(美国LECO公司); LNG-T88台式快速离心浓缩干燥器、L-35低温冷阱(太仓市华美生化仪器厂); CO₂培养箱(美国Thermo公司); XW-80A漩涡混合器(上海青浦沪西仪器厂);倒置显微镜(日本Olympus公司); 96孔培养板(丹麦Nunc公司);全自动酶标分析仪(美国Thermo公司);流式细胞仪FACSCalibur (美国BD公司);

胎牛血清购于美国Gibco公司,DMEM/HIGH GLUCOSE DMEM培养基、PBS(磷酸盐)缓冲液、胰蛋白酶均购于赛默飞世尔生物化学制品有限公司(北京);四甲基偶氮唑盐(MTT)、碘化丙啶(PI)、RNaseA酶购于美国Sigma公司;二甲基亚砜(DMSO)购于国药集团化学试剂有限公司;甲醇(HPLC级,德国Merck公司);吡啶(分析纯)购于国药集团化学试剂有限公司;硅烷化试剂N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)(含1%三甲基氯硅烷(TMCS))购自上海安谱科学仪器有限公司;甲氧胺、2-氯苯丙氨酸均购自美国Sigma公司。

人乳腺癌细胞MCF-7购于中国科学院上海细胞库。

将MCF-7细胞培养于含10%的胎牛血清的DMEM培养液中,置于5%CO₂、37 ℃恒温箱中培养,取对数生长期细胞,加入0.25%胰蛋白酶消化后,配成含量为4×10⁴个细胞/mL,接种于96孔板,每孔接种100 μ L (4×10³个细胞/孔)。培养12 h后添加药物羽扇豆醇,使其质量浓度梯度为10、25、50、100、200 μ g/mL。每组5个复孔。加完药后置于5%CO₂培养箱中,于37 ℃恒温下继续培养。继续培养的时间梯度为24、48、72 h。然后加入20 μ L 5 mg/mL 的MTT溶液,再继续培养4 h,吸取上清液,每孔加入150 μ L DMSO,酶标仪测定570 nm处的吸光度(A),计算平均吸光度和抑制率。抑制率=(对照组的A值-实验组的A值)/(对照组A值-空白组A值)×100% 。

取一皿对数生长期的细胞,倒掉培养基,用生理盐水(0.9%NaCl水溶液)清洗3遍以去除培养基中复杂物质的影响。清洗完毕后,液氮猝灭以防止活细胞在环境变化下代谢发生变化,影响代谢物的考察。液氮猝灭后,每皿加入 1000 μ L甲醇-水(4 ∶ 1,v/v)溶液,用细胞刮刀刮下细胞置于样品瓶(玻璃)中,在样品瓶中加入少量氯仿(体积为前述甲醇-水溶液体积的1、5),使得细胞中的非极性成分溶在提取液中。然后加入10 μ L 0.3 mg/mL 的2-氯苯丙氨酸作为内标。涡漩,于4 ℃细胞超声破碎仪中破碎细胞(功率20%，破碎3 min,期间开5 s,关5 s),使代谢物质全部溶出,更加全面地提取代谢物。在4 ℃、4000 r/min 下离心15 min,去除大分子蛋白等物质。

取800 μ L上述上清液至GC进样瓶中,室温下真空干燥,用氮气对样品进行再次干燥后,加入80 μ L甲氧胺(15 mg/mL,溶剂为吡啶),混合1 min,于30 ℃下反应90 min后,加入80 μ L BSTFA和40 μ L正己烷,于70 ℃下反应90 min。

色谱柱为DB-5MS色谱柱(30 m×250 μ m×0.25 μ m,安捷伦科技有限公司);进样量为1 μ L。进样口温度为270 ℃,程序升温:起始温度为80 ℃,保持2 min,以10 ℃/min 升至180 ℃,以5 ℃/min 升至240 ℃,以5 ℃/min 升至290 ℃,保持9 min。接口温度为260 ℃;离子源温度为200 ℃。载气为氦气,载气流速为1 mL/min。电子能量70 eV,全扫描方式,扫描范围为m/z 30～600,以20张/s的速率采集TOF质谱图。

将GC-MS获得的所有原始质谱数据通过ChromaTOF软件(v3.30,Leco Co.,USA)转化成CDF格式,然后用ChromaTOF软件对数据进行峰识别、峰对齐、基线矫正、峰面积归一化预处理。导入SIMCA-P 11.5软件进行多维分析。在本实验中采用正交偏最小方差判别分析(OPLS-DA)模型区别各组代谢物差异。结合评价OPLS-DA模型质量的3个关键指标(R²X,概括X矩阵结实率;R²Ycum,反映模型的稳定性;Q²Ycum反映模型的预测性;其中R²Ycum和Q²Ycum越接近1说明模型的稳定性和预测性越好)及根据OPLS-DA模型得到的变量权重值(VIP,variable importance in the projection)找到潜在的代谢差异物(其VIP＞1)。实验中采用了t检验,以验证多维统计中得到的差异物是否具有显著差异^{[ 10 ]}。搜索数据库为NIST数据库。

为了进一步确认羽扇豆醇对MCF-7细胞的抑制作用,并且为全面阐述羽扇豆醇抑制MCF-7细胞的作用机理,本实验进行了细胞周期实验。

取一皿对数生长期的细胞,接种于6孔板中,使得每孔有3×10⁵个细胞。培养12 h后,分别加入25 μ g/mL 和50 μ g/mL羽扇豆醇,作用24 h。24 h后,加入胰蛋白酶消化细胞至细胞可以用移液管或枪头轻轻吹打下来时,轻轻吹散细胞，将其收集到离心管内。于约 1000 g离心力下离心3～5 min,沉淀细胞。小心吸除上清液,残留约50 μ L左右的培养液以避免吸走细胞。加入约1 mL预冷的PBS缓冲液,重悬细胞,并转移到1.5 mL离心管内。再次离心沉淀细胞,小心吸除上清液,残留约50 μ L左右的PBS缓冲液以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管以适当分散细胞以避免细胞成团。

细胞固定:加入1 mL预冷至4 ℃的70%(v/v)乙醇水溶液,轻轻吹打混匀。固定12 h后于 1000 g左右离心力下离心3～5 min,沉淀细胞。小心吸除上清液,残留约50 μ L左右的70%乙醇,以避免吸走细胞。加入约1 mL预冷的PBS缓冲液,重悬细胞。再次离心沉淀细胞,小心吸除上清液,轻轻弹击离心管以适当分散细胞,避免细胞成团。

染色后进行流式细胞检测和分析。

图1为5个浓度梯度的羽扇豆醇和3个作用时间对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。由图1可以明显地看出,在羽扇豆醇作用时间为24 h,作用浓度为10和25 μ g/mL 时,抑制率低于10% ,对MCF-7细胞没有明显的抑制作用。而当羽扇豆醇的浓度增加到50 μ g/mL 以上时,抑制率明显上升,均在70%以上,并且50、100和200 μ g/mL 羽扇豆醇的抑制作用没有明显的差异。当作用时间增加到48和72 h时,抑制作用更加明显,且高浓度的抑制效果好于低浓度。实验结果说明,羽扇豆醇对乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用不仅有时间依赖性,也具有浓度依赖性。与文献^{[ 11,12 ]}报道的羽扇豆醇对乳腺癌细胞有抑制作用的研究结果一致。

图 1 羽扇豆醇浓度及作用时间对MCF-7细胞增殖的影响 Fig. 1 Inhibition effects of lupeol with different concentrations and reaction times on the proliferation of MCF-7 cells

MTT实验结果显示,当羽扇豆醇的作用浓度高于25 μ g/mL 时,对MCF-7细胞的抑制率基本都在70%以上。由于细胞代谢组学使用的代谢物均为活细胞的代谢物，因此选择羽扇豆醇作用浓度和作用时间时不仅要考虑其对MCF-7细胞的抑制作用，还要考虑保持MCF-7细胞的低致死率，因此最终选择羽扇豆醇的作用浓度和作用时间分别为10 μ g/mL 和24 h。以前述甲醇-水混合液与三氯甲烷的5 ∶ 1(v/v)混合液为提取液,液液萃取提取细胞代谢物,经硅烷衍生化后利用GC-MS技术分析细胞代谢物。图2为其中典型的MCF-7细胞对照组和羽扇豆醇24 h作用组的GC-TOF/MS代谢物谱图,在S/N=10时,MCF-7细胞的代谢谱图的分子特征峰个数在500～600之间。

图 2MCF-7细胞对照组和10 μ g/mL羽扇豆醇作用24 h干预组代谢物的GC-TOF/MS基峰色谱图 Fig. 2 Typical GC-TOF/MS base peak chromatograms of metabolite profiles of control MCF-7 cells and 10 μ g/mL lupeol treated MCF-7 cells for 24 h

表 1 GC-TOF/MS分析人乳腺癌细胞MCF-7对照组与羽扇豆醇24 h作用组代谢差异物的鉴定结果 Table 1 List of identified differential metabolites of MCF-7 breast cancer cells in lupeol 24 h treatment group as measured by GC-TOF/MS Metabolite in cells Retention time/min VIP valuea) Fcb) p valuec) L-Alanine 7.5269 4.50 -1.25 1.27×10-3 L-Leucine 9.6111 3.45 1.59 7.49×10-3 DL-Isoleucine 9.8912 2.17 1.65 6.61×10-3 Glycine 10.0909 8.42 2.99 9.97×10-5 Butanedioic acid 12.2887 1.32 -1.27 0.04 L-Aspartic acid 12.7671 2.89 -3.37 1.55×10-6 L-Proline 12.8753 6.14 -3.41 1.48×10-3 L-Asparagine 13.7919 1.25 +∞ 4.29×10-6 Phosphoric acid 16.6373 4.49 6.29 5.55×10-5 D-Mannose 18.1765 3.18 -∞ 8.01×10-4 Ribitol 20.4451 1.32 -1.60 5.49×10-3 a)VIP values indicate the relative influence of each metabolite to the grouping; metabolites with higher VIP values are more influential. b) Fold change (Fc) is the ratio of the mean value for measured cell line samples obtained from lupeol treatment group to that from the control group. Fold change with a positive value indicates a relatively higher concentration present in lupeol treated group while a negative value means a relatively lower concentration as compared to the control group. c) p was calculated with Student’s t test. p＜0.05 means statistical significance.

表 1GC-TOF/MS分析人乳腺癌细胞MCF-7对照组与羽扇豆醇24 h作用组代谢差异物的鉴定结果 Table 1 List of identified differential metabolites of MCF-7 breast cancer cells in lupeol 24 h treatment group as measured by GC-TOF/MS

羽扇豆醇分别作用于MCF-7细胞6、12和24 h后,在上述优化的色谱条件下,分别对细胞样品进行分析,采集GC-TOF/MS数据并进行多维统计处理。

考虑到干扰因素的复杂性,为了消除非药物作用的影响,最大化组间分离,并寻找各组间的差异代谢物,利用有监督的OPLS-DA方法去除与样品分类无关的信息,对不同时间点样本的细胞代谢全谱进行分析。图3显示的是GC-TOF/MS细胞代谢物全谱数据的OPLS-DA得分图,该模型包含4个主成分,R²Ycum=0.988,Q²Ycum=0.964,说明模型的稳定性和预测率较高;且得分图显示对照组与给药组样本能明显区分,作用24 h的差异物区别最大。

图 3人乳腺癌细胞MCF-7代谢物的OPLS-DA分类图 Fig. 3OPLS-DA results of metabolites of MCF-7 breast cancer cells

VIP值是OPLS-DA有监督性分析方法中评价变量贡献的最常用方法,根据VIP＞1.0和p值＜0.05(t-test),通过NIST和标准库,对一些具有显著性差异的物质进行了初步的结构鉴别。本实验单独将差异性最大的对照组和羽扇豆醇24 h作用组两组进行OPLS-DA模型分析,获得了11种细胞代谢差异物(见表1)。

在肿瘤细胞代谢物中,丙氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、琥珀酸、甘露糖和核糖醇的含量下降。亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、天冬酰胺和磷酸的含量上升。琥珀酸的含量下降、磷酸的含量上升可能是羽扇豆醇破坏了MCF-7细胞能量代谢途径三羧酸循环造成的^{[ 13 ]}。亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、天冬酰胺均可以通过转氨作用脱掉 α -氨基生成有机酸类物质,再通过分解代谢作用而生成三羧酸循环的底物,作为能量的来源^{[ 14 ]}。也有可能是三羧酸循环受到了抑制。丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸的含量下降,可能是因为药物抑制了MCF-7细胞的氨基酸代谢^{[ 15 ]}。

基于代谢组学数据,为了进一步研究羽扇豆醇作用于MCF-7细胞后的作用机制,我们考察了羽扇豆醇对MCF-7细胞周期的影响。在这个实验中,羽扇豆醇作用时间为24 h,作用浓度为25 μ g/mL 和50 μ g/mL。结果见图4和表2。首先溶剂对于细胞几乎没有影响。在排除溶剂影响的前提下,羽扇豆醇主要将细胞抑制在细胞周期的G1期(synthesis)。羽扇豆醇作用浓度为25 μ g/mL 和50 μ g/mL 时,G1期细胞所占比例从50.92%分别增长到61.69%和63.61% 。同时S期的细胞数量显著下降,推测可能是由于羽扇豆醇抑制了MCF-7细胞中蛋白质和能量的合成,从而使得停留在G1期的细胞数量上升,S期的数量下降^{[ 16 ]}。

图 4 羽扇豆醇作用于MCF-7细胞24 h的细胞周期图 Fig. 1Distributions of cellular DNA in control MCF-7 cells and lupeol treated MCF-7 cells for 24 h, determined by FCM (flow cytometry) and the occupation of cell phase in all cells a. control; b. solvent (methanol/DMEM(1/60,v/v)); c. lupeol (25 μ g/mL); d. lupeol (50 μ g/mL).

G1期细胞内进行着一系列极为复杂的生物合成变化,如合成各种核糖核酸(RNA)及核蛋白体,这些物质的形成导致结构蛋白和酶蛋白的形成,为S期DNA的复制准备物质和能量^{[ 17 ]}。羽扇豆醇将细胞阻滞在G1期,所以推测羽扇豆醇的作用机理可能与能量和蛋白质的合成有关。

琥珀酸是三羧酸循环的中间代谢产物^{[ 18 ]},它的含量下降,磷酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、天冬酰胺的含量上升,均可能是因为三羧酸循环受到了抑制。三羧酸循环是机体获得能量的主要方式,是机体将糖或其他物质氧化而获得能量的最有效方式。在琥珀酸硫激酶(succinatethiokinase)的作用下,琥珀酰-CoA的硫酯键水解,释放的自由能用于合成三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate,GTP),再生成ATP,作为能量的来源。羽扇豆醇可能抑制了琥珀酸硫激酶的活性而使得底物磷酸化的反应受到抑制,磷酸的含量上升。而琥珀酸脱氢酶的活性受到抑制后,琥珀酸的含量下降。

综合分析,羽扇豆醇主要抑制了细胞中的能量代谢途径三羧酸循环,使得细胞在G1期不能够充分地准备S期进行DNA复制所需要的能量和物质,从而使得G1期细胞数量大量上升,S期细胞数量急剧下降。