黄酒也称为米酒,是我国历史最悠久的传统酿造酒,作为传统的保健养生佳品,其功用和价值早已得到广泛的认可和应用[ 1 ],国家也将其列入了“十一五”国家科技支撑计划的重点科研项目中;然而,对黄酒功效和活性物质的研究还停留在起步阶段,同时生产中发生的黄酒酸败问题不仅降低了出酒率,还常常造成生产加工上的困难[ 2 ]; 2004年以来,黄酒的相关研究显著增加,大大提高了对黄酒理化检测和发酵工艺的研究水平,但对于有机酸等活性物质仍不能满足多种物质的同时检测需求。因此,有必要建立一种快速、准确、同时检测多种有机酸的方法,从而深入对黄酒活性物质的研究,为黄酒的工艺控制和新品种研发提供支持。
黄酒中的有机酸包括琥珀酸、乳酸、醋酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、草酸等,其中部分来自原料或酵母代谢产生;部分由细菌污染产生,如丁酸等[ 2,3 ]。有机酸不仅构成黄酒的组成成分,同时又是风味成分的前体物质,在贮存过程中部分逐步形成芳香酯,增加浓厚感,降低甜度[ 4 ]。目前有机酸的分析方法主要有滴定法[ 5 ]、分光光度法[ 6 ]、酶法[ 7 ]、荧光法[ 8 ]、薄层色谱法[ 9 ]、毛细管电泳法[ 10 ]、分子印迹固相萃取法[ 11 ]、气相色谱法[ 12 ]、高效液相色谱法[ 13 ]等,国内外大多利用高效液相色谱法来检测有机酸[ 14 ]。吕旭聪等[ 15 ]建立了针对黄酒和葡萄酒中酒石酸、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸的反相高效液相色谱检测方法。近年发展起来的离子排斥色谱法(ion-exclusion chromatography,IEC)操作更为简便,样品前处理简单,极适合含水基体,对强亲水性和强挥发性的物质不会造成损失,几乎不受无机阴离子的干扰,对有机酸的分析具有特异性且检出限低[ 16 ]。目前,采用IEC测定黄酒中的有机酸尚未见报道。本文建立了IEC测定黄酒中有机酸的方法,同时对13种有机酸进行了定性定量分析,该方法操作较反相液相色谱法更为简便,灵敏度、准确性和重现性高,为黄酒发酵品质的监控、产品质量的提升提供了相关依据。
e2695型高效液相色谱仪及2998型光电二极管阵列检测器(美国Waters公司); Milli-Q超纯水系列(美国密理博公司); Christ RVC 2-18台式离心浓缩仪;梅特勒XP205DR电子天平(精确到0.01 mg)。Sep-pak C18 200 mg固相萃取小柱(美国Waters公司)。草酸、马来酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、乳酸、富马酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、蚁酸(美国Sigma公司);乙腈(德国默克公司);硫酸(优级纯)。取福建6家知名黄酒品牌的市售产品为样品,分别编号为1#~6#。
色谱柱:IC-Pak Ion Exclusion色谱柱(WAT010290,Waters公司) (300 mm×7.8 mm,7 μ m)及IC-Pak Ion Exclusion Insert保护柱芯(WAT020770,Waters公司)。柱温50 ℃。流动相:H2SO4溶液(A)与乙腈(B)的混合溶液(体积比为98 ∶ 2),线性梯度程序：0～40 min,流动相A的浓度由0.01 mol/L 上升到0.02 mol/L; 40～50 min,流动相A的浓度为0.01 mol/L;流速为0.5 mL/min。进样体积为10 μ L;检测波长为210 nm。
参照郭燕等[ 17 ]、Usenik等[ 18 ]的方法,样品以 10000 g离心10 min,取上清液,稀释至适当浓度后,用0.45 μ m滤膜过滤,备用。
分别精密称取适量草酸、马来酸、富马酸5 mg,柠檬酸、酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、乳酸50 mg,吸取1 g/L 乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸50 μ L,用超纯水溶解并定容至5 mL,混合标准溶液稀释成不同质量浓度的标准溶液,现配现用。
流动相成分的选择 参考文献[ 19,20 ]报道,选择蚁酸、硫酸的水溶液为流动相水相,以酸浓度0.01 mol/L、流速0.5 mL/min、柱温50 ℃、水相溶液(A)与乙腈(B)的混合溶液(体积比为98 ∶ 2)对有机酸混合标准溶液和样品进行了分析测定,结果表明:以蚁酸为流动相水相时,在30 min内未见出峰;以硫酸作流动相水相时,柠檬酸与酒石酸、琥珀酸与乳酸均未基线分离,其余9种有机酸基本得到基线分离。
硫酸浓度的选择 考察不同硫酸浓度(0.004、0.006、0.008、0.010、0.015、0.020 mol/L)条件下的分离情况。结果表明,硫酸浓度越低,柠檬酸与酒石酸、琥珀酸与乳酸的分离效果越差,当硫酸浓度为0.004 mol/L 时,柠檬酸与酒石酸重叠;随着硫酸浓度的增大,柠檬酸与酒石酸、琥珀酸与乳酸的分离效果越来越好,但马来酸与柠檬酸、富马酸与醋酸的分离度降低,因此选择了1.2节的梯度洗脱流动相。在此条件下，13种有机酸在30 min内均得到了很好的分离。
乙腈比例的选择 分别考察了不同体积比(98 ∶ 2、96 ∶ 4、94 ∶ 6)的H2SO4溶液与乙腈的混合溶液。结果表明,流动相中不同的乙腈比例对有机酸分离效果没有影响,随着乙腈比例的加大,柱压升高,因此选择体积比为98 ∶ 2。
固定1.2节其他条件不变,考察了不同流速(0.3、0.5、0.8、1 mL/min)对分离效果的影响。结果表明,流速越低,分离度越好,分析时间越长;当流速为0.3 mL/min 时,分析时间为50 min,综合考虑分离度和分析时间,选择流速为0.5 mL/min。
分别考察了30、40、45、50、55、60 ℃这6个柱温条件,结果表明,随着柱温升高,各种有机酸分离度增加,但温度超过55 ℃时,基线漂移严重,因此选择50 ℃柱温,13种有机酸达到定量要求。
13种有机酸的紫外最大吸收峰均在210 nm左右,硫酸溶液在210 nm处几乎没有紫外吸收,因此选择在210 nm处检测有机酸。
在优化的色谱条件下,对混合的标准样品进行检测,草酸、马来酸、富马酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸的质量浓度依次为0.005、0.005、0.500、0.500、0.500、0.030、0.500、0.500、0.005、1.000、1.000、1.000、1.000 g/L。从图1可以看出,13种有机酸能够较好的分离和检出。
将13种有机酸标准品配制成混合标准溶液进行HPLC分析,对各测得值进行相关系数分析和线性回归分析。结果(见表1)表明,除了草酸和抗坏血酸的相关系数分别为 0.9998 和 0.9997 外,其他11种有机酸的相关系数都为 0.9999,说明各种有机酸组分的峰面积和有机酸组分的质量浓度的线性相关性很好,在此条件下可以很好地测定有机酸的含量。当信噪比(S/N)为3时,测得13种有机酸的检出限,草酸、马来酸、醋酸、丙酸、异丁酸和丁酸的检出限为0.01 mg/L,富马酸的检出限为0.001 mg/L,其余6种有机酸的检出限为0.1 mg/L。
将混合标准溶液连续进样5次,根据所得峰面积考察精密度,草酸、马来酸、富马酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸的RSD分别为0.4% 、0.2% 、0.8% 、0.5% 、0.3% 、0.5% 、0.2% 、0.4% 、0.1% 、0.2% 、0.3% 、0.2% 、0.2% ,表明该方法的精密性良好。
取同一份混合均匀的黄酒样品5份,离心后用0.45 μ m滤膜过滤待测,连续进样,测得草酸、马来酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、乳酸、乙酸的平均质量浓度分别为 0.0051、0.0005、0.0559、0.2705、0.4662、0.1072、3.8887、4.5524、0.0004 g/L,RSD分别为0.2% 、1.9% 、0.7% 、0.4% 、2.0% 、1.3% 、2.1% 、0.2% 、2.1% ,表明该方法的重复性达到分析的要求。
采用加标回收法测定回收率。精确量取10 mL按1.3节方法处理的同一样品5份,加入混合标准溶液,用0.45 μ m滤膜过滤,平行测定5次,根据加标浓度和测定浓度计算各标准品的回收率及RSD。结果(见表2)表明,各有机酸的回收率为93.4% ～103.8% ,RSD为0.1% ～1.5% 。
对福建6家知名黄酒品牌的市售产品测定有机酸的组成和含量。黄酒中的组分很多,除有机酸外,还含有色素、氨基酸、多酚、糖等干扰组分,经固相萃取和高速离心预处理黄酒样品的色谱分离度差异不大,出于成本及操作简便的考虑,选择采用高速离心的方法处理样品。图2为3#样品的色谱图,黄酒样品中的有机酸含量测定结果见表3。表3表明,因各种酒的酿造工艺和原材料的不同，含有的有机酸的种类和含量也有所不同。6种黄酒样品中乳酸和琥珀酸的含量相对较高,其中乳酸主要由乳酸菌的同型发酵产生,琥珀酸主要由乳酸菌的异型发酵产生,草酸、马来酸和富马酸的含量相对较低,均不含丙酸、异丁酸和丁酸。
本实验建立了一种利用离子排斥色谱同时测定13种有机酸含量的方法,该方法简便、快速、准确,不仅适用于福建黄酒样品中有机酸的分析,也可用于其他酒中有机酸的分析。该方法成功地定性定量分析了黄酒中的主要有机酸,该方法对黄酒发酵过程中的有机酸动态研究及黄酒生产质量控制具有实用价值。
2014, Vol. 32 Issue (3): 304-308
PDF (838KB)
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