色谱  2014, Vol. 32 Issue (5): 506-512   PDF (979KB)    
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李振宇
傅青
李奎永
梁图
金郁
超临界流体色谱对吴茱萸中吲哚类生物碱的快速分析
李振宇, 傅青, 李奎永, 梁图, 金郁     
华东理工大学药学院, 上海 200237
收稿日期：2013-12-30
基金项目：国家自然科学基金项目（21005028）；华东理工大学基本科研业务费探索研究基金（WY1214070）.
通讯作者：金郁Tel:(021)64250633,E-mail:jiny@ecust.edu.cn
摘要：建立了超临界流体色谱快速分析吴茱萸中吲哚类生物碱的方法。以标准品混合物和复杂样品为对象比较4种色谱柱的分离效果，进行色谱柱的筛选；考察了进样体积、改性剂、添加剂、温度和背压对保留行为的影响。结果表明，进样体积对峰形影响显著；添加剂对保留时间和色谱峰形影响有限；改变改性剂能使保留时间显著改变；降低温度，升高背压，保留时间减小。经过优化，确定采用Waters ACQUITY UPC2 BEH色谱柱，以甲醇为改性剂，在35 ℃柱温和2.07×107 Pa背压条件下，15 min内完成复杂样品的分析。同时采用超高效液相色谱完成复杂样品的快速分析。结果表明，超临界流体色谱可用于天然产物的高效快速分析，同时该方法与超高效液相色谱在分离选择上的差异有助于天然产物分析方法的拓展。
关键词： 超临界流体色谱     吲哚类生物碱     吴茱萸     快速分析     超高效液相色谱    
Fast analysis of indole alkaloids from Evodiae fructus by supercritical fluid chromatography
LI Zhenyu, FU Qing, LI Kuiyong, LIANG Tu, JIN Yu     
School of Pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China
Received: 2013-12-30
Abstract: A fast chromatographic separation of indole alkaloids from Evodiae fructus was developed by supercritical fluid chromatography (SFC). The initial screening of four stationary phases was investigated with a standard mixture of evodiamine and rutaecarpine, and a complex sample of indole alkaloids prepared from Evodiae fructus as probes. Later, the effects of chromatographic parameters on separation were studied including injection volume, organic modifier, additive, temperature and back pressure. The injection volume had significant impact on the peak shape. With the additives in the mobile phase, slight changes in peak shape and retention time were observed in separation. Variation in organic modifier led to dramatic change in chromatographic behavior. Both decreased temperature and increased back pressure shortened the retention time. Finally, a fast analytical method using SFC, on a Waters ACQUITY UPC2 BEH column, methanol as modifier, under 35 ℃ and 2.07×107 Pa, was developed to separate a complex sample of indole alkaloids in less than 15 min. Another rapid approach for the separation of a complex sample of indole alkaloids was developed by using ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC). As a result, SFC can be used in the separation of natural products, giving high performance, good resolution and fast analysis speed. The difference in selectivity with UHPLC can be used to the development of natural product separation.
Key words: supercritical fluid chromatography (SFC)     indole alkaloids     Evodiae fructus     fast analysis     ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC)    

超临界流体色谱(supercritical fluid chromatography,SFC)是以超临界流体为流动相,依靠流动相的溶剂化能力来进行分离分析的色谱过程。超临界流体具有介于气体和液体之间的性质,比气体溶解能力强,比液体扩散速度快、黏度低[ 1 ],既可用于分析GC不适用的高沸点样品,又具有比HPLC更快的分析速度。SFC主要采用二氧化碳为流动相,其超临界状态容易达到,具有化学稳定性、不易燃、低毒和低污染的特点,而且二氧化碳价格相比于有机溶剂低,因此SFC是一种低碳环保的分离分析技术。由于超临界二氧化碳的非极性性质,SFC对非极性化合物的分离效果很好,如类胡萝卜素、生育酚、甾醇类和脂类化合物等在SFC模式下都有很好的分离[ 1,2,3,4 ]。通过在超临界二氧化碳中加入有机溶剂作改性剂,Xu等[ 5 ]研究了黄酮苷类极性化合物的分析,Taylor等[ 6 ]研究了离子化合物的分析。但是,在分析及制备水平上,SFC应用最广泛的领域是手性分离[ 7 ]。生物碱类化合物常用的分析方法主要是液相色谱方法,采用SFC对生物碱进行的分析也有报道[ 1,2,3,4 ]。但是系统性考察SFC对生物碱分析的研究并不多见,特别是采用亚2 μ m的填料进行SFC的高效快速分离。

吲哚类生物碱是中药吴茱萸中主要的生物碱,主要包含有吴茱萸碱和吴茱萸次碱,其结构见图1所示。对于该类生物碱的分离,主要采用薄层色谱法(TLC)[ 8 ]、高效液相色谱法(HPLC)[ 9,10 ]和高速逆流色谱法(HSCCC)[ 11,12 ]。其中使用最广泛的是HPLC。然而采用这些方法,通常需要较长的分析时间才能得到满意的分离效果。因此需要发展一种具有较高柱效的快速分析吲哚类生物碱的方法。Yang等[ 13 ]曾经研究了SFC对吴茱萸碱和吴茱萸次碱的分离,但采用的是5 μ m的填料,而且未针对复杂样品分离及与超高效液相色谱(ultra-high performance liquid chromatography,UHPLC)保留行为差异性进行研究。

图1 吴茱萸碱和吴茱萸次碱的结构式 Fig.1 Structures of evodiamine and rutaecarpine

本文以标准品混合物(吴茱萸碱和吴茱萸次碱)和吲哚类生物碱复杂样品为研究对象,考察了不同色谱柱的保留性能和选择性,在此基础上考察了进样体积、添加剂、改性剂、温度和背压对SFC保留行为的影响,建立了SFC快速分析吲哚类生物碱的方法,并将该方法与UHPLC方法进行比较,结果表明SFC和UHPLC方法在该类化合物的分离选择上有一定区别,可用于天然产物分析方法的拓展。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Waters超高效超临界流体色谱仪(ACQUITY UPC2):配备二元溶剂输送泵、自动进样装置、柱管理单元、二极管阵列检测器及背压调节器(美国Waters公司); Waters超高效H-Class系统:配备四元溶剂管理单元、自动进样装置、柱管理单元和二极管阵列检测器。

二氧化碳(食品级,纯度≥99.9% )购自上海振兴盖斯公司;色谱纯甲醇、异丙醇和乙腈购自北京百灵威公司;色谱纯乙醇和三乙胺购自美国Tedia公司;色谱纯甲酸和甲酸铵购自Acros公司;实验用水来自Milli-Q水纯化系统(电阻率为18.2 M Ω ·cm)。

SFC色谱柱:ACQUITY UPC2 BEH (BEH1,50 mm×2.1 mm,1.7 μ m,杂化硅胶表面未键合化合物),ACQUITY UPC2 BEH 2-EP (BEH 2-EP,50 mm×2.1 mm,1.7 μ m,杂化硅胶表面键合2-乙基吡啶),ACQUITY UPC2 CSH Fluoro-Phenyl (CSH FP,50 mm×2.1 mm,1.7 μ m,杂化硅胶表面带电且键合氟苯基团)和ACQUITY UPC2 BEH (BEH2,100 mm×3.0 mm,1.7 μ m，填料与BEH1色谱柱相同)。UHPLC色谱柱:ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm,1.8 μ m,硅胶键合C18封尾处理)。色谱柱均购自美国Waters公司。

1.2 实验方法
1.2.1 样品制备和溶液配制

吲哚类生物碱复杂样品由实验室先前制备得到:吴茱萸药材用甲醇在60 ℃下回流1 h,真空旋蒸至少量,加入3倍体积的水，收集沉淀部分，得总生物碱部分,用甲醇重溶并过中性氧化铝柱进行除色,最后采用C18 SPE处理,收集70%甲醇洗脱部分即为吲哚类生物碱复杂样品;进一步通过二维液相色谱纯化得到两个吴茱萸生物碱的标准品(吴茱萸碱和吴茱萸次碱),两个化合物的结构已由NMR和MS确认[ 14 ]。

标准品混合物溶解于乙醇-正己烷(3/7,v/v)混合溶剂中,复杂样品溶于异丙醇中。

1.2.2 色谱条件

最终优化的SFC快速分析条件:BEH2色谱柱(100 mm×3.0 mm,1.7 μ m);流动相:超临界二氧化碳(A)和甲醇(B);梯度洗脱:0～1 min,2%B; 1～5 min,2%B～3%B; 5～10 min,3%B～6%B; 10～12.5 min,6%B～15%B; 12.5～15 min,15%B～25%B; 15～20 min,25%B。柱温:35 ℃;背压:2.07×107 Pa;流速:2 mL/min;进样体积:2 μ L;检测波长:254 nm。

UHPLC条件:ACQUITY HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μ m);流动相:水(A)和乙腈(B);梯度洗脱:0～10 min,35%B～40%B; 10～20 min,40%B～45%B; 20～22 min,45%B～75%B; 22～25 min,75%B;流速:0.4 mL/min;柱温:25 ℃;进样体积:0.5 μ L;检测波长:254 nm。

2 结果与讨论
2.1 色谱柱筛选

选择4根商品化的色谱柱,BEH(BEH1和BEH2)、BEH 2-EP和CSH FP。实验中通过调整梯度条件使得不同长度色谱柱的梯度洗脱斜率一致;通过改变体积流速保证不同直径色谱柱线速度相同。即:2.1 mm直径的色谱柱采用0.8 mL/min 的流速,3.0 mm直径的色谱柱采用1.6 mL/min 的流速。实验中用甲苯在1%(v/v)甲醇-二氧化碳条件下测定色谱柱的死时间:BEH1、BEH 2-EP和CSH FP在0.8 mL/min 时的死时间为0.22 min,BEH2在1.6 mL/min 时的死时间为0.33 min。

对于标准品混合物,先以等度洗脱考察在BEH1、BEH 2-EP和CSH FP上的分离情况(对应的色谱参数见表1所示)。考虑到BEH1和BEH2仅仅是因为长度和直径的差别,在等度分离中没有考察BEH2。

表1 吴茱萸碱和吴茱萸次碱在不同色谱柱上的色谱参数表 Table 1 Chromatographic properties of evodiamine and rutaecarpine on different columns

从表1中可以发现,BEH 2-EP比BEH1和CSH FP的保留能力强,可能是因为吡啶基团上的氮原子提供的氢键作用及吡啶基团和分析物之间产生的 π - π 作用[ 15 ]。结果表明,两个标准品在所考察的色谱柱上都能得到基线分离,色谱柱的选择性大小依次为:BEH1＞BEH 2-EP＞CSH FP。色谱图中均出现拖尾峰,原因可能是色谱柱填料上裸露的硅醇基带负电,与带正电的碱性化合物(如吴茱萸碱和吴茱萸次碱)产生相互作用。对于CSH FP而言,氟苯基的酸性则导致了更加严重的拖尾现象。综上所述,对于标准品混合物的分离,BEH1是优选的色谱柱。

图2 吲哚类生物碱复杂样品在不同色谱柱上的色谱图 Fig.2 Chromatograms of a complex sample of indole alkaloids on different columns For BEH1,CSH FP and BEH 2-EP columns: mobile phases,CO2 (A) and MeOH (B). Gradient elution program: 0-1 min,2%B; 1-5 min,2%B-3%B; 5-10 min,3%B-6%B; 10-12.5 min,6%B-15%B; 12.5-15 min,15%B-25%B; 15-20 min,25%B. Injection volume,0.8 μ L; flow rate,0.8 mL/min. For BEH2 column: mobile phases,CO2 (A) and methanol (B). Gradient elution program: 0-1 min,2%B; 1-5 min,2%B-2.5%B; 5-10 min,2.5%B-4%B; 10-12.5 min,4%B-8.5%B; 12.5-15 min,8.5%B-13.5%B; 15-20 min,13.5%B. Injection volume,2 μ L; flow rate,1.6 mL/min. Other conditions for all: temperature,40 ℃; back pressure,1.38×107 Pa.
Compounds: 1. rutaecarpine; 2. evodiamine.

采用复杂样品对色谱柱进行的考察如图2所示,结果表明,吲哚类生物碱在色谱柱上都有很好的保留。BEH1和BEH2对生物碱复杂样品的选择性较好,且BEH2的柱效更高。在BEH 2-EP上,生物碱复杂样品的选择性较低,能观察到的色谱峰个数也较少。与前面标准品混合物出现拖尾峰一样,生物碱复杂样品在色谱柱上也出现拖尾现象,而且CSH FP的拖尾现象最严重。

通过比较色谱柱对标准品混合物和复杂样品的分离情况,BEH1和BEH2均有很好的分离效果,两根色谱柱填料种类相同但型号不同,其中BEH2具有更高的柱效,因此确定BEH2色谱柱用于后续吲哚类生物碱复杂样品的快速分析。

2.2 色谱条件的优化
2.2.1 进样体积对分离的影响

以吴茱萸次碱为对象考察进样体积对SFC分析的影响。实验表明,在BEH1上,当进样体积超过1 μ L时,峰开始出现分叉现象。从图3a中可以发现,随着进样体积增大,色谱峰分叉的情况逐渐严重。而采用浓度更大的吴茱萸次碱样品(250 mg/L),进样体积依次为0.2、0.4、0.6和1 μ L。虽然进样体积不同,但进样质量与50 mg/L 浓度样品下进样体积分别为1、2、3和5 μ L相同。从图3b中可以发现,浓度为250 mg/L 的样品在小体积进样条件下,能保持很好的色谱峰形。结果表明,色谱峰形的分叉不是由于样品的质量过载,可能是由于样品中的有机溶剂与超临界流体混合时不匹配所造成。

图3 不同进样体积的吴茱萸次碱在BEH1柱上的色谱图 Fig.3 Chromatograms of rutaecarpine on BEH1 column under different injection volumes Conditions: a. 50 mg/L rutaecarpine. b. 250 mg/L rutaecarpine. Temperature,40 ℃; back pressure,1.38×107 Pa; MeOH/CO2 (1.7/98.3,v/v); flow rate,0.8 mL/min.

为了验证这点,通过提高改性剂组成和流速来考察色谱峰的改善程度。在增加改性剂比例和提高流速后,色谱峰形有一定的改善。无论是提高改性剂比例还是提高流速,都使超临界流体中的有机相增加,使得此时的超临界流体与样品中的有机溶剂更加容易混合,色谱峰的分叉得到改善。结果表明,色谱峰的分叉可能是由于样品溶剂与超临界流体混合时的不匹配造成的，这与文献[ 15 ]的结果相同。

进样体积减小有助于得到满意的色谱峰形。对于0.8 mL/min 的流速和1.7%的甲醇添加剂,1 μ L是允许的最大进样体积。如果想增加样品的进样体积,同时又要保持满意的峰形,需要提高流速或者增加改性剂比例。

2.2.2 添加剂对保留行为的影响

碱性化合物在SFC上通常峰形都较差,如拖尾、前伸、分叉和肩峰等[ 15 ],通常解决拖尾现象是在改性剂中加入添加剂(酸、碱或盐)[ 16 ]。实验中,以标准品混合物为研究对象,在BEH1色谱柱上考察了以4%甲醇为改性剂时,在改性剂中分别加入0.1%(v/v)甲酸、0.5%(v/v)甲酸、0.1%(v/v)三乙胺、0.5%(v/v)三乙胺、10 mmol/L 甲酸铵、20 mmol/L 甲酸铵、10 mmol/L 甲酸铵-1.2%(v/v)甲酸和20 mmol/L 甲酸铵-2.4%(v/v)甲酸等对色谱分离的影响。结果表明,添加剂对该类化合物色谱峰形的改善作用很小:例如,在未加入任何添加剂时吴茱萸碱和吴茱萸次碱的保留时间和对称因子分别为(0.709 min,1.21)和(1.577 min,1.09);在甲醇中加入0.5%甲酸后化合物的保留时间和对称因子变为(0.715 min,1.20)和(1.579 min,1.07);在甲醇中加入0.5%三乙胺后变为(0.688 min,1.17)和(1.684 min,1.04);加入20 mmol/L 甲酸铵后变为(0.679 min,1.18)和(1.559 min,1.06)。

在流动相中加入甲酸可以抑制硅胶中残余硅醇基的电离,但同时也会使分析物(吴茱萸碱和吴茱萸次碱)质子化后带正电,两种作用相互抵消,使得甲酸对化合物的保留时间和对称因子的改变很小。在流动相中加入碱(如三乙胺),可以竞争性抑制残余的硅醇基,使得碱性化合物的保留减弱,峰形对称性提高,但效果并不明显,保留时间和对称因子未有显著变化。在流动相中加入盐(如甲酸铵)的作用机制与碱相似,对峰形的改善作用有限。

对于BEH1而言,最好的峰形是在0.5%三乙胺为添加剂的情况下得到的。结果表明,添加剂对色谱峰形的改善有限,而且随着添加剂的加入,色谱柱需要更多的平衡时间。因此,在后续实验中使用纯的有机溶剂作为改性剂。

2.2.3 温度和背压对保留行为的影响

通常来讲,温度和背压是两个影响SFC分离结果的重要因素。实验中,以标准品混合物为对象,采用4%甲醇-二氧化碳等度洗脱的方法,在BEH1色谱柱上分别考察了温度和背压对分离结果的影响。

保持其他条件一致,研究了不同温度(35～50 ℃)下吴茱萸碱和吴茱萸次碱的保留行为(图4a)。从中可以发现,随着温度升高,化合物的保留增强。这是因为提高温度会降低超临界二氧化碳流体的密度,密度降低使得溶剂化和洗脱能力减弱,导致化合物的保留增强[ 17 ]。

图4 不同(a)温度、(b)背压和(c)改性剂条件下吴茱萸碱和吴茱萸次碱在BEH1柱上的色谱图 Fig.4 Chromatograms of evodiamine and rutaecarpine on BEH1 column under different (a) temperatures, (b) back pressures and (c) organic modifiers Conditions: a. MeOH/CO2 (4/96,v/v); back pressure,1.38×107 Pa. b. MeOH/CO2 (4/96,v/v); temperature,40 ℃. c. Organic modifier/CO2 (4/96,v/v); back pressure,1.38×107 Pa; temperature,40 ℃. Other conditions for a,b,c: flow rate,0.8 mL/min; injection volume,0.2 μ L.
Compounds: 1. rutaecarpine; 2. evodiamine.

保持其他条件一致,研究了不同背压(1.10×107 Pa、1.38×107 Pa、1.72×107 Pa、2.07×107 Pa)下吴茱萸碱和吴茱萸次碱的保留行为(图4b)。对于这两个化合物,随着背压的升高,保留时间随之降低。这是因为，随着背压的提高,超临界二氧化碳流体的密度会增加,密度的增加可以提高流动相的溶剂化能力和洗脱能力,从而造成了化合物保留的减弱[ 17 ]。

2.2.4 改性剂种类对保留行为的影响

SFC中使用的超临界二氧化碳流体是非极性溶剂,它对极性化合物的溶解性能和洗脱性能较弱,在色谱柱上表现为保留强和峰形差。在二氧化碳中加入有机溶剂(如甲醇、乙醇等),可以增强流动相对极性化合物的洗脱能力和溶解能力[ 18 ]。实验中考察了4种不同种类的改性剂(甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈)对色谱分离的影响。在这一系列考察中,有机改性剂的比例(4% )、温度(40 ℃)和背压(1.38×107 Pa)保持不变。通过实验得到了有机溶剂对该类化合物洗脱能力的强弱顺序:甲醇＞乙醇＞异丙醇＞乙腈,如图4c所示(由于乙腈条件下的出峰时间超过10 min,因此未给出相应的色谱图)。在对该类化合物的分离上,有机溶剂的洗脱能力强弱与极性的强弱相对应。从图中我们还可以发现,随着保留因子的增加,色谱柱对化合物的选择性提高。结果表明,对于SFC快速分析吴茱萸中吲哚类生物碱而言,甲醇是比较合适的改性剂。

2.3 快速分析

为了达到快速分析的目的,根据背压、温度和有机溶剂等对色谱分离影响的规律对分离条件进行了优化。除此以外,提高流速是另一个缩短分析时间的方法。基于先前实验中对色谱柱的筛选,实验选择BEH2色谱柱完成对吲哚类生物碱复杂样品的快速分析。将流速提高至2 mL/min,温度降至35 ℃,背压提高至2.07×107 Pa,此时系统的压力基本达到系统的极限压力4.14×107 Pa,在此条件下,以甲醇为改性剂,通过梯度洗脱,完成了对复杂样品的快速分析。该分析能在15 min内完成,如图5所示,同时具有满意的分离效果。

图5 复杂样品在SFC和UHPLC下的快速分析 Fig.5 Fast analysis of a complex sample of indole alkaloids under SFC and UHPLC conditions SFC: ACQUITY UPC2 BEH (100 mm×3.0 mm,1.7 μ m). Mobile phases: CO2 (A); methanol (B). Gradient elution program: 0-1 min,2%B; 1-5 min,2%B-3%B; 5-10 min,3%B-6%B; 10-12.5 min,6%B-15%B; 12.5-15 min,15%B-25%B; 15-20 min,25%B. Column temperature,35 ℃; back pressure,2.07×107 Pa; flow rate,2 mL/min; injection volume,2 μ L; detection wavelength,254 nm.
UHPLC: ACQUITY HSS T3 (100 mm×2.1 mm,1.8 μ m). Mobile phases: water (A); acetonitrile (B). Gradient elution program: 0-10 min,35%B-40%B; 10-20 min,40%B-45%B; 20-22 min,45%B-75%B; 22-25 min,75%B. Flow rate,0.4 mL/min; column temperature,25 ℃; injection volume,0.5 μ L; detection wavelength,254 nm.
Compounds: 1. rutaecarpine; 2. evodiamine.

近些年来,新发展的UHPLC技术是一种相对于HPLC的快速分析手段。本文亦采用UHPLC对复杂样品进行快速分析,并对两种分析方法进行了比较。在1.2.2节UHPLC条件下的色谱图见图5。在此条件下,系统压力达到5.52×107 Pa。同样地,我们也希望通过增加流速来提高分析速度。通过比较0.4 mL/min 和0.2 mL/min 时的分析结果,发现分离度和选择性有一定的下降,因此实验中并未尝试更高的流速(如0.6 mL/min),而是采用0.4 mL/min 的流速作为最终快速分析的流速。

实验中,SFC采用极性固定相,保留规律接近正相模式;而UHPLC采用C18固定相,以反相模式完成分离。两者对该类生物碱具有不同的分离选择性:如吴茱萸碱和吴茱萸次碱在两种分析方法中的出峰顺序不一样(图5中峰1和峰2)。这种选择性的不同,预示着这两种色谱方法在吲哚类生物碱的保留上具有一定的正交性。可用于后续分析方法的拓展。

3 结论

本文以吴茱萸中吲哚类生物碱样品为研究对象,对其在SFC下的保留进行了研究。实验中选择4种色谱柱BEH1、BEH2、BEH 2-EP、CSH FP用来探索吲哚类生物碱在SFC下的保留行为。以BEH 2-EP的选择性最差,CSH FP拖尾现象最严重,BEH1和BEH2结果较为理想。在此基础上,考察了进样体积、添加剂、改性剂、温度和背压对保留行为的影响。结果表明,小进样体积有利于好的色谱峰形;添加剂并不能显著改善色谱峰形;提高背压和降低温度有利于快速分析速度;甲醇相对于其他有机溶剂具有更强的洗脱能力。根据优化的条件,于15 min内完成了复杂样品的分析,并将此方法与UHPLC的分析结果进行比较,证实两者保留行为具有好的正交性。本文建立的方法适用于该类化合物的分析,同时表明SFC×LC的二维方法具有潜在的应用价值。

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