Acquity UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司); Thermo Scientific LTQ-Orbitrap XL组合式高分辨质谱仪(美国ThermoFisher公司); Himac CR22GII高速冷冻离心机(日本HITACHI公司); MS1Minishaker旋涡混合器(德国IKA公司)。KQ-400KDE型高功率数控超声波仪(昆山市超声仪器有限公司); Milli-Q超纯水处理系统(美国Millipore公司)。

甲酸(色谱纯,美国Fluka公司);甲醇、乙腈(色谱纯,美国Burdick & Jackson公司);超纯水(18.2 M Ω \5cm)由Mili-Q超纯水系统制得。可的松、倍氯米松、氟氢可的松醋酸酯、美雄酮、苯丙酸诺龙(纯度均≥95% ,美国Sigma Aldrich公司);泼尼松龙、泼尼松、氢化可的松、甲基泼尼松、地塞米松、倍他米松、甲基睾酮、孕酮、17 α -羟孕酮、美伦孕酮醋酸酯、甲地孕酮醋酸酯、诺龙、甲羟孕酮、丙酸诺龙、丙酸睾酮、群勃龙醋酸酯、睾酮、去氢睾酮、司坦唑醇(纯度均≥95% ,德国Dr. Ehrenstorfer公司)。

分别准确称取适量各激素标准品,用甲醇分别配制成有效浓度为100 mg/L 的标准储备液,置于-18 ℃下保存。使用时,根据需要逐级稀释成不同质量浓度的系列混合标准工作液。

色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μ m;美国Waters公司)。流动相A为水(含0.1%(v/v)甲酸),B为乙腈。梯度洗脱程序:0～6 min,B液从20%线性升至30% ; 6~6.1 min,B液从30%快速升至60% ； 6.1～10 min,B液从60%线性升至80% ; 12～12.1 min,B液从80%线性降至20%后,保持等度到15 min。

质量分析器:FT Orbitrap;可加热的电喷雾离子源(HESI);毛细管温度:350 ℃;鞘气压力:2.067×10⁵ Pa;辅助气流量:3.3 L/min;喷雾电压:3.0 kV;管状透镜电压:80 V;采用正离子全扫描模式;质量扫描范围:m/z 50～1000。

采用平行模式扫描,静电场轨道阱的高分辨扫描(R=30000);数据依赖扫描的二级质谱采用碰撞诱导解离(CID)产生碎片,归一化碰撞能量为35% 。24种激素UPLC-LTQ/Orbitrap MS分析参数见表1。

对化妆品中激素类物质的提取国内外研究较多,文献^{[ 7, 11, 12, 13 ]}均用甲醇直接提取。由于化妆品的基质较复杂,本实验分别考察了不同提取溶剂(甲醇、乙腈、乙酸乙酯、50%(v/v)甲醇水溶液、50%(v/v)乙腈水溶液、丙酮)和不同超声时间(5、10、15、20、25 min)对提取效果的影响,结果发现:以甲醇为提取溶剂,超声提取15 min的提取效果最好。

采用ACQUITY UPLC BEH C18柱对24种常见激素混合标准工作溶液的分离条件进行了优化。该色谱柱1.7 μ m粒度的填料能大大提升色谱柱的性能,获得更高的柱效^{[ 7 ]}。对流动相组成、流动相中甲酸浓度等条件进行了优化,结果表明,采用0.1%(v/v)甲酸水溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱更有利于24种激素的分离。在最佳分离条件下,各化合物尤其是同分异构体能够得到很好的基线分离,且峰形良好,基质干扰小。

根据文献^{[ 13 ]}报道,激素类化合物在ESI电离源下可产生[M+H]⁺和[M-H]^-准分子离子峰。本研究分别采用ESI⁺和ESI^-全扫描模式对24种激素化合物进行了检测,发现24种目标激素化合物只在ESI⁺模式条件下有响应,且均可出现[M+H]⁺峰。因此本研究采用正离子全扫描模式检测筛查化妆品中的24种激素,以保证各化合物均能达到最佳灵敏 度。在最佳质谱条件下,测得的各化合物准分子离子的精确质量数的精确度误差均小于3×10^-6(3 ppm)。24种激素提取离子色谱图见图1(离子提取窗口宽度为5 ppm)。

图1

Fig. 1

图1 24种激素化合物的提取离子色谱图 Fig.1 Extracted ion chromatograms of the 24 hormones

LTQ-Orbitrap XL线性离子阱/静电场轨道阱组合式质谱仪可以提供CID和高能碰撞解离(HCD)裂解模式,与CID相比,HCD能产生低质量端的离子碎片^{[ 20 ]}。本实验分别采集了24种激素在归一化碰撞能为35%时的CID二级碎片离子信息以及碰撞能分别为20% 、40% 、60%时的HCD二级碎片离子信息并进行了比较,发现:在CID模式下,碰撞能为35%时,除了司坦唑醇,其余23种激素均能产生较强的碎片离子;司坦唑醇在碰撞能为35%时,产生的碎片离子(m/z 311.24793)丰度较低(见图2a)。在HCD模式下,多数化合物在碰撞能为40%时都能产生较强的碎片离子,但个别化合物(如甲基睾酮、群勃龙)即使碰撞能很高时碎片离子丰度依然很低甚至没有碎片离子峰,如群勃龙在碰撞能为40%时,基峰仍为母离子m/z 271.16933(见图2b);而司坦唑醇在碰撞能为60%时仍没有碎片离子出现(图2c),当碰撞能为80%时,此时母离子仍为基峰,并产生了丰度较强的碎片离子m/z 81.04446(图2d)。HCD能有效改善CID裂解中的“三分之一”效应,但在本实验中,除个别化合物外,多数激素在m/z 50至母离子质荷比“三分之一”之间不存在碎片离子,因此本研究选择CID作为二级碰撞裂解模式。表2列出了CID模式下归一化碰撞能为35%时相对丰度大于40%的子离子信息,以及HCD模式下碎片离子相对丰度较高的归一化碰撞能下相对丰度大于40%的子离子信息。

对化妆品中激素化合物的检测,低分辨质谱方法由于质量精度低及干扰杂质的存在,可能会引起假阳性。而高分辨质谱能够提供化合物精确质量数,且可以通过保留时间和二级碎片离子的精确质量数进行确认,可以大大降低假阳性的出现率,显著提高方法的选择性。

以本研究建立的方法对进口及国产的香水类、霜膏类及精油类化妆品共50份进行了分析测定,在某品牌去皱化妆品中检出孕酮,以全扫描一级母离子作为定量离子,检出量为54.2 μ g/kg。图3a、3b及3c分别为该样品中孕酮的色谱图、一级母离子质谱图和二级CID碎片离子质谱图,图3d为孕酮标准溶液的二级CID碎片离子质谱图。图3a显示:样品中孕酮提取离子色谱的保留时间为7.85 min;图3b显示:实测孕酮的母离子为m/z 315.23196,其质量准确度误差为0.32 ppm,符合欧盟相关法规^{[ 21 ]}对高分辨质谱定性确认的质量准确度误差要求(＜5 ppm)。对比实测样品的二级质谱图(图3c)和标准溶液的二级质谱图(图3d),发现各碎片离子及离子相对丰度也基本一致,且各主要碎片离子的质量准确度误差也在5 ppm以内。参照欧盟2002/657/EC^{[ 22 ]}中对质谱定性的相关规定:高分辨质谱母离子可获得的识别点数是2.0,高分辨质谱子离子可获得的识别点数是2.5,而通过采用孕酮的一级母离子和二级CID碎片离子的精确质量数进行样品定性,可获得大于9个识别点的定性分数,远远超出了欧盟 2002/657/EC对禁用药物确认需要最少4个识别点的规定。因此,通过保留时间、精确质量数即可对激素化合物进行快速筛查。筛查出的阳性样品再经离子阱二级谱图扫描,通过二级特征碎片离子进行定性确证。总之,通过对样品进行全扫描分析,得到准分子离子峰精确质量数和特征碎片离子,即使在没有标准品的情况下也能对化妆品中激素类化合物进行筛查和确证。